专利名称：野油菜黄单胞菌野油菜致病变种抗性芸苔属植物及其制备的制作方法
野油菜黄单胞菌野油菜致病变种抗性芸苔属植物及其制备说明本发明涉及野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestrispy.campestris) (Xcc)抗性芸苔属植物及其种子、果实和/或植物部分，及其制备方法。具体说，本发明涉及Xcc抗性甘蓝植物。本发明还涉及这些抗性植物的种子、果实和/或其它植物部分。另外，本发明还涉及提供本发明的Xcc抗性的数量性状基因座(QTL)和分子标记，特别是用于鉴定本发明的QTL的随机扩增的微卫星多态性(RAMP)标记。
微生物野油菜黄单胞菌野油菜致病变种是十字花科植物黑腐病的主要病因。在世界范围内，该微生物可能是十字花科疾病的主要病原体。黑腐病常见于欧洲、美洲、亚洲、澳大利亚和大洋洲的部分。该细菌病的主要宿主植物是甘蓝。然而，黑腐病也见于其它十字花科植物，杂草或装饰植物中。野油菜黄单胞菌野油菜致病变种的感染通常在叶子的排水器中发生，在一些情况下也见于气孔或伤口中。原发性感染后，该微生物通过维管束散播，从而导致维管变黑，和叶子中的V形损伤。结果，叶子的一部分或多个部分枯萎变黄。野油菜黄单胞菌野油菜致病变种是一种可通过种子传播的疾病，能够在发病早期通过种子感染植物。该微生物能够在种子上存活长达三年之久。该微生物的感染还能通过植物部分储藏、次级宿主植物和灌溉系统发生。通过化学药物控制这种疾病是不可能的。抵抗该疾病的唯一可行的方法是使用无病害，即无微生物的起始材料和卫生措施，例如除去受感染宿主植物。可通过使用无病原体的种子或物理处理受感染的种子来获得无病害起始材料。为了栽培健康植物，即无Xcc植物，特别优选使用和获得抗性植物品种，其在生长季节期间仍然不受Xcc感染。芸苔属是芸苔科(先前所称十字花科)的植物属。该属的成员也被称为包心菜或芥菜。芸苔属包括许多重要的农业和园艺作物，包括油菜、花椰菜、红球甘蓝、皱叶甘蓝、白球甘蓝、牛心甘蓝、羽衣甘蓝、椰菜、芽甘蓝、大白菜、球茎甘蓝和葡萄牙甘蓝(tronchuda)。芸苔属植物的各种植物部分可食用，例如根(球茎甘蓝)、茎(球茎甘蓝)、叶(例如白球和红球甘蓝)、腋芽(芽甘蓝)、花(花椰菜、椰菜)。另外，油菜和油菜籽也被用于提供植物油。种植一些开白花或紫花，或具有不同颜色或叶子性状的品种用于装饰。考虑到芸苔属植物对于食物生产的重要性，以及与野油菜黄单胞菌野油菜致病变种感染有关的经济损失，本发明的目的之一是提供Xcc抗性芸苔属植物及其制备方法。缺乏控制黑腐病的充分、经济和有效的手段进一步表明需要Xcc抗性芸苔属植物。例如，对该细菌没有有效杀菌剂。通过如权利要求1所述的提供Xcc抗性芸苔属植物的方法实现本发明的上述目的和其它目的。特别是，本发明的上述目的等是通过提供野油菜黄单胞菌野油菜致病变种抗性芸苔属受体植物的以下方法实现的，该方法包括:_选择第一甘蓝供体植物，其在基因组内含有数量性状基因座I(QTLl);选择第二甘蓝供体植物，其在基因组内含有数量性状基因座
2(QTL2);和将来自第一供体植物的数量性状基因座I(QTLl)和来自第二供体植物的数量性状基因座2(QTL2)基因渗入或基因组合并入甘蓝受体植物；其中，数量性状基因座I(QTLl)的特征是一个或多个RAMP标记，选自158_162bp的片段，具有引物组合SEQ ID No:1和引物6 ;283-287bp的片段，具有引物组合SEQ ID No:2和引物6 ;370-374bp的片段，具有引物组合SEQ ID No:3和引物6 ;以及41_45bp的片段，具有引物组合SEQ ID No:4和引物6。数量性状基因座2(QTL2)的特征是一个或多个RAMP标记，选自88_92bp的片段，具有引物组合SEQ ID No:5和引物6 ;125-129bp的片段，具有引物组合SEQ ID No:6和引物6 ;334-338bp的片段，具有引物组合SEQ ID No:7和引物6 ;和47_51bp的片段，具有引物组合SEQ ID NO:8和引物6 ;和其中，就基因组而言，所述芸苔属受体植物与第一和第二甘蓝供体植物不同。