本发明涉及分子基因分型领域，具体而言，涉及用于鹿的多态性微卫星dna分子标记及其用途。
背景技术：
梅花鹿(cervusnippon)主要分布于东亚，范围从西伯利亚到韩国、中国东部和越南；在日本等西太平洋岛屿也有分布。中国的梅花鹿主要分布在吉林省，而日本的梅花鹿主要分布于北海道。19世纪梅花鹿曾经被猎到几乎绝种，20世纪中开始立法保护，族群在1950年代到1980年代快速恢复。梅花鹿也被引进到澳大利亚、欧洲和美国。原先的目的是作为公园装饰用的动物，但现在许多变成野生。目前，分布于中国和日本的梅花鹿亚种已经被iucn红色名录列为极危或濒危等级，我国的梅花鹿同时也是国家一级保护动物。
近年来，利用分子标记对物种的种群结构、遗传多样性、迁移、杂交、基因流及分子系统地理等的研究已经成为保护遗传学和分子生态学领域的热点。主要是因为它是划分种群保护管理单元和进化显著性单元、确定保护等级及制定优先保护管理措施的基础。目前，在关于梅花鹿的分子育种研究中，所应用的多态性微卫星分子标记大多数是借鉴已发布的牛的微卫星引物，只有少部分是通过传统的克隆方法得到的，且这些微卫星位点的多态性都不高，不能满足对梅花鹿进行保护、研究、管理及分子育种的要求。
有鉴于此，特提出本发明。
技术实现要素：
本发明涉及微卫星dna分子标记和用于扩增微卫星dna分子标记的引物。本发明的微卫星dna分子标记可用于分子基因分型和/或遗传指纹法，
根据本发明的一方面，本发明涉及一种鉴定鹿科动物样品基因型的方法，包括：
1)、提取所述鹿科动物样品的dna；
2)、用选自下列的至少一个引物对扩增至少一种微卫星dna分子标记：seqidno:30和31；seqidno:32和33；seqidno:34和35；seqidno:36和37；seqidno:38和39；seqidno:40和41；seqidno:42和43；seqidno:44和45；seqidno:46和47；seqidno:48和49；seqidno:50和51；seqidno:52和53；seqidno:54和55；seqidno:56和57；seqidno:58和59；seqidno:60和61；seqidno:62和63；seqidno:64和65；seqidno:66和67；seqidno:68和69；seqidno:70和71；seqidno:72和73；seqidno:74和75；seqidno:76和77；seqidno:78和79；seqidno:80和81；seqidno:82和83；seqidno:84和85以及seqidno:86和87；
或扩增各引物对对应的扩增产物的片段或变体；及
3)、鉴定所述鹿科动物样品中的至少一种多态等位基因。
在一些实施方式中，所述鹿科动物样品包括鹿科动物的毛发、体液、骨骼、粪便。
在一些实施方式中，所述鹿科动物样品的dna的提取方法包括饱和苯酚-氯仿法、树脂提取法或磁珠提取法提取。
优选的，如上所述的方法，其中步骤2)包括用对应引物对扩增2种或更多微卫星dna分子标记；
更优选的，其中步骤2)包括用对应引物对扩增3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29种微卫星dna分子标记。
优选的，如上所述的方法，在步骤2)中，用所述引物对扩增至少一种微卫星dna分子标记时，退火温度为58℃～62℃，循环次数为33～37次；
更优选的，退火温度为60℃，循环次数为35次。
如上所述的方法在鹿科动物亲子鉴定中的应用。
如上所述的方法在鹿科动物种群中的相同或相关基因型鉴定中的应用。
如上所述的方法在鉴定鹿科动物等位基因多态性中的应用。
如上所述的方法在区分鹿科动物种群中突变体中的应用。
如上所述的方法在研究鹿科动物种群中的遗传多样性中的应用。
优选的，前述任一项所述的方法及应用，所述鹿科动物包括鹿亚科、麂亚科、獐亚科和美洲鹿亚科动物；
更优选的，所述鹿科动物包括花鹿属、鹿属、黇鹿属和麋鹿属动物；
更优选的，所述鹿科动物包括马鹿、白唇鹿、坡鹿、阿氏鹿、菲律宾黑麂、宿氏鹿、鬣鹿、沼鹿、水鹿以及梅花鹿；
更优选的，所述鹿科动物为梅花鹿。
用于扩增至少一种微卫星dna分子标记的分离的寡核苷酸引物，其包含选自下列的序列：seqidno:30～87所示核苷酸序列或其片段或变体。
寡核苷酸引物片段可包含部分seqidno:30～87，长度可以为5～25bp不等。
