性别决定及指定性别的方法

专利名称：性别决定及指定性别的方法
技术领域：
本发明通常涉及性别决定领域。更具体而言，本发明提供了在具有雄性染色体连锁的性别调节基因的物种中操控性别决定的方法和物质。
背景技术：
在本说明书中由发明人所引用的出版物的著录项目详情，按字母顺序集中于本说明书的末尾。在本说明书中提到的任何现有技术，并非且不应当被理解为是承认或以任何形式建议此现有技术在任何国家形成了公知常识的一部分。在大多数动物物种中，性格通常是染色体决定的(Ellegren，"Trends Ecol Evol 15 :188-192,2000 ；Mizuno et al, Cytogenet Genome Res 99 :236_244，2002)。在家禽禽类(poultry bird)和其他禽类中，同配性别是雄性(ZZ)而异配性别是雌性(ZW)。禽类胚胎中性别决定的机制仍然令人困惑，一种假说是W(雌性)染色体携带显性活性卵巢决定 ψ (Arit et al, Proc. Biol. Sci 271 Suppl. 4 :S249-251,2004 ；Nakagawa, Trends Genet 20 :479-480,2004)。另一假说为Z(雄性)连锁基因的剂量，其中两个剂量(ZZ)决定雄性 (Smith and Sinclair, BioEssays 26 120-132，2004)。能在许多物种中决定和操作性别决定的能力，在农业产业中特别重要。选择性产生雌鸡，例如，会促进鸡蛋产量的有效增加并使不必要的雄性鸡的饲养最小化。相反，对于肉类生产，优选雄性鸟类。通过产生单性系鸡，避免了单独区别每个孵出的鸡性别的需要。 这也意味着，不需要因为它们不是所需的性别而筛选50%孵出的鸡。目前通过视觉检查，人工决定鸡的性别，但其耗时、繁重且不准确。性别也可以通过测定某些基因或蛋白标记来确定。这类性别决定方法通常需要一定的技术专长和在商业运营中不易获得的设备。此外，这类方法自身不适合自动化，特别是在农业环境中。需要能提供指定性别的非人类物种。发明概述在本说明书中，除非上下文另有规定，词语“包含(comprise)”或其变体如“包含 (comprises) ”或“包含(comprising) ”，应当理解为，表示包括所述元件或整体或者元件或整体的组，但不排除任何其他元件或整体或者元件或整体的组。根据本发明，确定的是，Z连锁基因即DMRT1，以其纯合形式，在禽类中赋予睾丸发育。DMRTl的下调在禽类胚胎中导致卵巢发育。当DMRTl表达降低时，受到影响的雄性胚胎
4表现出性别逆转，其特征是，雌性化的左侧性腺和右侧睾丸。雌性化的性腺表现出DMRTl表达降低、睾丸索(testis cord)紊乱，以及睾丸生物标记(如S0X9)下降。因此，证明DMRTl 是Z染色体连锁睾丸(雄性)调节基因，并在禽类雄性性别决定中发挥关键作用。DMRTl基因在许多物种中具有同源性，包括鱼类、爬行类以及两栖类。在禽类中诱导雌性化的能力， 能按需要有效产生性别指定的动物，如用于农业产业中。因此，本发明一方面提供了性别指定的动物，所述动物或其亲代经基因修饰以(i) 抑制DMRTl或其雄性染色体连锁同系物的表达或降低DMRTl蛋白酶活性；或者(ii)以提高 DMRTl或其同系物的表达或提高DMRTl蛋白活性，其中DMRTl表达或DMRTl蛋白活性的降低导致具有雌性特征的动物，而DMRTl表达或DMRTl蛋白活性的提高，导致具有雄雌特征的动物。DMRTl “表达提高”表示，所产生的DMRTl蛋白的水平至少等于DMRTl的两个等位基因的表达，即在正常ZZ雄性中的表达。同样，DMRTl “表达降低”表示来自正常ZZ雄性水平的减少。在具体实施方案中，所述动物是禽类动物。因此，本发明的另一方面提供了性别指定的禽类动物，所述禽类动物或其亲代经基因修饰改变DMRTl或其同系物的表达水平或改变DMRTl蛋白或其同系物的活性水平，所述DMRTl表达或DMRTl蛋白活性水平决定禽类动物的性别。更具体而言，本发明提供了性别指定的禽类动物，所述禽类动物或其亲代经基因修饰使DMRTl或其同系物的修饰表达水平最小化或使DMRTl蛋白或其同系物的活性水平最小化，其中DMRTl表达或DMRTl蛋白活性水平降低导致具有雌性特征的禽类动物。本发明的另一方面提供了性别指定的禽类动物，所述禽类动物或其亲代经基因修饰提高DMRTl或其同系物的表达水平或提高DMRTl蛋白或其同系物的活性水平，其中DMRTl 表达或DMRTl蛋白活性提高，导致具有雄性特征的禽类动物。如上文所述，就诸如鸡的禽类而言，DMRTl的水平提高表示提高至与正常(ZZ)雄性相似的水平。水平降低表示降低至与正常(ZW)雌性相似的水平。本发明的另一方面涉及产生性别指定的动物的方法，所述方法包括向动物的囊胚层或发育中的胚胎引入调节DMRTl或其雄性染色体连锁同系物表达水平或调节DMRTl蛋白活性的物质，并允许胚胎发育成出生后动物，其中减少DMRTl表达或DMRTl蛋白活性的物质导致具有雌性特征的动物，而提高DMRTl表达或DMRTl蛋白活性的物质导致具有雄性特征的动物。在具体实施方案中，所述动物是禽类动物。因此，本发明的另一方面提供了产生性别指定的禽类动物的方法，所述方法包括向禽类动物的囊胚层或发育中的胚胎引入调节DMRTl或其同系物表达水平或DMRTl蛋白活性水平的物质，允许胚胎发育为孵化的禽类，其中具有雌性特征的孵化的禽类包含表达降低的DMRTl或活性降低的DMRTl蛋白，而具有雄性特征的孵化的禽类包含表达提高的DMRTl 或活性提高的DMRTl蛋白。本发明的另一方面涉及产生性别指定的禽类动物的方法，所述方法包括，在足以降低DMRTl表达以产生雌性禽类动物或足以诱导DMRTl表达以产生雄性禽类动物的时间内和条件下，调节禽类动物中DMRTl或其同系物的表达水平或DMRTl蛋白的活性。本发明的另一方面虑及了诱导禽类胚胎雌性化的方法，所述方法包括，在胚胎足