根据本发明的该第一个方面，通过确定与各供体植物基因组中本发明Xcc抗性的存在相关的数量性状基因座(QTL)的存在来选择或鉴定第一和第二供体植物。优选通过使用本领域公知的标准分子生物学技术作出这种确定。这些技术的一个例子包括分离可能供体植物的基因组DNA，然后通过例如PCR、DNA指纹法或Southern印迹法确定分离的基因组中相关数量性状基因座(QTL)的存在。一种特别优选的鉴定各供体植物基因组内存在本发明基因座的方法是DNA指纹技术，在本领域中被称作随机扩增的微卫星多态性，或RAMP。根据这种技术，用本发明的引物(SEQ ID NO:1-8)和RAPD引物(Operon RAPD 10聚体试剂盒A-01-BH-20)，对分离的供体植物的基因组材料进行PCR反应或核酸扩增反应。PCR反应后，可通过例如凝胶电泳分离获得的扩增产物，可用例如分子碱基对梯来确定其以碱基对计的大小。本发明的数量性状基因座I和2(QTL1和QTL2)的特征至少是存在指定的碱基对长度，以及可能的多条不同大小的其它条带，其并不指示抗性。选择合适的供体植物后，可将供体植物中鉴定出的合适基因座(QTL1和QTL2)引入或基因重组入所需受体植物的基因组。这可通过使用标准杂交(crosses)或基因渗入来实现，其中在子代中优选通过测定上述标记的存在来确定本发明的QTL的继承。特别优选的技术是重复回交，优选联合标记分析。根据本发明，就其基因组而言，芸苔属受体植物与第一和第二甘蓝供体植物不同。在本文中，这可通过指示供体和受体植物基因组的供体和受体植物之间的不同表型，或通过普通基因组分析来轻易确定。因此，术语“就其基因组而言，不同……”在本发明中指在供体植物和受体植物之间有一种或多种与Xcc抗性无关的表型差异。换言之，本发明的受体植物在本领域中一般被当成不同植物。根据本发明的一个优选例，第一芸苔属供体植物和第二芸苔属供体植物就它们的基因组而言是相同的。这意味着选择第一和第二供体植物包括选择一种在其基因组中同时包含QTLl和QTL2的供体植物 。换言之，该优选例包括鉴定一种合适的芸苔属供体品种，其同时具有QTLl和QTL2，然后在所需芸苔属受体植物中引入QTLl和QTL2，从而对该受体植物提供Xcc抗性。根据本发明的优选例，该数量性状基因座I(QTLl)的特征是一个或多个RAMP标记，选自160bp的片段，具有引物组合1.1 (SEQ ID No:1)和引物6 ;285bp的片段，具有引物组合1.2 (SEQ ID No:2)和引物6 ;372bp的片段，具有引物组合1.3 (SEQ ID No:3)和6;以及43bp的片段，具有引物组合1.4(SEQ ID No:4)和6。根据本发明的另一个优选例，该数量性状基因座2(QTL2)的特征是一个或多个RAMP标记，选自90bp的片段，具有引物组合 2.1 (SEQ ID No:5)和 6 ; 127bp 的片段，具有引物组合 2.2 (SEQ ID No:6)和 6 ;336bp 的片段，具有引物组合2.3 (SEQ ID No:7)和6 ;以及49bp的片段，具有引物组合2.4 (SEQ IDNo:8)和 6。根据本发明的一个具体优选例，选择供体植物包括通过分子生物学技术确定或鉴定各芸苔属供体植物中I或多个，优选2或多个，更优选3或多个，或最优选4个各QTL的本发明RAMP标记的存在。根据本发明的最优选例，选择或鉴定还包括在第一和第二芸苔属供体植物中选择纯合数量性状基因座I和2 (QTL I和2)。