一种现场筛查产毒铜绿假单胞杆菌的多重检测方法与流程

本发明涉及一种现场筛查产毒铜绿假单胞杆菌的多重检测方法，属于分子生物学领域。

背景技术：

铜绿假单胞菌是一种重要的机会致病菌，广泛的分布于土壤、水体、动植物表面上。铜绿假单胞菌可感染烧伤或免疫力低下的患者，在囊性纤维化患者中能够造成更严重的伤害甚至死亡。铜绿假单胞菌可以分泌一些致病因子，这些致病因子会与宿主体内的特定位点相结合作用，从而使之具备强致病性。其中，主要的致病因子有ⅲ型分泌系统t3ss，铜绿假单胞菌可以通过其t3ss系统将毒力蛋白直接注入到宿主细胞中，干扰宿主细胞的信号传导，改变宿主细胞的功能，创造有利于细菌生存和散布的环境。铜绿假单胞菌的t3ss系统主要分泌四种毒素exou,exos,exot,exoy，其中exot和exoy对菌毒性的作用很小，而exou、exos最具破坏性并引起广泛关注，而且一般每株铜绿假单胞菌只携带exou、exos中的一种。另外，ecfx基因可作为铜绿假单胞菌的扩增内标基因。铜绿假单胞菌菌株在不同的环境下呈现了高度的基因多样化，并且研究证实有一些铜绿假单胞菌菌株缺乏一些毒素基因，因此非常有必要检测这些毒素基因的存在性，用以在突发情况或例行监测中判断铜绿假单胞菌菌株的毒力。

常规检测采用传统培养方法，且每个致病菌需应用独立的检测方法单独进行检测，工作量大，检测周期长，且受到检测人员专业、经验等多种因素限制，容易出现误判。随着分子生物学方法在食品微生物检测中的逐步应用，致病菌的检测效率也逐步提升。

lamp方法是一种新型的恒温核酸扩增技术，该技术主要利用4条不同的特异性引物识别靶dna上6个特定区域，并利用一种具有链置换活性的bstdna聚合酶，在恒温条件下快速扩增核酸，保证了扩增的高特异性和高效率。鉴于lamp技术有众多优势，现已被逐渐应用于病原微生物的检测。如分支杆菌属、阪崎肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等。

目前已有的lamp检测方法通常只能在一个系统中针对单一种致病菌进行检测，在需要快速筛查多个致病菌或同一致病菌的多个基因时，需分别对其进行检测，仍有较大工作量。多重恒温核酸检测技术能在同一反应体系中，同一反应条件下，实现多个目的菌的快速筛查。另外，由于lamp扩增产物在普通电泳呈现梯状条带，因此多重lamp产物无法通过普通电泳区别分子量来实现对目标产物的识别，而在以往的报道中往往采用较为繁琐的酶切或者测序的方式对扩增产物进行鉴别，对扩增产物的分析和鉴别仍有待提高。

胶体金试纸条检测的是核酸片段，通常以条状纤维层析材料为固相，通过毛细作用使样品溶液在试纸条上迁移，并同时使样品中的待测物与试纸条上针对待测物的受体发生高特异性高亲和性反应，层析过程中免疫复合物被富集或截留在层析材料的一定区域，通过直接运用可目测的标记物(胶体金)而得到直观的显色实验现象。这种检测技术操作简单快速，检测结果清楚，易于判断，且无须仪器或只需简单仪器，因此，非常适用于各级医院、家庭或个人在诊断、保健、体检等方面的运用。

本发明将多重lamp与胶体金试纸条结合起来，实现了对铜绿假单胞杆菌内标基因和两种毒素基因的多重检测，具有快速、易操作的特点，能够满足现场和条件较差的基层实验室进行快速检测的需求。

技术实现要素：

本发明公开了一种现场筛查产毒铜绿假单胞杆菌的多重检测方法，可以方便、快捷地对自然环境中、医院样品、食品中的铜绿假单胞杆菌及其毒素基因进行检测，在50min内读取半定量检测结果。

本发明采用的技术方案是：采用多重lamp技术与胶体金试纸条结合检测铜绿假单胞杆菌及其毒素，该检测方法包括lamp引物设计，多重lamp体系建立，检测多重lamp产物的多重胶体金试纸条。