5以发育雌性特征的时间内和条件下，向胚胎引入减少DMRTl表达或DMRTl蛋白活性功能水平的物质。本发明的另一方面虑及了诱导禽类胚胎雄性化的方法，所述方法包括，在胚胎足以发育雄性特征的时间内和条件下，向胚胎引入包含DMRTl蛋白或其功能性同系物或类似物的物质或促进DMRTl或其功能性同系物表达的物质。在实施方案中，本发明的物质是基因构建体或化合物，其下调内源DMRTl基因的表达或提高DMRTl的表达。实例包括病毒载体、微RNA(miRNA)、反义寡核苷酸或化合物、 RNAi分子、siRNA分子、有义寡核苷酸、核酶、dsRNA分子以及包含发夹环的寡核苷酸。认为此类分子靶向DMRTl表达并降低DMRTl蛋白水平。在另一实施方案中，物质是基因构建体， 当表达或引入禽类染色体时，其产生DMRTl蛋白。在另一实施方案中，物质是抑制DMRTl蛋白功能或抑制DMRTl基因表达的化学分子。在另一实施方案中，将DMRTl蛋白或DNA或RNA 注射到胚胎中以诱导禽类胚胎的雄性化。本发明还虑及了基因修饰的雌性化的禽类卵，卵包含经基因修饰将DMRTl的表达降低至小于纯合DMRTl雄性的水平或将DMRTl的表达提高至纯合DMRTl雄性水平的囊胚层或发育中的胚胎。随后基于此类卵将基本上产生所有雌性或所有雄性的孵化的禽类，将此类卵提供给消费者。在本文中提到禽类或动物具体包括鸡、鸭、鹅、火鸡、矮脚鸡、雉鸡以及鹌鹑 (quail)。然而，本发明延伸至任何其他禽类，包括企鹅、笼养鸟类(aviary bird)、竞技鸟类 (game bird)、害鸟(bird pest)等。本发明还延伸至禽类之外的非人类动物，如鱼类、爬行类以及两栖类。提到“性别”包括性别(gender)。序列标示号(SEQ ID NO)表示核苷酸和氨基酸序列。SEQ ID NO在数字上对应于序列标示符<400>1(SEQ ID NO :1)、<400>2(SEQ ID NO :2)等。序列标识符一览，提供于表 1中。序列列表提在权利要求之后提供。表1 序列列表
SEQ ID NO 描述1DMRTl探针(正向)2DMRTl探针(反向)3HPRT探针(正向)4HPRT探针(反向)附图简述一些图含有彩色说明或实体。在提出请求后，彩色照片可从专利权人或从适当的专利局获得。如果从专利局获得，可能会收取费用。


图1是表示利用RCASBP病毒递送针对DMRTl的miRNA来在体外敲低(knockdown) DMRTl蛋白的照片和图表。DMRTl蛋白的免疫荧光检测和GFP荧光。(a)仅用RCASBP.
6A. DMRTl感染的鸡成纤维DFl细胞没有在细胞核(红色)中表现出GFP表达，但表现出 DMRTl蛋白的强超表达。(b)在用携带具有GFP报道子的非沉默对照乱序序列(乱序对照) 感染后，用RCASBP. A. DMRTl感染的细胞表现出广泛的GFP和DMRTl蛋白表达(即无敲低)。 在合并的图像中，一些细胞看起来为黄色或橙色，因为GFP可以具有细胞质和细胞核定位。
(c)在用携带DMRTlmiRNA的病毒感染后，用RCASBP. A. DMRTl感染的细胞表现出广泛的GFP 表达(绿色)和DMRTl蛋白敲低(红色)。注意，一些缺少GFP表达(并因此无miRNA)的细胞，表现出强DMRTl表达(箭头)。(d)与用RCASBP. B.乱序对照处理的细胞相比，在用 RCASBP. B. GFP. DMRTl处理的细胞中，DMRTl mRNA表达敲低。未感染的DFl细胞未表现出内源DMRTl表达。图2是在用DMRTl miRNA处理的雄性性腺中异常性腺发育的摄影表现。来自在第 0天用乱序对照或DMRTl miRNA处理的10日龄鸡胚胎的泌尿生殖系统。为了清楚，略述了性腺。(a)对照雄性(ZZ)，表现出对称睾丸的左右对称发育。(b)对照雌性(ZW)，表现出典型的非对称发育，特征为较大的左侧卵巢和较小的右侧性腺。(c)感染有携带DMRTl miRNA 的病毒的基因雄性(ZZ)，表现出异常(雌性样)非对称性，左侧性腺较大，且右侧性腺较小。
(d)感染有携带DMRTlmiRNA的病毒的雌性(ZW)，表现出正常的非对称发育。Ms-成对的中肾。图3是用DMRTl miRNA处理的基因雄性(ZZ)鸡胚胎雌性化的摄影表现。(a)在用非沉默乱序对照序列处理的10日龄基因雄性胚胎(ZZ)中DMRTl蛋白的正常表达。DMRTl 在组织化的睾丸索的支持细胞(Sertoli)和生殖细胞中强表达(箭头)。(b)生殖细胞在对照雄性的睾丸索中的内部分布，这可通过Chick Vasa同源染色体(CVH)的染色而评估。(本发明的另一方面虑及了诱导禽类胚胎雄性化的方，所述方法包括，在胚胎足以发育雄性特征的时间内和条件下，向胚胎引入包含DMRTl蛋白或其功能同系物或类似物或促进 DMRTl蛋白或其功能同系物表达的物质。(C)GFP在对照雄性性腺中的广泛表达。(d)在用 DMRTl miRNA处理的左侧雄性(ZZ)性腺中，减少的DMRTl蛋白和紊乱的睾丸索。与上文(a) 比较。一些区域表现出正常DMRTl表达(如箭头)，但表达在其他区域非常弱，且睾丸索形成丧失。(e)在用DMRTl miRNA处理的雄性性腺中，皮质偏好的(雌性样)生殖细胞分布 (如箭头)。(f)在用DMRTl miRNA处理的性腺中，广泛的GFP表达，其特征是在右侧小睾丸中正常的DMRTl表达和在左侧卵巢中大大降低的DMRTl表达。(h)在(g)中所示的左侧卵巢中，雌性样生殖细胞的分布。(i)在(h)所示的左侧卵巢中的GFP表达。(j)对照雌性 (Zff)的左侧卵巢，在性腺中表现出低DMRTl表达，除了在在皮层生殖细胞中高表达外。(k) 在对照雌性的左侧卵巢中，典型的皮层生殖细胞分布，可通过CVH评估。(I)对照雌性性腺中广泛的GFP表达。图4是在用DMRTl miRNA处理的雄性性腺中，性腺标记的下调和雌性标记的激活的摄影表现。(a)在ZW对照雌性中，缺少S0X9表达。(b)在用乱序对照miRNA序列处理的对照雄性(ZZ)的组织化睾丸索中正常的S0X9表达。(c)在用DMRTl miRNA处理的U 雄性中减少的S0X9表达和紊乱的睾丸索。(d)在用乱序miRNA处理的对照雌性(ZW)的成对的性腺中，正常的芳香酶(aromatase)表达。(c)在用乱序miRNA序列处理的对照雄性 (ZZ)的(左侧)性腺中，缺少芳香酶表达。(f)在用DMRTl miRNA处理的ZZ雄性的左侧性腺中，芳香酶的异位激活。(g)在对照雌性(ZW)的左侧性腺中芳香酶表达的较高倍镜显示