本发明的芸苔属受体植物优选是甘蓝植物，优选自:Brassica oleracea convar.botrytis var.botrytis (花挪菜，罗马花挪菜)，Brassica oleracea convar.botrytisvar.cymosa (挪菜)，Brassica oleracea convar.botrytis var.asparagoides (嫩莖甘蓝)，Brassica oleracea convar.0leracea var.gemnifera(芽甘蓝)，Brassica oleraceaconvar.capitata var.alba(白球甘蓝，牛心甘蓝)，Brassica oleracea convar.capitatavar.rubra(红球甘蓝)，Brassica oleracea convar.capitata var.sabauda(皱叶甘蓝)，Brassica oleracea convar.acephela var.sabellica(习习衣甘蓝)，Brassica oleraceaconvar.acephela var.gongyloides (球莖甘蓝)和 Brassica oleracea var.tronchudasyn.costata (葡萄牙甘蓝)。考虑到上述Xcc抗性芸苔属植物的优点，本发明在另一个方面涉及如上定义的芸苔属受体植物，及其种子、果实和/或其它植物部分，在其基因组中包括:上述数量性状基因座I (QTLl)和数量性状基因座2 (QTL2)。
根据该方面的一个具体优选例，本发明涉及保藏号为NCIMB41553的芸苔属植物，及其种子、果实和/或其它植物部分。根据另一个方面，本发明涉及如上定义的数量性状基因座I(QTLl)和数量性状基因座2(QTL2)的用途，用于提供野油菜黄单胞菌野油菜致病变种抗性芸苔属受体植物。根据另一个方面，本发明涉及一种或多种引物的用途，这些引物选自SEQ ID No:1-8 (分别是引物1.1，1.2，1.3，1.4，2.1，2.2，2.3和2.4)，用于提供本发明的野油菜黄单胞菌野油菜致病变种抗性芸苔属受体植物。用下列优选实施方式的例子进一步举例说明本发明。该实施例是说明性的，并不是要以任何方式限制以所附权利要求确定的本发明的范围。附图简要说明
图1显示了田间试验，其中存在Xcc抗性和Xcc易感性芸苔植物。图2以全彩色显示了
图1的相同图像。
实施例在甘蓝中进行野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xcc)抗性育种是个复杂的过程。描述了几种不同的Xcc，在甘蓝中通常观察不到Xcc抗性。本文所述的甘蓝对Xcc的抗性具有数量性质，即抗性及其水平由遗传背景决定。这意味着有几种基因与此抗性有关，从而才能观察到此种程度的Xcc抗性。为了获得数量抗性的甘蓝植物，即观察到抗性独立于遗传背景，使用抗性基本为隐性的遗传来源。通过回交程序在不同的遗传背景中(易感性亲本品系)引入抗性。通过田间试验确定植物的抗性水平。由于所涉及的性状是隐性的，每次与易感性植物杂交后要经过近交世代(inbreed generation),以获得纯合形式的性状。必需在田间试验中测试该世代的子代的抗性水平。结果，对于一年生植物至少需要两年，对于两年生植物至少需要四年来观察新杂交的效应。由于涉及的抗性可以表示成不同水平的抗性，抗性能表达成数量值(以0-9表示，其中O代表完全敏感，9代表完全抗性)。已显示在不同遗传背景下的抗性显示正常分布范围内的表型分级，而不是简单的孟德尔遗传。该分布可以向易感性漂移，暗示抗性来源和各种易感性亲本品系之间的杂交产生的近交世代可提供不同水平的抗性植物。基于分离比率(segregation ratio)和抗性水平中的差异，显示植物的抗性水平是由数个遗传因子或数量性状基因座决定的。为了鉴定数量性状的指标性或代表性DNA标记，常用QTL分析。QTL是独立的染色体区域，其与潜在基因联合，解释或表明遗传性状。对不同遗传背景的甘蓝种群使用DNA标记进行跨基因组QTL分析。使用这些不同种群的植物进行田间试验，以确定各植株的抗性水平。