变体寡核苷酸引物不需要与seqidno:30～87共享任何重叠，但仅需能扩增本发明的微卫星dna分子标记。变体寡核苷酸引物也包括与侧接本发明的微卫星dna分子标记的区互补的任何寡核苷酸引物。如本领域技术人员明晰，用于pcr的变体寡核苷酸引物的3’端可不与ssr标志物或侧接ssr标志物的区具有任何错配，而5’端可具有错配。
本发明也提供试剂盒，其包含来自seqidno:30～87的至少一种寡核苷酸引物或其片段或变体。
优选的，在所述的试剂盒中，每对引物中至少有一条引物的5’端被荧光染料标记。
在一些实施方式中，所述荧光染料选自fam、fitc、sybrgreenⅰ、hex、vic、joe、tamra、tet、rox、cy3、cy5、texas-red、pet、ned、alexafluor、dylight和ftm。
分离的微卫星dna分子标记，其由如上所述的引物扩增；
优选的，所述分离的微卫星dna分子标记包含选自下列的序列：seqidno:1～29所示的核苷酸序列或其片段或变体。
根据seqidno:30～87的各引物对扩增来自梅花鹿的微卫星dna分子标记的等位基因。扩增产物大小有所不同，并表示微卫星dna分子标记的不同多态等位基因。因此，本发明涉及包含由本发明的引物对扩增的序列的微卫星dna分子标记。
在29个座位中的每一个的微卫星dna分子标记的不同多态等位基因具有不同序列。本发明包括29种微卫星dna分子标记中的每一种的不同多态等位基因的序列。例如，29个序列中的每一个表示以下由寡核苷酸引物seqidno:30～87扩增的10种ssr标志物的特定等位基因。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供的引物对能在鹿科动物的样本中扩增出条带清晰、多态性高的微卫星dna条带，使得本发明提供的引物能够应用于梅花鹿的种群遗传结构和遗传变异水平等方面的研究，采用微卫星dna分子标记可以对梅花鹿的种群遗传学研究提供较为丰富的遗传基础信息。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购买获得的常规产品。
1、梅花鹿的基因组提取与检测。
取梅花鹿血液300ul，用biotake血液提取试剂盒提取梅花鹿基因组，用1％琼脂糖凝胶电泳检测dna的完整性，酶标仪测定dna浓度和纯度，-20℃储存备用。
2、简化基因组测序获得梅花鹿微卫星序列，并设计引物。
取梅花鹿血液300ul，提取基因组后，以牛基因组作为参考，选择haeiii+hpy166ii进行酶切，酶切片段长度在414-444bp之间，检索全部非冗余基因数据库中的ssr位点，根据ssrs侧冀序列设计pcr引物。
3、对获得的梅花鹿微卫星序列进行分析，高效筛选多态性微卫星位点。
通过阅读大量文献后，从上述获得的微卫星序列中按以下原则筛选多态性微卫星位点
(1)挑选无间差碱基的、重复序列长的微卫星位点100个(单核苷酸重复的30个重复以上，二核苷酸重复的28个重复以上，三、四、五、六核苷酸重复的10个以上重复)。但是经过本次试验结果分析发现：在梅花鹿上，单核苷酸重复的微卫星几乎没有多态性，二核苷酸重复的微卫星多态性最高，且重复数越多，多态性越高。
(2)挑选at含量高的微卫星序列。
(3)挑选出基本重复单位为(cng)n以及(gaa)n类型的微卫星位点。
4、对筛选出来的微卫星位点进行多态性验证，包括聚丙烯酰胺凝胶电泳和毛细管电泳分析。
将筛选出来的100个微卫星位点的引物以梅花鹿基因组为模板进行pcr扩增，pcr扩增体系和条件见表1和表2。
表格1pcr反应体系
表格2pcr反应程序
然后进行琼脂糖电泳检测，其中70对引物可以扩增出清晰单一的目的条带。
(1)聚丙烯酰胺凝胶电泳分析
随机选取8个梅花鹿的血样作为模板，用聚丙烯酰胺凝胶电泳测试这70个微卫星位点在上述8个模板上的多态性，最后发现41个位点有明显的多态性。
(2)毛细管电泳分析
从上述41个多态性微卫星位点中挑选出30个条带清晰且无杂带的位点，将其引物合成5’端带荧光标记的引物，然后用96个梅花鹿的dna作为模板进行pcr扩增，最后用毛细管电泳进行检测。为了节省成本，我们将目的条带大小不同的引物带不同的荧光标记，然后混合一起上样。结果中有一对引物杂带太多，无法对其进行基因判型故舍弃。29对多态性微卫星引物见表3；其荧光混合信息见表4。
表格3微卫星位点及其引物信息
表格4微卫星标记分组情况