7(higher power view)，显示出在髓质腔隙(腔)周围的细胞(箭头)中的表达。(h)在用 DMRTl miRNA处理的ZZ雄性中部分DMRTl表达。在用括号括起来的区域，DMRTl表达减少且睾丸索受到破坏，所述区域目前异位表达芳香酶，如(i)所示。区域表达芳香酶表示雌性样腔隙(如箭头)。图5表示是设计用于将cGFP. shRNA克隆到RCASBP. B病毒载体的穿梭质粒的图表，质粒 pRmiR(RCAS miRNA)衍生自 pcDNA6. 2-Gff/EmGFP-miR (Invitrogen)。将 3 个 ds-oligos克隆到亲代载体以允许将siRNA ds-oligos克隆到miRNA盒(经由前后相连的 BsaI位点)，且所提供的两个Clal位于eGFP/miR盒的上游和下游，以允许克隆进RCAS。一旦克隆进RCAS，则从病毒LTR产生单个聚腺苷酸化cGFP/miRNA转录物，从而在相同细胞中导致eGFP蛋白表达和成熟的siRNA。发明详述根据本发明，通过Z连锁基因即DMRTl的表达产生DMRTl蛋白，指定禽类的性别决定。DMRTl 基因描述于 Sian et al, Cytogenetics Cell Genetics 89 :252-251,2000 ； Smith et al, Nature 402 =601-602,1999中。本文认为，DMRTl的剂量依赖性表达(即纯合[ZZ]雄性中的两个等位基因)导致禽类胚胎的雄性化。同样，下调DMRTl表达或DMRTl 蛋白的水平导致禽类胚胎的雌性化。因此DMRTl被认为是雄性染色体连锁性别调节基因。按一般术语，如果M被认为是雄配子，则F被认为是雌配子，同配的性别(MM)是雄性而异配的性别(MF)是雌性。据认为，DMRTl的M染色体连锁同系物在同配状态赋予雄性化。因此，MM雄性所赋予的DMRTl的剂量在此被认为是剂量。雌性动物(MF)可以表现出Ix剂量，因此，本文认为，雌性化通过操作MM染色体以表现出小于h(<2x)剂量的DMRTl或其M连锁同系物而发生。“小于h ”或“ ”包括从 Ox-1. 5x 的平均数，其包括诸如 0,0. 1,0. 2,0. 3,0. 4,0. 5,0. 6,0. 7,0. 8,0. 9,1. 0,1. 1、 1. 2,1. 3,1. 4以及1. 5x的量或其之间的量。因此，本发明虑及了靶向DMRTl表达或DMRTl蛋白活性或其雄性染色体连锁同系物，以便操作并指定动物性别。DMRTl或其雄性染色体连锁同系物表达降低至小于正常雄性中两个等位基因的表达水平，导致雌性化。DMRTl或其雄性染色体连锁同系物表达提高至正常雄性中两个等位基因的表达水平，导致雄性化。因此虑及了基因、蛋白质组和化学方法，来减少DMRTl表达或DMRTl蛋白活性水平，以产生雌性动物，或来诱导DMRTl表达或DMRTl蛋白产生，以利于雄性动物的产生。因此，本发明一方面提供了性别指定的动物，所述动物或其亲代经基因修饰(i) 以抑制DMRTl或其雄性染色流体连锁同系物的表达或降低DMRTl蛋白活性；或(ii)以提高外源DMRTl或其同系物的表达或提高DMRTl蛋白活性，其中DMRTl表达或DMRTl蛋白活性减少，导致具有雌性特征的动物，而DMRTl表达或DMRTl蛋白活性提高导致具有雄性特征的动物。DMRTl “表达提高”表示，所产生的DMRTl蛋白水平至少等于DMRTl的两个等位基因的表达，即在正常DMRTl雄性中的表达(即2zx剂量)。同样，DMRTl “表达降低”表示小于正常雄性的表达(即< h剂量)。在具体实施方案中，动物是禽类动物。因此本发明提供了性别指定的非人类动物和其产生方法，其中动物的性别由雄性
8染色体(M)连锁调节基因决定，且其中同配(MM)的雄性具有h剂量的调节基因，而异配 (MF)的雌性具有Ix剂量的调节基因，其中F是雌性配子，性别指定的动物或其亲代通过选自以下的方式进行基因修饰(i)将M染色体上的性别调节基因的一个或两个等位基因的表达下调至的剂量，其中所述性别是雌性；(ii)将MF雌性的M染色体上的性别调节基因上调至h或更多的剂量水平，其中所述性别是雄性；以及(iii)向F或M染色体引入并表达外源性别调节基因，其中所述性别是雄性；其中所述性别调节基因是DMRTl或其雄性染色体连锁同系物。本发明另一方面涉及产生性别指定的动物的方法，所述方法包括向动物的囊胚层或发育中的胚胎引入调节DMRTl或其雄性连锁同系物表达水平或调节DMRTl蛋白活性的物质，并允许胚胎发育成出生后动物，其中减少DMRTl表达或DMRTl蛋白活性的物质导致具有雌性特征的动物，而提高DMRTl表达或DMRTl蛋白活性的物质导致具有雄性特征的动物。在具体实施方案中，动物是禽类动物。因此，本发明另一方面提供了产生性别指定的禽类动物的方法，所述方法包括向禽类动物的囊胚层或发育中的胚胎引入调节DMRTl或其同系物表达水平或DMRTl蛋白活性水平的物质，允许囊胚层发育为具有雌性特征的孵化的禽类和具有雄性特征的孵化的禽类，所述雌性特征包含DMRTl表达降低或DMRTl蛋白活性降低，所述雄性特征包含DMRTl表达提高或DMRTl蛋白活性提高。因此，本发明的另一方面提供了性别指定的禽类动物，所述禽类动物或其亲代经基因修饰改变DMRTl或其同系物的表达水平或改变DMRTl蛋白或其同系物的活性水平，其中DMRTl表达或DMRTl蛋白活性水平决定禽类动物的性别。尽管本发明延伸至具有雄性染色体连锁DMRTl同系物的任何非人类动物，如鱼类、爬行类、两栖类，但其特别涉及禽类动物。更具体而言，本发明提供了性别指定的禽类动物，所述禽类动物或其亲代经基因修饰使DMRTl或其同系物的修饰表达水平最小或使DMRTl蛋白或其同系物的活性水平最小，其中DMRTl表达或DMRTl蛋白活性水平减少，导致具有雌性特征的禽类动物。本发明另一方面提供了性别指定的禽类动物，所述禽类动物或其亲代经基因修饰提高DMRTl或其同系物的表达水平或提高DMRTl蛋白或其同系物的活性水平，其中，DMRTl 表达或DMRTl蛋白活性的提高导致具有雄性特征的禽类动物。在这点上，可以操作异配雌性的内源DMRTl以将其表达增强至h剂量，或引入另一拷贝，以增加拷贝数。“引入的” DMRTl称为“外源DMRTl ”。本发明的另一方面涉及产生性别指定的禽类动物的方法，所述方法包括，在足以减少DMRTl表达以产生雌性禽类动物或足以诱导DMRTl表达以产生雄性禽类动物的时间内和条件下，调节禽类动物中DMRTl或其同系物表达或DMRTl蛋白活性的水平。本发明的另一方面虑及了诱导禽类胚胎雌性化的方法，所述方法包括，在胚胎足以发育雌性特征的时间内和条件下，向胚胎引入减少DMRTl表达或DMRTl蛋白的功能水平的物质。