标记分析的数据和田间试验评分能够鉴定引起所观察到的Xcc抗性的QTL。总的说，鉴定出6种独立遗传的QTL，其在某种程度上对所观察到的抗性水平有贡献。在田间，植株之间观察到的抗性水平的变化是QTL的存在和/或不存在及其不同组合所致。在鉴定出的6种QTL中，两种QTL(在本文中称作QTLl和QTL2)在每种遗传背景下都存在，提供抗性。换言之，这两种QTL表示一种质上的抗性，而其余4种QTL贡献于量上的抗性。这些QTL之一，即QTL1，可被认为是主要QTL，即其对所观察到的抗性贡献最大。通过育种获得的每种野油菜黄单胞菌野油菜致病变种抗性近交品系都拥有这种主要QTL。与主要QTL相似的第二 QTL抗性水平有量上的贡献。然而，该贡献并不如主要QTL那么大，虽然它也独立于遗传背景。在不同的遗传背景下发现了剩余的4种QTL。这4种QTL可能作用改变，导致抗性水平也改变。下文表I证明了这一点，其中甘蓝植株1-6例证了这些观察结果。表I多种QTL对Xcc抗性的影响概览
权利要求
1.提供野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonascampestris py.Campestris)抗性芸苔属受体植物的方法，包括:-选择第一甘蓝(Brassica oleracea)供体植物,其在基因组中含有数量性状基因座I(QTLl);选择第二甘蓝供体植物，其在基因组中含有数量性状基因座2(QTL2);和 -将来自第一供体植物的数量性状基因座I(QTLl)和来自第二供体植物的数量性状基因座2(QTL2)基因渗入或基因组合并入甘蓝受体植物；其中， 数量性状基因座I(QTLl)的特征是一个或多个RAMP标记，选自158_162bp的片段，具有引物组合SEQ ID No:1和引物6 ;283-287bp的片段，具有引物组合SEQ ID No:2和引物6;370-374bp的片段，具有引物组合SEQ ID No:3和引物6 ;以及41_45bp的片段，具有引物组合SEQ ID No:4和引物6 ; 数量性状基因座2 (QTL2)的特征是一个或多个RAMP标记，选自88_92bp的片段，具有引物组合SEQ ID No:5和引物6 ;125-129bp的片段，具有引物组合SEQ ID No:6和引物6;334-338bp的片段，具有引物组合SEQ ID No:7和引物6 ； 和47-51bp的片段，具有引物组合SEQ ID No:8和引物6 ;和 其中就基因组而言，所述芸苔属受体植物与第一和第二芸苔属供体植物不同。
2.如权利要求1所述的方法，其中就基因组而言，第一甘蓝供体植物和第二甘蓝供体植物基本相同。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中数量性状基因座I(QTLl)的特征是一个或多个RAMP标记，选自160bp的片段，具有引物组合SEQ ID No:1和引物6 ;285bp的片段，具有引物组合SEQ ID No:2和引物6 ;372bp的片段，具有引物组合SEQ ID No:3和引物6;以及43bp的片段，具有引物组合SEQ ID No:4和引物6。
4.如权利要求1或2所述的方法，其中数量性状基因座2(QTL2)的特征是一个或多个RAMP标记，选自90bp的片段，具有引物组合SEQ ID No:5和引物6 ;127bp的片段，具有引物组合SEQ ID No:6和引物6 ;336bp的片段，具有引物组合SEQ ID No:7和引物6;以及49bp的片段，具有引物组合SEQ ID No:8和引物6。
5.如权利要求1-4任一所述的方法，其中选择包括通过分子生物学技术确定如权利要求1-4任一所述的一个或多个RAMP标记在各甘蓝供体植物基因组中的存在。
6.如权利要求1-5任一所述的方法，其中数量性状基因座(QTLl)和/或数量性状基因座2 (QTL2)的特征是在各甘蓝供体植物基因组内的两个或多个如权利要求1-4任一所述的RAMP标记。