本发明的适用范围：各领域铜绿假单胞杆菌及其毒素的快速检测。

本发明的操作方法：将多重lamp反应后的pcr管扎破，将液体滴加在水平放置的胶体金试纸条的样品垫上，5min之内读取半定量检测结果。

本发明的结果判定：待显色之后观察胶体金试纸条上的显色条带，在质控线显色的情况下：检测线t3t2和t1均不显色，说明无铜绿假单胞杆菌存在于样品中；检测线t3显色，t2和t1不显色，说明样品中存在不分泌毒素exou和exos基因的铜绿假单胞杆菌；检测线t3和t2显色，t1不显色，说明样品中存在分泌毒素exos但不分泌exou基因的铜绿假单胞杆菌；检测线t3和t1显色，t2不显色，说明样品中存在分泌毒素exou但不分泌exos基因的铜绿假单胞杆菌；检测线t3、t2和t1均显色，说明样品中可能存在同时分泌毒素exou及exos基因的铜绿假单胞杆菌也可能同时存在只分泌毒素exos和只分泌毒素exou的铜绿假单胞杆菌。在质控线不显色的情况下，需要重新选择一个胶体金试纸条进行检测。

本发明的特点：

(1)本发明是根据已公开的铜绿假单胞杆菌的内标基因ecfx序列，铜绿假单胞杆菌的毒素基因exou序列，铜绿假单胞杆菌的毒素基因exos序列，分析设计得到本发明的检测引物序列如下：

ecfx-f3：ggatgagcgcttccgtg；

ecfx-b3：aagttgcgggcgatctg；

ecfx-fip：cttgcgcagaagcgcagcgttccgtctcgcatgccta，5'端标记biotin；

ecfx-bip：gccgacctcgcccaggatagctcgaccgattgccg，5'端标记fitc；

exos-f3：ggcatccacagtgacgc；

exos-b3：gtgccacggaaagtcttca；

exos-fip：cagagcgcgattcaggtccggaagtgatggcgcttggtct，5'端标记biotin；

exos-bip：caggggcaggagctggatgccgctcttctcgaaggcc，5'端标记hex；

exou-f3：tcgctgaaaaagggcttgg；

exou-b3：caatctgctggcgatggc；

exou-fip：ccgcgaatctatgcgtgggagcaacaagatcggcggctt，5'端标记biotin；

exou-bip：cctagaacgcctattgcgcgagcgtgcaacctctggatg，5'端标记digoxin；引物具有良好特异性。

(2)利用本发明的铜绿假单胞杆菌的快速检测引物组，能在同一反应体系中和同一反应温度条件下，实现同时对铜绿假单胞杆菌及其毒素的同步快速扩增，从而克服现有技术只能在一个系统中针对某一种致病菌进行检测、而不能同时对同一系统中是否同时存在多种致病菌或是否存在同一种菌的多种毒素基因进行判断的缺陷，大大提高检测效率。

(3)本发明利用多重胶体金试纸条对多重反应产物进行分析，可准确判定样品dna提取液中是含有铜绿假单胞杆菌及其毒素，克服了现有多重lamp反应只能通过较为繁琐的测序或酶切来判定阳性扩增产物所含目的扩增片段种类。

(4)在本发明的快速检测方法中，多重lamp扩增反应可在恒定温度下完成，因此对温控的仪器设备要求不高，水浴器或板式加热器均可满足要求。

(5)本发明的快速检测方法灵敏度高，铜绿假单胞杆菌的阳性扩增检测限为20cfu/ml。

(7)与常规的平板培养法相比，本发明的快速检测方法可大大缩短检测时间，减少检测环节，从而降低因检测环节过多或人员技术水平和经验的差异造成的误判的几率，使检测结果更为准确可靠，并可为食品安全突发事件的处置提供重要的技术支持。

附图说明

图1为本发明中涉及的胶体金试纸条的俯视结构示意图；1为样品垫，2为金标垫，3为检测 线t1，4为检测线t2，5为检测线t3，6为质控线，7为硝酸纤维素膜，8为pvc底板，9为吸水垫。

图2为本发明中涉及的胶体金试纸条的的侧视结构示意图；10为金标抗体，11为抗fitc抗体，12为抗hex抗体，13为抗digoxin抗体，14为羊抗鼠二抗，15为多重lamp产物。