本发明的令一方面虑及了诱导禽类胚胎雄性化的方法，所述方法包括，在胚胎足以发育雄性特征的时间内和条件下，向胚胎引入包含DMRTl蛋白或其功能同系物或类似物或促进DMRTl或其功能同系物表达的物质。在实施方案中，物质是通过诸如引入终止密码子或插入片段抑制DMRTl表达或促进DMRT缺失或失活产生的基因分子。此类分子的实例包括微(mi)RNAs、RNAi、siRNA、dsRNA、包含发夹环的寡核苷酸、反义寡核苷酸、有义寡核苷酸或其化学修饰形式，包括拮抗体(antagomer)。特别是，DMRTl基因的破坏可以是短暂的或成为永久性的。在具体方面，产生不能表达DMRTl的禽类动物。因此，本发明的另一方面提供了基因修饰的禽类动物或所述禽类动物的后代，所述禽类动物基本上不能表达DMRTl或其功能同系物。此类禽类动物会表现出雌性特征并且能产卵。因此，本发明的这一方面提供了基因修饰的雌性产卵禽类动物或所述禽类动物的后代，所述禽类动物基本上不能表达DMRTl或其功能同系物。在本发明的实施方案中，使禽类中编码内源DMRTl基因的DNA缺失。使禽类中诸如DMRTl的内源基因缺失的方法，对本领域技术人员而言是公知的，并且通常包括将基因构建体插入多能细胞并将该细胞转移至胚胎，以产生嵌合体。通过育种，构建体整合到所得动物的生殖系，并最终导致内源DMRTll产生的破坏。内源DMRTl产生的破坏可以通过特定 DMRTl基因基因座的靶向破坏、DMRTl基因基因座的实质性缺失或插入通过普通的细胞分裂过程取代胚胎干细胞或所得动物中完整内源基因座的工程构建体(如终止密码子)而发生。构建体也可以通过例如miRNA、RNAi、siRNA等诱导基因沉默。使禽类的基因失活的方法还描述于例如 International Patent Publication No. WO 03/081992。沉默DMRTl表达的其他机制包括通过诸如甲基化所有或部分DMRTl遗传基因座的外遗传(印igenetic)方法的基因沉默。如上文所述，基因沉默可以以任何数量的方式诱导，包括使用miRNA、RNAi, siRNA、siRNA、锌指核酸酶和各种包含切酶(Dicer)的构建体。 因此本发明提供了寡核苷酸化合物，其选择性抑制内源DMRTl基因或所有或部分DMRTl遗传基因座的表达。通常，表达的抑制是永久性的，且传递给后代。然而，本文也虑及了短暂抑制。“短暂”包括数日、数周、数月或达至禽类动物的一生。因此，本发明使用化合物优选寡核苷酸和相似的物质用于调节或影响动物中的 DMRTl。这通过提供特异性靶向编码DMRTl的DNA或RNA的寡核苷酸而实现。如本文所用， 术语“靶核酸”和“编码DMRTl的核酸分子”为了方便用于包括编码DMRTl的DNA、从此类 DNA转录的RNA (包括其前mRNA和mRNA或其部分)还包括由此类RNA衍生的cDNA。这一方面包括DMRTl的反义和有义抑制。待干扰的DNA的功能可以包括复制和转录。待干扰的RNA的功能可以包括诸如 RNA易位至蛋白翻译位点、RNA易位至细胞内远离RNA合成位点的位点、蛋白由RNA的翻译、 产生一个或多个RNA种类的RNA的剪接以及RNA所使用或促进的有关RNA的催化活性或复合体形成的功能。此类靶核酸功能的具体结果是DMRTl的表达降低。应当理解的是，在本领域中，为有效诱导抑制，有义或反义寡核苷酸化合物的序列不必与其靶核酸的序列100%互补。此外，寡核苷酸可以在靶核酸内与靶区包含至少70% 的序列互补性，更特别是包含90%的序列互补性，甚至更特别是在被其靶向的靶核酸序列内与靶区包含95%的序列互补性。
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DMRTl水平也可以通过引入DMRTl活性或DMRTl表达的抑制剂而在功能上降低。 通常，抑制剂通过引入禽类动物的基因方式而产生。因此，本发明的另一方面虑及了包括禽类动物在内的基因修饰的动物，所述动物经基因修饰表达编码DMRTl活性或DMRTl表达的抑制剂或其雄性染色体连锁同系物的抑制剂的基因材料。因此，抑制剂可以是DMRT1活性的蛋白抑制剂，或可以是下调DMRT1表达的反义或
有义寡核苷酸。蛋白抑制剂的实例包括抗体链、海洋动物衍生的单链抗体(IgNARs)以及DMRTl的肽抑制剂。在另一实施方案中，引入或增强DMRTl活性，以确保产生包括禽类动物在内的雄性动物。通常，这通过引入编码DMRTll蛋白或其功能同系物的基因材料而实现。通常，引入的DMRTl基因称为“外源”DMRT1。这还依然适用于随后的后代。因此，本发明的另一方面提供了包括禽类动物在内的基因修饰的动物，所述动物经基因修饰，表达DMRTl蛋白或其同系物或DMRTl表达的增强子或雄性染色体连锁同系物的增强子。在另一实施方案中，产生包括禽类动物在内的基因修饰动物，已经对其进行了基因修饰，以便能使DMRTl基因或基因基因座受到选择性破坏，通常在体内。例如通过某些条件，可以诱导地失活DMRTl基因或基因基因座。因此，如果需要雌性动物，则发生诱导型失活，以抑制DMRTl表达。然而，如果需要雄性动物，则不使胚胎经历导致DMRTl基因失活的条件。基因操作胚胎的有用载体描述于图5中。一旦DMRTl表达受到破坏或诱导，则可以确定表达水平。存在许多可以用于检测DMRTl表达的方法，包括经由序列鉴定确定DMRTl mRNA的存在。直接核苷酸测序，无论是或手工测序还是自动荧光测序，都能够检测具体mRNA种类的存在。检测核酸种类的技术包括PCR或其他扩增技术。经由微芯片技术的核酸分析，也适用于本发明。在该技术中，在硅芯片上以阵列形式构建不同的寡核苷酸探针。荧光标记待分析的核酸，并使之与芯片上的探针杂交。利用这些核酸微芯片研究核酸蛋白相互作用也是可能的。利用这种技术，可以确定DMRTl mRNA 种类的存在或mRNA的水平，以及DMRTl的表达水平。因此，改变mRNA由DMRTl遗传基因座的表达可以通过本领域已知的任何技术检测。这些技术包括RNA印迹分析、PCR扩增和RNase保护。mRNA表达减少表示，受到影响的基因的改变。DMRTl表达的改变也能通过筛选诸如蛋白的表达产物的改变来检测。例如，与 DMRTl蛋白免疫反应的单克隆抗体可用于筛选组织。同源抗原的缺少或抗原水平的减少表示DMRTl或其雄性染色体连锁同系物表达的减少。