本发明属于生物
技术领域：
，特别涉及一种用于鉴别罗伦氏隐球酵母的专用引物、探针和基因芯片。
背景技术：
：乳制品是一种营养丰富，容易被消化和吸收的天然食品，随着人们生活水平的提高，已经成为生活中常见的食品。但是营养丰富的乳制品也是各种微生物青睐的温床，这导致乳制品的货架期非常有限，比如经巴氏灭菌的乳制品保质期一般不超过7天（巴氏鲜奶占全球液态奶70%的市场份额），近些年市场占有量越来越大的发酵酸奶，其保质期一般也只有21天。另一方面，国家《食品安全法》和《企业生产乳制品许可条件审查细则（2010版）》中明确要求企业必须对所生产、加工的乳制品进行出厂前微生物检验，包括5种指示菌和5种致病菌的检测。目前乳制品企业基本都是采用传统的平板培养法来检测微生物，这种方法的检测周期一般在3-4天左右，但是有些致病菌不能仅凭菌落形态来判定，需要配合其他生化反应试验做进一步鉴定，这无疑又增加了检测周期。因此，较长的检测周期（完成国标要求检测的10种微生物需要5-6天）和较短乳制品保质期（营养物质没有被破坏的巴氏灭菌乳制品的货架期只有7天）之间形成了矛盾，这一矛盾已成为制约乳制品企业发展的重要瓶颈，也成为制约市场终端能获取到营养最全面乳制品的重要因素。基因芯片是dna识别技术的一种体现，利用芯片高通量的优势，可以在一张芯片上同时对多个物种的多个dna条形码进行检测，不仅极大地提高了鉴定的准确性，而且还大大缩短了检测周期，即利用基因芯片可以在短时间内对多种微生物类型进行检测。为了解决乳制品中微生物检测所存在的上述问题，本发明研发了一种利用生物技术对罗伦氏隐球酵母进行检测的技术方案。技术实现要素：本发明的目的是提供一种罗伦氏隐球酵母特异性its分子标记，以建立一种快速、灵敏、特异性好的罗伦氏隐球酵母鉴别方法。本发明的另一个目的是提供所述鉴别方法使用的专用探针和引物。本发明采用基因克隆技术，并结合基因芯片技术，首先获得了罗伦氏隐球酵母itsdna片段中一段高度保守且特异性强的核酸序列，以作为特异性鉴别罗伦氏隐球酵母的分子标记；进而依据该分子标记设计并合成了一组特异性引物和核酸探针，建立了特异性鉴别罗伦氏隐球酵母的方法，并对所建立的方法进行了有效性评估试验。为实现上述发明目的，本发明是通过以下技术方案实现的：本发明所提供的罗伦氏隐球酵母its特异性分子标记的核苷酸序列如seqidno.1所示。本发明根据上述靶序列，依据引物与探针设计原则，设计了一对具有seqidno.3和seqidno.4所述核苷酸序列的、用于扩增所述its特异性分子标记的引物，以及一种具有seqidno.7所述核苷酸序列的、用于检测所述its特异性分子标记的核酸探针。更具体地，本发明是在引物1的5'端作为修饰位点，最终人工合成出具有下述核苷酸序列的引物和核酸探针：引物1:5’cy3—tccgtaggtgaacctgcggaagg—3’。引物2：5’—ccgcttattgatatgcttaagttc—3’。核苷探针：5’nh3—tttttttttttgatgcgagagccaagagatccgttgttg—3’。本发明还提供了一种用于检测罗伦氏隐球酵母的基因芯片。本发明所述的基因芯片采用本领域常规方法制备，并在所述基因芯片上固定有，在所述基因芯片上固定有seqidno.7所述的核酸探针。所述基因芯片采用的片基优选常规的醛基片基，以与所述氨基化的探针配合。本发明也提供了一种用于鉴别罗伦氏隐球酵母的装置，所述的装置为试剂盒，在所述试剂盒中至少包含有上述的罗伦氏隐球酵母检测用基因芯片或核酸探针，用于扩增本发明所述罗伦氏隐球酵母its特异性分子标记的专用引物和pcr扩增试剂，以及其他必要的相关试剂。最后，本发明提供了一种鉴别罗伦氏隐球酵母的方法，本发明所述方法是利用上述罗伦氏隐球酵母its特异性分子标记对罗伦氏隐球酵母进行鉴定，利用pcr方法获得的罗伦氏隐球酵母扩增产物中应包含有seqidno.1所示的核苷酸序列。具体地，本发明所述鉴别罗伦氏隐球酵母的方法包括：a)提取待检测样本的基因组总dna；b)以权利要求2所述引物对所述提取的总dna进行pcr扩增，获得pcr扩增产物；c)将所述pcr扩增产物与权利要求3所述的核酸探针进行原位杂交，以特异性鉴定出所述待检测样本中是否含有罗伦氏隐球酵母。进一步地，本发明所提供的罗伦氏隐球酵母rpbⅰ的核苷酸序列如seqidno.2所示。本发明根据上述靶序列，依据引物与探针设计原则，设计了一对具有seqidno.5和seqidno.6所述核苷酸序列，以及一种具有seqidno.8所述核苷酸序列的核酸探针。更具体地，本发明是在引物1的5'端作为修饰位点，最终人工合成出具有下述核苷酸序列的引物和核酸探针：引物1:5’cy3—gtcaagaagatcatcgagtgtg—3’。引物2：5’—gtattggagcaaatcgaaatg—3’。核苷探针：5’nh3—ttttttttttttgcttcaaacgatgttgcggcttgatctg—3’。本发明还提供了一种用于检测罗伦氏隐球酵母的基因芯片。本发明所述的基因芯片采用本领域常规方法制备，并在所述基因芯片上固定有上，在所述基因芯片上固定有seqidno.8所述的核酸探针。所述基因芯片采用的片基优选常规的醛基片基，以与所述氨基化的探针配合。最后，本发明提供了一种鉴别罗伦氏隐球酵母的方法，步骤为：a)提取待检测样本的基因组总dna；b)以权利要求5所述引物对所述提取的总dna进行pcr扩增，获得pcr扩增产物；c)将所述pcr扩增产物与权利要求6所述的核酸探针进行原位杂交，以特异性鉴定出所述待检测样本中是否含有罗伦氏隐球酵母。