图3为本发明的检测结果图。

具体实施方式

制备实施例

实施例1

本实施例的具体检测方法为：

1.样品dna的提取

1.1将铜绿假单胞杆菌标准菌株分别接种于营养肉汤，36°с±1°с培养18小时。

1.2应用细菌基因组dna提取试剂盒分别提取以上培养产物dna，作为检测用模板。

1.3将二组dna提取液按等体积比例混合，作为混合目标菌检测模板。

2.多重lamp反应

2.1分别人工合成用于铜绿假单胞杆菌内标基因及两个毒素基因的带标记的引物组。

2.2多重lamp反应体系

反应体系的组成均包括：(1)引物混合液：外引物f3和b3各0.3μmol/l，内引物fip和bip各2.3μmol/l；(2)反应混合液：3mol/l甜菜碱，0.3mmol/lmgso4，1xthermopolbuffer，2.3mmol/ldntps，8ubstdna聚合酶；(3)2μldna模版；加灭菌双蒸馏水补充体系至25μl。

2.3lamp反应条件

应用pcr仪，反应条件为在60°с下反应40min。

3.胶体金试纸条的制备

3.1制备硝酸纤维素膜：将宽30mm的硝酸纤维素膜置于biodot划膜机的操作平台上；将经纯化浓度为1.0mg/ml的抗fitc抗体、抗hex抗体、抗digoxin抗体、羊抗鼠二抗依次装入biodot划膜机喷头，分别喷涂在硝酸纤维素膜上，三条检测线之间及三条检测线和质控线之间的距离为4.5mm，将所述硝酸纤维素膜于37°с烘干处理过夜后，在室温干燥的环境下保存。

3.2制备金标垫：胶体金溶液与生物素抗体混合后用混匀仪上下混匀60min后加入20ul/ml10％bsa用混匀仪上下混匀60min。将所得混合溶液于12000rpm离心20min，弃掉 上清液得到沉淀即为用胶体金标记过的生物素抗体，把所述的用胶体金标记过的生物素抗体喷在玻璃纤维膜上，在室温干燥的环境下保存。

3.3组装试纸条：依次将形成有三条检测线和一条质控线的硝酸纤维素膜、喷涂好用胶体金标记过的生物素抗体的玻璃纤维、样品垫、吸水垫粘到pvc底板上，并小心抹平。用切条机切成3.8mm宽的试纸，将切好的试纸放入装有干燥剂的包装袋内。

4.利用胶体金试纸条检测多重lamp产物

4.1将装有lamp反应产物的pcr管扎破，将液体滴加在水平放置的胶体金试纸条的样品垫上，5min之内读取检测结果。

4.2待显色之后观察胶体金试纸条上的显色条带，在质控线显色的情况下：检测线t3、t2和t1均不显色，说明无铜绿假单胞杆菌存在于样品中；检测线t3显色，t2和t1不显色，说明样品中存在不分泌毒素exou和exos基因的铜绿假单胞杆菌；检测线t3和t2显色，t1不显色，说明样品中存在分泌毒素exos但不分泌exou基因的铜绿假单胞杆菌；检测线t3和t1显色，t2不显色，说明样品中存在分泌毒素exou但不分泌exos基因的铜绿假单胞杆菌；检测线t3、t2和t1均显色，说明样品中可能存在同时分泌毒素exou及exos基因的铜绿假单胞杆菌也可能同时存在只分泌毒素exos和只分泌毒素exou的铜绿假单胞杆菌。在质控线不显色的情况下，需要重新选择一个胶体金试纸条进行检测。检测结果如图3所示。