这类免疫测定可以本领域已知的任何方便模式进行。这些模式包括蛋白质印迹法、免疫组织化学测定以及ELISA测定。检测改变的蛋白的任何方式都可以用于检测野生型蛋白的改变。可以使用诸如蛋白结合测定的功能测定。因此，本发明还延伸至鉴定动物内性别的遗传基础的方法，所述方法包括从动物获得生物样品，并检测DMRTl的表达水平，其中，存在DMRTl表达或其同系物的水平减少分别指示雌性或雄性动物。生物样品是任何流体或细胞或组织，其中DMRTl得到表达。在实施方案中，生物样品包括血液、淋巴、尿液和唾液或来自这些样品的细胞。因此，本发明提供了基因、化学和蛋白质物质，其抑制DMRTl基因表达或DMRTl蛋白候选或其促进DMRTl活性。本发明另一方面涉及抑制DMRTl基因表达或DMRTl蛋白活性或其雄性染色体连锁同系物的物质在制备诸如禽类动物的雌性化动物中的用途。一种此类物质是图5中的载体。本发明的另一方面虑及了促进DMRTl表达或蛋白活性或其雄性染色体连锁同系物的物质在制备诸如禽类动物的雄性化动物中的用途。提到“DMRT1”基因包括DMRTl遗传基因座，还包括其功能变体(如多态性变体) 和其功能雄性染色体连锁同系物。功能变体或同系物包括与编码DMRTl的cDNA序列具有至少80%相同性的基因。至少80%相同性表示至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、 91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的相同性。相同性可通过任何数量的算法方便地测定。相同性的测定通常在最佳比对之后。同样，DMRTl的功能变体或同系物包括具有DNA链的基因，所述DNA链在中到高严紧条件下与DMRTl DNA链杂交。本文提到杂交包括和包含至少约0到至少约15% ν/ν甲酰胺和至少约IM到至少约2Μ用于杂交的盐，以及至少约IM到至少约2Μ用于洗涤条件的盐。通常，低严紧性为约 25-30°C到约42°C。可以改变温度，并且可用更高的温度取代甲酰胺和/或产生可选的严紧条件。如果需要，可以应用可选的严紧条件，如中度严紧性或高严紧性，中度严紧性包括和包含至少约16% ν/ν到至少约30% ν/ν甲酰胺和至少约0. 5Μ到至少约0. 9Μ用于杂交的盐，和至少约0. 5Μ到至少约0. 9Μ的用于洗涤条件的盐，高严紧性和包含至少约31 % ν/ν到至少约50% ν/ν甲酰胺和至少约0. OlM到至少约0. 15Μ用于杂交的盐，以及至少约0. OlM到至少约0. 15Μ用于洗涤条件的盐。通常，进行洗涤的Tm为Tm = 69. 3+0. 41 (G+C) % (Marmur and Doty, J MoI. Biol. 5 :109,1962)。然而，双链DNA的Tm随着错配碱基对的数量每增加
而降低 I0C (Bonner and Laskey，Eur. J. Biochem. 46 :83，1974)。甲酰胺在这些杂交条件中是任选的。因此特别优选的严紧性水平限定如下低严紧性为6x SSC缓冲液、0. l%w/ ν SDS、于25° -42°C ；中度严紧性为h SSC缓冲液、0. 1 % w/v SDS、于20°C _65°C的温度下；高严紧性为0. Ix SSC缓冲液、0. 1% w/v SDS于至少65°C的温度下。同样，提到蛋白，包括其所有功能变体和同系物，如在最佳比对后，与DMRTl具有至少80%氨基酸相似性的蛋白。本发明的另一方面考虑了用于诸如家禽产业的商业模式。在商业模式中，对家养禽类进行基因修饰，以使DMRTl的表达失活。此类家养禽类所产生的可繁殖的卵会仅产生雌性禽类，并且因此，由于不需要的雄性禽类的饲养而导致的丧失水平实质上减少。因此，提供了用于产生经济利润增强的雌性家养禽类的商业模式，所述模式包括产生具有失活的DMRTl基因或基因基因座的雌性家养禽类，使这些禽类与一个或多个雄性禽类交配，以产生受精卵，允许卵孵化，其中所得孵化的禽类都是雌性，且其中饲养雌性禽类，并将其纳入现有的家养禽类经营中。
12
此类商业模式通过减少需要饲养的雄性禽类的数量而可导致经济收益增强，并增加能用于例如产卵或产肉的禽类的数量。本文提到“禽类动物”或“禽类”包括鸟纲(Class Aves)的任何成员，包括家养禽类，如鸡、鹅、火鸡、矮脚鸡以及鹌鹑。本发明的方法还适用于竞技鸟类、笼养鸟类，并作为控制被认为是害鸟的禽类动物的方式。如上文所述，本发明延伸至禽类以外的非人类动物，如鱼类、爬行类以及两栖类。本发明还涉及基因修饰的受精的鸟卵，所述卵包含经基因修饰将DMRTl的表达降低至小于纯合DMRTl雄性的水平或将DMRTl的表达提高至纯合DMRTl雄性的水平的囊胚层或发育中的胚胎。随后，基于此类卵将基本上产生所有雌性或雄性孵化的禽类，将其提供给消费者。此外，本发明提供了增强家禽产业经济回报的商业模式，所述模式包括供应基因修饰的受精卵和所述卵是否会产生雌性孵化的禽类或雄性孵化的禽类的指示，每个卵包含基因修饰的囊胚层或发育中的胚胎，其中DMRTl的表达减少至小于正常ZZ雄性的水平，或 DMRTl的表达提高至正常ZZ雄性的水平。如上文所述，DMRTl表达降低表示，处于这样水平，其中胚胎会发育雌性特征。 DMRT1表达提高表示这样的水平，其中胚胎表现出雄性特征。本发明还涉及诸如逆转录病毒载体的基因元件在诱导DMRTl或其雄性染色体连锁同系物表达减少或提高中的用途。本发明延伸至基因修饰的动物的所有后代，和其干细胞系。本文还涉及基因修饰的孵化的禽类。通过下述非限制性实施例，进一步描述了本发明。本发明的方面已经发表于Smith et al，Nature Letters 46 :261_271，2009中，其内容在此通过援引并入。在实施例中，使用下述材料和方法。材料和方法病毒的制备将RCASBP. B病毒修饰为携带GFP的可读框，以及在GFP的可读框3’UTR的针对鸡 DMRTl的重组微RNA。利用Invitrogen Block-It (Trade Mark)系统，设计序列5，并以短发夹模式产生。该序列针对鸡DMRTl mRNA的外显子3 (exon three)，且不表现出与鸡基因组中其他序列的同源性(等于或大于16/21个碱基)。将发夹序列克隆到携带GFP的工程穿梭载体(pRmiR，图5)。随后将GFP-微RNA亚克隆到RCASBP. B毒株。