7.如权利要求1-6任一所述的方法，其中数量性状基因座(QTLl)和/或数量性状基因座2 (QTL2)的特征是在各甘蓝供体植物基因组内的三个或更多个如权利要求1-4任一所述的RAMP标记。
8.如权利要求1-7任一所述的方法，其中数量性状基因座(QTLl)和/或数量性状基因座2(QTL2)的特征是在各甘蓝供体植物基因组内的四个或更多个如权利要求1-4任一所述的RAMP标记。
9.如权利要求1-8任一所述的方法，其中选择包括选择第一和第二甘蓝供体植物中的纯合数量性状基因座I和2 (QTLI和2)。
10.如权利要求1-9任一所述的方法，其中芸苔属受体植物是甘蓝植物。
11.如权利要求1-10任一所述的方法，其中所述芸苔属植物选自=Brassicaoleracea convar.botrytis var.botrytis (花挪菜，罗马花挪菜)，Brassica oleraceaconvar.botrytis var.cymosa(挪菜)，Brassica oleracea convar.botrytis var.asparagoides (嫩莖花挪菜)，Brassica oleracea convar.0leracea var.gemnifera (芽甘蓝)，Brassica oleracea convar.capitata var.alba(白球甘蓝、牛心甘蓝)，Brassica oleracea convar.capitata var.rubra (红球甘蓝)，Brassica oleraceaconvar.capitata var.sabauda (皱叶甘蓝)，Brassica oleracea convar.acephela var.sabellica(习习衣甘蓝)，Brassica oleracea convar.acephela var.gongyloides (球莖甘蓝)和 Brassica oleracea var.tronchuda syn.costata (葡萄牙甘蓝)。
12.如权利要求1-11任一所述的芸苔属受体植物，其在基因组内包含如权利要求1-11任一所述的数量性状基因座I (QTLl)和数量性状基因座2(QTL2)。
13.如权利要求12所述的芸苔属植物，所述植物是保藏号为NCIMB41553的植物。
14.如权利要求12或13所述的芸苔属植物的种子、果实和/或其它植物部分，其中所述种子、果实和/或其它植物部分在它们的基因组内包含如权利要求1-11任一所述的数量性状基因座I (QTLl)和数量性状基因座2 (QTL2)。
15.如权利要求1-11任一所述的数量性状基因座I(QTLl)和数量性状基因座2 (QTL2)的用途，用于提供如权利要求1-1 3任一所述的野油菜黄单胞菌野油菜致病变种抗性芸苔属受体植物。
16.一个或多个选自SEQ ID NO:1_4的引物，和一个或多个选自SEQ ID No:5_8的引物的用途，用于提供如权利要求1-13任一所述的野油菜黄单胞菌野油菜致病变种抗性芸苔属受体植物。
全文摘要
本发明涉及野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xcc)抗性芸苔属植物及其种子、果实和/或植物部分，及其制备方法。特别是，本发明涉及Xcc抗性甘蓝菜植株、及其种子、果实和植株部分，及其制备方法。另外，本发明还涉及提供本发明的Xcc抗性的数量性状位点(QTL)和分子标记，特别是用于鉴定本发明的QTL的随机扩增的微卫星多态性(RAMP)标记。
文档编号A01H5/00GK103118531SQ201080007197
公开日2013年5月22日 申请日期2010年2月5日 优先权日2009年2月6日
发明者J·T·W·利格萨特, R·M·韦斯特拉, K·比尔施泰克, J·德赫斯, H·S·M·休伊茨, A·J·M·斯赫雷弗 申请人:荷兰bejo种子有限公司