本发明上述方法中，所述基因组总dna提取、pcr扩增、原位杂交的方法也都是常规的。本发明pcr反应条件为：42℃保温30min，95℃预变性3min，重复95℃变性30sec，55℃复性30sec，72℃延伸30sec这变性—复性—延伸三个过程36个循环，最后在72℃保温5min。与现有技术相比，本发明具有以下优点：（1）准确性：基于dna和rna的检测，结果更可靠；（2）时效性：相比于传统培养法鉴定耗时3-4天，本发明只需要6小时即可完成对乳制品感染微生物的鉴定；（3）可靠性：每种污染微生物设计两个检测靶点，提供了检测的准确性。附图说明图1是罗伦氏隐球酵母鉴定结果图。图中：cl-its为罗伦氏隐球酵母的its检测位点，cl-rpbⅰ为罗伦氏隐球酵母的rpbⅰ基因检测位点；图中af-its为烟曲霉的its检测位点，af-abrⅱ为烟曲霉的abrⅱ基因检测位点；图中rg-its为粘红酵母的its检测位点，rg-tubb为粘红酵母的tubb基因检测位点。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步的说明，但应该理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本领域技术人员在本发明基础上对本发明作出的各种改动或修改，均应同样落于本发明的保护范围之内。下述实施例所用方法如无特殊说明，均按照常规方法和条件进行，或按照商品说明书选择。所用引物、核酸探针和所用序列测定工作均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成和完成。实施例1靶序列的确定根据报道的罗伦氏隐球酵母基因序列，选择以下序列作为检测的靶序列。罗伦氏隐球酵母its：tccgtaggtgaacctgcggaaggatcattaaagattgaccgaaaggtcttatctctatatccctcacctctgtgaactgtggacctccgggtctgtcttaacaaacatcagtgtaatgaacgtatatatcattaaacaaaacaaaactttcaacaacggatctcttggctctcgcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgaatctttgaacgcaccttgcgccttttggtattccgaaaggcatgcctgtttgagtgtcatgaaatctcaatccccccgggtttatgatctgggtcggacttggacatgggcgtctgccggtcacacggctcgcctcaaatgacttagtggatctctctgcatccgtgacagacgtaataagtttcgtcttgtcccttgctaatgagtctgctcataacctgccatcgcgcacttttagactctgacctcaaatcaggtaggactacccgctgaacttaagcatatcaataagcgg罗伦氏隐球酵母rpbⅰ：gtcaagaagatcatcgagtgtgtttgtgtcagctgcggaaagctcaagtgtgatatggtaagtctcaacaagggtctcactatgatcgtcactaaccgttcagcgggaccctgaagtgcgaaacatccgacgtcagatcaagccgcaacatcgtttgaagcgaatctgggccatcgcgtccaagaagcccatttgtgagacagattcgttagaagaggcagatcaaggggatgccacggcggaggatcagttccaacgggagcaaggtcagggtggcttgggcaaaggtcacgggggctgtggccagccacaaccatcgtggagaaaagaaggtctgaagctcatcggaatcttcaagcctacgggcgagaagggcgaggagtcgtccgaaccggaaaagcgaacgtttacgcccgccgacatcctcaacatcctgcaaaaaatccctgccgatgatctccaaatcatgggtctcaacgccgatttcgctcacccggcatggatgatcctgaccgttctccctgtcccgcctgccgctgtccgtccatccatctcggtcgacggaggcgccatgcgaagcgaggacgatctgacttacaaattggcccagatcctgaaagccagtgcgactgtacgacgattggaattagagggtgttccgcctactgttgtcaacgaacatttcgatttgctccaatacca经过同源性比对检索后，确定所选取的靶序列为特异性较高的dna序列，可以作为基因芯片检测的靶序列。实施例2引物与探针的设计和合成靶序列确定后，根据引物与探针设计原则，设计引物与探针如下：罗伦氏隐球酵母its：引物1:5’cy3—tccgtaggtgaacctgcggaagg—3’。引物2：5’—ccgcttattgatatgcttaagttc—3’。’nh3—tttttttttttgatgcgagagccaagagatccgttgttg—3’。