接着用高质量DNA 转染鸡DFl细胞。由DFl细胞收获病毒，按之前所述(Smith et al, Int. J. Dev. Biol. 53 59-67,2009)纯化。获得约108个感染单位/mL的病毒效价。用相同碱基的乱序序列作为对照，将其克隆到RCASBP. B，并以相同的方式繁殖(=RCASBP. B. GFP.乱序对照)。DMRTl体外表达的敲低为了检测敲低的效率，用RCASBP. B. GFP. DMRTl或乱序对照病毒感染DFl细胞，并使其生长数天，随后用携带DMRTl可读框的RC ASBP.A.毒株感染。(DFl细胞不产生内源 DMRTl0细胞可以用两种病毒感染，只要它们属于不同毒株)。共感染4天后，处理细胞，用于 GFP 和 DMRTl 蛋白表达。如之前所述(Smith et al, Biol Reprod 55 :560-567,2003), 利用DMRTl抗体(in-house)和Alexfluor 二抗，进行免疫荧光。还通过定量实时PCR，
13评估抑制。按以前所述(Smith et al，BMC Dev Biol 8 :72，2008)，从细胞提取RNA并合成 cDNAo 利用 UPL Assay Design Centre (https://www.roche-applied-science.coni)
设计探针，且探针如下5 ‘ -AGCCTCCCAGCAACATACAT-3 ‘ (SEQ ID NO 1)禾口 rev 5 ‘ -GCGGTTCTCCATCCCTTT-3 ‘ (SEQ ID NO 2)的 DMRTl 探针 #59 ;5 ‘ -CGCCCTCGACTACAATGAATA-3 ‘ (SEQ ID NO 3)禾口 Rev 5 ‘ -CAACTGTGCTTTCATGCTTTG-3 (SEQ ID NO 4)‘的 HPRT 探针 #38。Analysis was performed利用LightCycler 480仪器和软件(Roche)，进行分析。胚胎从澳大利亚维多利亚Woodend 的 SPAFAS (SPAFAS，Woodend，Victoria，Australia) 获得能繁殖的鸡卵(Gallus gallus domesticus) 0利用纤细的玻璃毛细针，给400个O天的囊胚层注射DMRT敲低或乱序对照病毒。密封并孵育卵，直到第10天。到第10天的存活率为40%。选择在泌尿生殖系统中表现出IOGFP荧光的胚胎(观/160)，用于进一步分析。 泌尿生殖系统中GFP表达在强至弱之间变动。如以前所述(Smith et al，2003，同上)，通过PCR在基因型上区别胚胎的性别。在观个胚胎中，发现在性腺中表现出强GFP的5个雄性具有不同程度的DMRTl敲低程度和雌性化证据。数个雌性在性腺中表现出强GFP 15，但卵巢发育正常。所有其他胚胎(1 在性腺中具有可变的GFP、正常的性腺性别分化，以及无 DMRTl敲低。假定较低水平的微RNA递送(通过较低GFP表达评估)可能不足以影响内源 DMRTl。(在GFP表达水平和DMRTl表达间，存在良好的负相关；具有较强GFP的胚胎20表现出较强的DMRTl敲低，如同所预期的)。利用直接衍生于泌尿系统的组织，再区别表现出雌性化的所有基因雄性胚胎的性别。在所有情况下，证实最初指派的基因型性别。免疫荧光如所述(Smith et al，2008，同上)，将泌尿系统在4% ν/ν多聚甲醛/PBS中固定， 在30% w/v蔗糖/PBS中冰冻保护，在OCT化合物中包埋，并进行切片。用免疫荧光评估蛋白表达。内部产生所有兔DMRT1、抗芳香酶和抗S0X9(1 6000)，并且已经作过描述(Smith et al，2003，同上)。实施例1. DMRTl的下调将针对DMRTl转录物的重组微RNA (mi RNA)经由鸟逆转录病毒载体RCASBP. B(Replication Competent Avian Sarcoma leukosis virus, high titre Bryan Polymerase, strain B,复制感受态鸟肉瘤白血病病毒，高效价Bryan聚合酶，菌株B)，递送到活鸡胚胎中。将病毒改造为携带GFP的可读框，以便监控病毒传播，同时DMRTl miRNA位于转基因的3' UTR0强病毒LTR启动子而不是内部TO启动子驱动miRNA表达。该病毒在培养的鸡DFl细胞中递送强GFP表达和外源DMRTl蛋白的敲低(
图1)。用仅表达DMRTl cDNA的RCASBP. A毒株感染的细胞表现出强DMRTl超表达(图la)。用携带DMRTl cDNA的病毒和表达非沉默RCASBP. B. GFP.乱序miRNA的病毒共转染的细胞，表现出强DMRTl蛋白表达(图lb)。相反，用DMRTl和DMRTl miRNA序列共转染的细胞，表现出DMRTl蛋白的敲低(图Ic)，且与用乱序对照miRNA处理的细胞相比，DMRTl转录物减少70% (图Id)。实施例2.基因修饰胚胎的产生用携带GFP报道子以及DMRTl miRNA的病毒感染0天的鸡囊胚层，并允许胚胎发生进行，直到第10天。用携带GFP和乱序非沉默miRNA序列的病毒，感染对照胚胎。通过W(雌性)特异性》iol重复序列的PCR扩增，在基因型上区别所有胚胎的性别。在鸡胚胎中，在孵育3. 5天左右，性腺在中肾上形成。在第6天，开始向睾丸或卵巢的性分化，且通常前行至第10天。在第O天用病毒感染的胚胎，截止到第10天，表现出强GFP全局表达，包括在泌尿系统和在切片的25个性腺中的广泛表达。总的胚胎发育是正常的。用对照miRNA 处理的胚胎的性腺发育是正常的，在雄性中具有左右对称的睾丸，且在雌性中具有典型非对称卵巢发育(图加和幻[n = 10]。在所有对照情况中，性腺性别匹配基因型性别。然而，在用DMRTl miRNA处理的那些胚胎中，表现出高GFP表达的5个雄性也表现出受到破坏的睾丸发育。在宏观上，这些雄性中有3个雄性表现出异常(雌性样)不对称(较大的左侧性腺和较小的右侧性腺)[图2c]。用DMRTl miRNA处理的雌性(ZW)表现出正常的非对称卵巢发育(图2d) [n = 5]。对来自具有高水平GFP (且因此miRNA递送)的胚胎的性腺进行切片，并评估DMRTl和标记基因表达。在用携带非沉默乱序miRNA的病毒感染的对照胚胎中，DMRTl表达未受到影响，且性腺组织学正常。