5、对获得的多态性微卫星位点的多态性进行进一步分析
根据所得到的电泳图，用genemapperv4.0软件对微卫星基因型进行判定，然后用cervus2.0软件对上述30个多态性微卫星位点的期望杂合度(he)、等位基因数(k)、等位基因频率(p)、和多态信息含量(pic)等指标进行分析。其结果整理见表5和表6.
表格5等位基因数杂合度多态信息含量
locus：位点；k:等位基因数；n：检测的数量；hets:异型合子；homs:同源基因；h(0):观测杂合度；h(e):期望杂合度；pic:多态信息含量；excl(1)：父母一方已知时的父权排除率；excl(2)：父母双方已知时的父权排除率；nullfreq：无效基因频率。
表格6微卫星标记的等位基因及其等位基因频率
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。
sequencelisting
<110>中国农业科学院特产研究所
<120>用于鹿的多态性微卫星dna分子标记及其用途
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<170>patentinversion3.3
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aactcctagttcttaggagacacgtcacaacatgtctggatcatgtgagagattgatgac120
tgtctcagaagtcagtgattgaaaattgggaatttaattaaaatattagcactgttttct180
atacttgcgctacacacacacacccatacatacatacatacatacatacatacatacata240
catacatgttctgcaaacctctgtgaaggatcttatgcatgggcggagcctgagtacttt300
gtatatacagtccagcacacagtaggaacacaaggagtctcaatataaagggcagagctc360
ctcgaaggggggacatttcacagatgggtaatttggggtcctaagggtttgttctgggag420
cggtgggtcaaggcggattagg442
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<400>21
cccagagtctgaaatcacgatgtcggtagggctgtgttccctctgggatttctggggaga60
attcctccttgtctcttctagccttgacggctgctggtgttccttggtcatattgctcca120
aactctgcctctgtcttcatatcactttaccgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtg180
tgtgtgtgtgatcttcctctttcctaataaggcgcttgtgagttattatcaatctaccac240
acctggggttatatataaataactgatgtaatatggcagccgtagatgtgtgccacgtgg300
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cgtggttcgaacttcagactcaaagcccacaatccagcaaggtctcctgaagatacgctt180
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aaatccttttcttaaacaaagagagaaatcctgaaaacaaagtggaaaggaaaagcattc360
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ctagaaaaactctctctataggtatgtgtgtgtgagtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtg120
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gg422
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