罗伦氏隐球酵母rpbⅰ：引物1:5’cy3—gtcaagaagatcatcgagtgtg—3’。引物2：5’—gtattggagcaaatcgaaatg—3’。’nh3—ttttttttttttgcttcaaacgatgttgcggcttgatctg—3’。经过同源性比对检索后，确定所选取的靶序列为一段特异性较高的dna序列，可以作为基因芯片检测的靶序列。实施例3模板提取将2ml乳品置于-80℃速冻15min，取出后置于研磨中，在液氮环境下将其整体研磨成粉末状，用ctab方法提取粉末中的核酸。实施例4rt-pcr扩增及荧光标记用已经荧光标记的引物对所提取的模板进行rt-pcr扩增，采用天根生化科技有限公司的一步法rt-pcr进行扩增，扩增体系如下：成分用量2×rt-pcrmastermix25μl25×rt-pcrenzymemix2μl模板3μl引物1（cy3标记5’端）10pm1.0μl引物210pm0.8μlddh2o补充至50μlpcr反应条件为：42℃保温30min，95℃预变性3min，重复95℃变性30sec，55℃复性30sec，72℃延伸30sec这变性—复性—延伸三个过程36个循环，最后在72℃保温5min。实施例5芯片制备将氨基化的探针按一定浓度点在醛基片基上，室温放置过夜，先后用洗脱液ⅰ（5×ssc,1%sds）、洗脱液ⅱ(0.25×ssc,1%%sds)各洗脱5min，将没有固定上的探针洗脱掉，然后离心甩干备用。分子杂交：将pcr产物与制备好的芯片进行原位杂交，在42℃下保持40min，用洗脱液ⅰ（5×ssc,1%sds）、洗脱液ⅱ(0.25×ssc，1%sds)各洗脱5min。结果分析：用激光共聚焦扫描仪检测杂交结果，结果参如图1所示。序列表〈110〉山西维尔生物乳制品有限公司〈120〉一种鉴别罗伦氏隐球酵母的探针、引物和基因芯片〈160〉4〈170〉patentinversion3.2〈210〉1〈211〉534〈212〉dna〈213〉罗伦氏隐球酵母its〈400〉1tccgtaggtgaacctgcggaaggatcattaaagattgacc40gaaaggtcttatctctatatccctcacctctgtgaactgt80ggacctccgggtctgtcttaacaaacatcagtgtaatgaa120cgtatatatcattaaacaaaacaaaactttcaacaacgga160tctcttggctctcgcatcgatgaagaacgcagcgaaatgc200gataagtaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgaa240tctttgaacgcaccttgcgccttttggtattccgaaaggc280atgcctgtttgagtgtcatgaaatctcaatccccccgggt320ttatgatctgggtcggacttggacatgggcgtctgccggt360cacacggctcgcctcaaatgacttagtggatctctctgca400tccgtgacagacgtaataagtttcgtcttgtcccttgcta440atgagtctgctcataacctgccatcgcgcacttttagact480ctgacctcaaatcaggtaggactacccgctgaacttaagc520atatcaataagcgg534〈210〉2〈211〉546〈212〉dna〈213〉罗伦氏隐球酵母rpbⅰ〈400〉2gtcaagaagatcatcgagtgtgtttgtgtcagctgcggaa40agctcaagtgtgatatggtaagtctcaacaagggtctcac80tatgatcgtcactaaccgttcagcgggaccctgaagtgcg120aaacatccgacgtcagatcaagccgcaacatcgtttgaag160cgaatctgggccatcgcgtccaagaagcccatttgtgaga200cagattcgttagaagaggcagatcaaggggatgccacggc240ggaggatcagttccaacgggagcaaggtcagggtggcttg280ggcaaaggtcacgggggctgtggccagccacaaccatcgt320ggagaaaagaaggtctgaagctcatcggaatcttcaagcc360tacgggcgagaagggcgaggagtcgtccgaaccggaaaag400cgaacgtttacgcccgccgacatcctcaacatcctgcaaa440aaatccctgccgatgatctccaaatcatgggtctcaacgc480cgatttcgctcacccggcatggatgatcctgaccgttctc520cctgtcccgcctgccgctgtccgtccatccatctcggtcg560acggaggcgccatgcgaagcgaggacgatctgacttacaa600attggcccagatcctgaaagccagtgcgactgtacgacga640ttggaattagagggtgttccgcctactgttgtcaacgaac680atttcgatttgctccaatacca702〈210〉3〈211〉23〈212〉dna〈213〉正向引