在对照雄性中，DMRTl蛋白一律表达于睾丸索的发育中的支持细胞和生殖细胞中(图3a)。在未感染的雄性胚胎中，表达是强的、 双边的(在左侧性腺和右侧性腺中)且根据染色不能区分。生殖细胞分布于两个性腺髓质的睾丸索内，这可通过鸡Vasa同源染色体(Chicken Vasa homologue, CVH)染色评估[图 3b]。GFP免疫荧光证实乱序miRNA序列在对照雄性中广泛表达(图3c)。相反，用DMRTl miRNA处理的5个雄性胚胎(ZZ)表现出左侧性腺中DMRTl蛋白表达不定减少、睾丸索形成受到破坏以及异位雌性基因表达。DMRTl敲低和睾丸索破坏的程度在胚胎间变化。一些个体表现出DMRTl表达受到破坏，伴随睾丸索紊乱和生殖细胞分布皮层(雌性样)模式(图3d和e)。如同在对照雄性中，这些个体表现出强GFP表达(图 3f)。其他TL胚胎表现出更强的雌性化，特征是在右侧性腺中正常的DMRTl表达和睾丸索形成，但DMRTl表达大大减少、睾丸索组织化和卵巢型左侧性腺丧失(图3g)。左侧雌性化性腺的生殖细胞再次表现出雌性样分布(即集中于性腺的外部，即皮层，而不是睾丸索内) [图池]。纤连蛋白免疫荧光也揭示了用DMRTl miRNA处理的ZZ雄性性腺的雌性型形态， 所述纤连蛋白免疫荧光描述了增厚的卵巢样皮层和拙劣形成的睾丸索。在表现出最强GFP 表达(即最高的敲低30miRNA的递送)的性腺中，观察到ZZ雌性化的最强实例[图3i和 1].在对照雌性(ZW)中，卵巢发育是正常的。DMRTl在发育中的(左侧)卵巢内缓慢表达，例外是，在皮层生殖细胞中较高地表达(图3j)。CVH染色揭示了对照中的正常生殖细胞分布(图3k)。如同在雄性中，GFP表达在对照雌性中是普遍的(图31)，在用DMRTl 微RNA处理的基因雌性中，内源DMRTl表达看起来较低，但性腺仍然看起来正常，具有典型的非对称。这表明，DMRTl对鸡卵巢发育而言不是必须的。实施例3.胚胎的表征进一步检查性腺的雄性和雌性标记的表达。参与睾丸分化的关键基因是S0X9。在哺乳动物中，S0X9被SRY激活，并且为支持细胞分化和正确的睾丸发育所需。S0X9在所检查的所有脊椎动物中是雄性上调的，包括禽类，这表明在睾丸发育中的保守作用。在用乱序 miRNA感染的第10天的对照胚胎中，S0X9在雄性性腺中正常表达。雌性性腺缺少S0X9表达，正如所期望的(图如和b)。在用DMRTl miRNA处理的基因雄性(ZZ)中，S0X9蛋白表达不定减少，这反映了睾丸索受到破坏(图4c)。因此DMRTl可以在鸡胚胎的睾丸决定过
15程中，在S0X9表达的激活或维持方面发挥作用(在哺乳动物中，由SRY代替的作用)。用 DMRTl miRNA处理的基因雄性也表现出强雌性标记即芳香酶的异位激活。芳香酶仅在雌性性腺中正常表达，其中，其合成鸡卵巢分化所需的雌激素。在正常的雄性胚胎性腺中从未检测到芳香酶。在对照和敲低雌性(ZW)胚胎中，芳香酶在左侧性腺和右侧性腺的髓质中正常表达(图4d)。在雄性对照中未观察到表达(图如)。然而，在用DMRTl miRNA雌性化的5 个基因雄性中，在左侧(而非右侧)性腺中，芳香酶受到激活(图4f)。在具有部分敲低的一些基因雄性(ZZ)中，DMRTl表达的减少或缺失区域，与异位芳香酶表达和雌性样腔隙相关(图4g、h、i)。这些发现表明，雄性性腺中DMRTl提高通常抑制芳香酶，并因此抑制雌性发育。这种作用可以是直接的，或经由5F0XL2基因表达而是间接的，所述5F0XL2基因被认为激活芳香酶。实施例4.作用机制成为本发明基础的研究结果，支持10例禽类性别决定的Z剂量假说(Nanda et al, Cytogenet Genome Res 122 150-156，2008)。较高剂量的 DMRTl 在雄性胚胎中启动睾丸分化，从而激活S0X9表达并抑制雌性发育所需的芳香酶。DMRTl满足禽类主要性别决定基因所期望的要求。在所检查的所有禽类的Z性染色体上，包括基本的平胸鸟(鸵鸟、鸸鹋等)，其是伴性的、保守的[Sheety et al, cytogenet Genome Res 99 :245-251,2002] 在鸡胚胎的性腺性别分化前，其无一例外地表达于泌尿系统中，同时，在雄性中具有较高的表达(Smith et al，2003，同上)，且敲低导致性腺性别逆转。在其他脊椎动物中，DMRTl也与睾丸决定有关。在温度性别决定的爬行类中，DMRTl表达在决定性别的热敏感期且仅在产生雄性的温度下受到上调(Shoemarker et al, Dev Dyn 236 12055-1063，2007 ；Kettlewell et al, Genesis 26 174—178，2000)。在青鏘鱼(Oryzias latipes)中，双拷贝 DMRTl 即 DMY，是主要的睾丸决定子(Matsuda et al,Nature 417 :559_562>>，2002)，尽管W连锁拷贝即DMW参与两栖类有爪蟾蜍(Xenopus laevis)的卵巢发育(Yoshimoto et al，Proc Natl Acad Sci USA 105 J469-2474，2008)。本文的数据提供了 DMRTl在禽类中是令人困惑的雄性性别决定子的证据。本领域技术人员应当理解，除了具体描述以外，本文所述的本发明可允许改变和修饰。应当理解，本发明包括所有此类改变和修饰。本发明还包括在本说明书中单独或共同提到或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及任何两个或多个所述步骤或特征的任何和所有组合。参考文献Arit et al, Proc. Biol. ScL 271 Suppl. 4 :S249_251，2004Ellegren, Trends Ecol Evol 75 :188-192,2000Kettlewell et al, Genesis 2(5 :174-178,2000Matsuda et al, Nature 417 :559-563,2002Mizuno et al, Cytogenet Genome Res 99 :236-244,2002Nakagawa, Trends Genet 20 :479-480,2004Nanda et al, Cytogenet Genome Res 722 :150-156,2008Shan et al, Cytogenetics Cell Genetics 89 :252-251,2000Sheety et al, cytogenet Genome Res PP :245-251,2002