效果实施例

实施例2

取河水样品63份，取2ml样品液提取基因组并进行多重lamp扩增，之后用胶体金试纸条检测多重lamp产物，5min之内读取检测结果。在质控线显色的情况下：检测线t3、t2和t1均不显色，说明无铜绿假单胞杆菌存在于样品中；检测线t3显色，t2和t1不显色，说明样品中存在不分泌毒素exou和exos基因的铜绿假单胞杆菌；检测线t3和t2显色，t1不显色，说明样品中存在分泌毒素exos但不分泌exou基因的铜绿假单胞杆菌；检测线t3和t1显色，t2不显色，说明样品中存在分泌毒素exou但不分泌exos基因的铜绿假单胞杆菌；检测线t3、t2和t1均显色，说明样品中可能存在同时分泌毒素exou及exos基因的铜绿假单胞杆菌也可能同时存在只分泌毒素exos和只分泌毒素exou的铜绿假单胞杆菌。在质控线不显色的情况下，需要重新选择一个胶体金试纸条进行检测。测得63份样品中36个样品存在铜绿假单胞杆菌。并对检测出铜绿假单胞杆菌的36份样品进行菌株分离，分离得到107株铜绿假单胞杆菌，经检测，其中89株分离菌株分泌毒素exos，10株分离菌株分泌毒素exou。

实施例3

取饮用水样品78份，取2ml样品液提取基因组并进行多重lamp扩增，之后用胶体金试纸条检测多重lamp产物，5min之内读取检测结果。在质控线显色的情况下：检测线t3、t2和t1均不显色，说明无铜绿假单胞杆菌存在于样品中；检测线t3显色，t2和t1不显色，说明样品中存在不分泌毒素exou和exos基因的铜绿假单胞杆菌；检测线t3和t2显色，t1不显色，说明样品中存在分泌毒素exos但不分泌exou基因的铜绿假单胞杆菌；检测线t3和t1显色，t2不显色，说明样品中存在分泌毒素exou但不分泌exos基因的铜绿假单胞杆菌；检测线t3、t2和t1均显色，说明样品中可能存在同时分泌毒素exou及exos基因的铜绿假单胞杆菌也可能同时存在只分泌毒素exos和只分泌毒素exou的铜绿假单胞杆菌。在质控线不显色的情况下，需要重新选择一个胶体金试纸条进行检测。测得78份样品中52个样品存在铜绿假单胞杆菌。并对检测出铜绿假单胞杆菌的52份样品进行菌株分离，分离得到69株铜绿假单胞杆菌，经检测，其中60株分离菌株分泌毒素exos，3株分离菌株分泌毒素exou。

实施例4

取土壤样品60份，，将2g土壤置于20ml的0.8％nacl溶液中，并加入玻璃珠进行震荡处理(180rpm)，取均质后的土壤悬浮液2ml提取基因组并进行多重lamp扩增，之后用胶体金试纸条检测多重lamp产物，5min之内读取检测结果。在质控线显色的情况下：检测线t3、t2和t1均不显色，说明无铜绿假单胞杆菌存在于样品中；检测线t3显色，t2和t1不显色，说明样品中存在不分泌毒素exou和exos基因的铜绿假单胞杆菌；检测线t3和t2显色，t1不显色，说明样品中存在分泌毒素exos但不分泌exou基因的铜绿假单胞杆菌；检测线t3和t1显色，t2不显色，说明样品中存在分泌毒素exou但不分泌exos基因的铜绿假单胞杆菌；检测线t3、t2和t1均显色，说明样品中可能存在同时分泌毒素exou及exos基因的铜绿假单胞杆菌也可能同时存在只分泌毒素exos和只分泌毒素exou的铜绿假单胞杆菌。在质控线不显色的情况下，需要重新选择一个胶体金试纸条进行检测。测得60份样品中25个样品存在铜绿假单胞杆菌。并对检测出铜绿假单胞杆菌的25份样品进行菌株分离，分离得到38株铜绿假单胞杆菌，经检测，其中31株分离菌株分泌毒素exos，7株分离菌株分泌毒素exou。

取100ml样品，将其用0.22μm的滤膜过滤，并将滤膜移至cn琼脂选择性培养基上。将平板在30℃下培养24h。之后将分离的菌株按照《饮用天然矿泉水检验方法》gb/t8538-2008、54进行生化鉴定，即根据在cn琼脂选择性培养基上的菌落形态判断其是否为铜绿假单胞菌。筛选出来的铜绿假单胞菌菌落用来进行已公布的通用引物多重pcr检测，以筛 查其毒素基因的存在性，检测结果与本发明方法的检测结果一致，证明了本发明的实用性和准确性。检测结果如下表所示：

饮用水及环境样本中铜绿假单胞菌的外毒素基因的检测