物〈400〉3tccgtaggtgaacctgcggaagg23〈210〉4〈211〉24〈212〉dna〈213〉反向引物〈400〉4ccgcttattgatatgcttaagttc24〈210〉5〈211〉22〈212〉dna〈213〉正向引物〈400〉5gtcaagaagatcatcgagtgtg22〈210〉6〈211〉21〈212〉dna〈213〉反向引物〈400〉6gtattggagcaaatcgaaatg21〈210〉7〈211〉39〈212〉dna〈213〉探针〈400〉7tttttttttttgatgcgagagccaagagatccgttgttg39〈210〉8〈211〉40〈212〉dna〈213〉探针〈400〉8ttttttttttttgcttcaaacgatgttgcggcttgatctg40sequencelisting〈110〉山西维尔生物乳制品有限公司〈120〉一种鉴别罗伦氏隐球酵母的探针、引物和基因芯片〈160〉4〈170〉patentinversion3.2〈210〉1〈211〉534〈212〉dna〈213〉罗伦氏隐球酵母its〈400〉1tccgtaggtgaacctgcggaaggatcattaaagattgacc40gaaaggtcttatctctatatccctcacctctgtgaactgt80ggacctccgggtctgtcttaacaaacatcagtgtaatgaa120cgtatatatcattaaacaaaacaaaactttcaacaacgga160tctcttggctctcgcatcgatgaagaacgcagcgaaatgc200gataagtaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgaa240tctttgaacgcaccttgcgccttttggtattccgaaaggc280atgcctgtttgagtgtcatgaaatctcaatccccccgggt320ttatgatctgggtcggacttggacatgggcgtctgccggt360cacacggctcgcctcaaatgacttagtggatctctctgca400tccgtgacagacgtaataagtttcgtcttgtcccttgcta440atgagtctgctcataacctgccatcgcgcacttttagact480ctgacctcaaatcaggtaggactacccgctgaacttaagc520atatcaataagcgg534〈210〉2〈211〉546〈212〉dna〈213〉罗伦氏隐球酵母rpbⅰ〈400〉2gtcaagaagatcatcgagtgtgtttgtgtcagctgcggaa40agctcaagtgtgatatggtaagtctcaacaagggtctcac80tatgatcgtcactaaccgttcagcgggaccctgaagtgcg120aaacatccgacgtcagatcaagccgcaacatcgtttgaag160cgaatctgggccatcgcgtccaagaagcccatttgtgaga200cagattcgttagaagaggcagatcaaggggatgccacggc240ggaggatcagttccaacgggagcaaggtcagggtggcttg280ggcaaaggtcacgggggctgtggccagccacaaccatcgt320ggagaaaagaaggtctgaagctcatcggaatcttcaagcc360tacgggcgagaagggcgaggagtcgtccgaaccggaaaag400cgaacgtttacgcccgccgacatcctcaacatcctgcaaa440aaatccctgccgatgatctccaaatcatgggtctcaacgc480cgatttcgctcacccggcatggatgatcctgaccgttctc520cctgtcccgcctgccgctgtccgtccatccatctcggtcg560acggaggcgccatgcgaagcgaggacgatctgacttacaa600attggcccagatcctgaaagccagtgcgactgtacgacga640ttggaattagagggtgttccgcctactgttgtcaacgaac680atttcgatttgctccaatacca702〈210〉3〈211〉23〈212〉dna〈213〉正向引物〈400〉3tccgtaggtgaacctgcggaagg23〈210〉4〈211〉24〈212〉dna〈213〉反向引物〈400〉4ccgcttattgatatgcttaagttc24〈210〉5〈211〉22〈212〉dna〈213〉正向引物〈400〉5gtcaagaagatcatcgagtgtg22〈210〉6〈211〉21〈212〉dna〈213〉反向引物〈400〉6gtattggagcaaatcgaaatg21〈210〉7〈211〉39〈212〉dna〈213〉探针〈400〉7tttttttttttgatgcgagagccaagagatccgttgttg39〈210〉8〈211〉40〈212〉dna〈213〉探针〈400〉8ttttttttttttgcttcaaacgatgttgcggcttgatctg40当前第1页12