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Shoemarker et al, Dev Dyn 256 :12055-1063,2007Smith et al, Nature 402 :601-602,1999Smith et al, Biol Reprod 68 :560-561,2003Smith et al, BMC Dev Biol 8:12,2008 Smith et al, Int. J. Dev. Biol. 53 59-61,2009 Smith et al, Nature Letters 46 :261_21\，2009Smith and Sinclair, Bioassays 25 :120-132，2004Yoshimoto et al, Proc Natl Acad Sci USA 105 :2469-2474,2008
权利要求
1.性别指定的动物，所述动物或其亲代经基因修饰以(i)抑制DMRTl或其雄性染色体连锁同系物的表达或降低DMRTl蛋白或其同系物的活性；或者(ii)以提高外源DMRTl或其雄性染色体连锁同系物的表达或者DMRTl蛋白或其同系物的活性，其中DMRTl的表达或 DMRTl蛋白活性或者其同系物的表达或活性的降低，导致具有雌性特征的动物，而DMRTl的表达或DMRTl蛋白活性或其同系物的表达或活性提高，导致具有雄性特征的动物。
2.权利要求1的所述性别指定的禽类动物，其中DMRTl的表达或DMRTl蛋白活性或者其同系物的表达或活性被降低，导致具有雌性特征的动物。
3.权利要求1的所述性别指定的禽类动物，其中DMRTl的表达或DMRTl蛋白活性或者其同系物的表达或活性被提高，导致具有雄性特征的动物。
4.权利要求1的所述性别指定的动物，选自禽类动物、爬行类、鱼类以及两栖类。
5.权利要求4的所述性别指定的禽类动物，其中所述禽类动物选自鸡、鸭、鹅、火鸡、矮脚鸡、雉鸡以及鹌鹑。
6.权利要求4的所述性别指定的禽类动物，其中所述禽类动物选自竞技鸟类、笼养鸟类以及野生鸟类。
7.权利要求4的所述性别指定的禽类动物，其中所述禽类动物是鸡。
8.权利要求1的所述性别指定的禽类动物，其中DMRTl表达水平的降低是由于靶向 DMRTl或其遗传基因座的基因修饰造成的。
9.权利要求8的所述性别指定的禽类动物，其中所述基因修饰选自DMRTl的缺失或失活以及下调DMRTl基因表达的RNA的产生。
10.权利要求3的所述性别指定的禽类动物，其中所述禽类动物表达外源DMRTl基因或其同系物。
11.权利要求1-10中任一项所述的性别指定的禽类动物的后代。
12.产生性别指定的动物的方法，所述方法包括向动物的囊胚层或发育中的胚胎引入物质，所述物质调节DMRTl或其雄性染色体连锁同系物表达水平或调节DMRTl蛋白的活性；以及使胚胎发育成出生后动物，其中降低DMRTl表达或DMRTl蛋白活性的物质导致动物，其提高DMRTl表达或DMRTl蛋白活性的物质导致具有雄性特征的动物。
13.权利要求12所述的方法，其中所述动物是禽类动物。
14.产生性别指定的禽类动物的方法，所述方法包括向禽类动物的囊胚层或发育中的胚胎引入调节DMRTl或其同系物表达水平或DMRTl蛋白活性水平的物质。
15.诱导禽类胚胎雌性化的方法，所述方法包括，在所述胚胎足以发育雌性特征的时间内和条件下，向所述胚胎引入降低DMRTl表达或DMRTl蛋白的功能水平的物质。
16.诱导禽类胚胎雄性化的方法，所述方法包括，在所述胚胎足以发育雄性特征的时间内和条件下，向所述胚胎引入包含DMRTl蛋白或其功能性同系物或类似物的物质或促进 DMRTl蛋白或其功能性同系物表达的物质。
17.权利要求14-16中任一项所述的方法，其中所述禽类动物选自鸡、鸭、鹅、火鸡、矮脚鸡、雉鸡以及鹌鹑。
18.权利要求14-16中任一项所述的方法，其中所述禽类动物选自竞技鸟类、笼养鸟类以及野生鸟类。
19.产生雌性禽类动物的方法，所述方法包括在胚胎足以雌性化的时间内和条件下，在卵内基因修饰所述禽类胚胎，以使DMRTl或其同系物的表达失活；以及使所述雌性化的胚胎成熟和孵化。
20.性别指定的非人类动物，其中所述动物的性别由雄性染色体(M)连锁的性别调节基因的剂量(χ)决定，且其中同配(MM)的雄性具有剂量的所述调节基因，而其中异配 (MF)的雌性具有Ix剂量的所述调节基因，其中F是雌性配子，所述性别指定的动物或其亲代通过选自以下的方式进行基因修饰(i)将M染色体上的所述性别调节基因的一个或两个等位基因的表达下调至< h的剂量，其中所述性别是雌性；( )将MF雌性中M染色体上的所述性别调节基因的表达上调至h或更高的剂量水平，其中所述性别是雄性；以及(iii)向F或M染色体引入并表达外源性别调节基因，其中所述性别是雄性；其中所述性别调节基因是DMRTl或其雄性染色体连锁的同系物。
21.权利要求20所述的性别指定的非人类动物，其中所述动物是禽类动物。
22.权利要求21所述的性别指定的非人类动物，其中所述动物是雌性。
23.权利要求22所述的性别指定的非人类动物，其中所述性别调节基因的剂量基本上为0。
24.在制备雌性化禽类动物中抑制DMRTl基因表达或DMRTl蛋白活性的物质。
25.在制备雄性化禽类动物中促进DMRTl表达或蛋白活性的物质。
26.提供用于产生具有增强的经济回报的雌性家养鸟类的商业模式，所述模式包括 产生具有失活的DMRTl基因或基因基因座的雌性家养鸟类；使这些鸟类与一个或多个雄性鸟类交配，以产生受精卵；使所述卵孵化，其中所得的孵化的鸟类都是雌性，且其中饲养所述雌性鸟类并将其引入现有的家养鸟类经营中。
全文摘要
本发明通常涉及动物的性别决定领域。提供了通过雄性染色体连锁睾丸(性别)调节基因，特别是在诸如鸡的禽类动物中操作性别决定的方法和物质。调节DMRT1基因或蛋白的表达活性，以产生表现出不同于其基因型的表型性别的动物。
文档编号A01D19/00GK102355814SQ201080007056
公开日2012年2月15日 申请日期2010年2月8日 优先权日2009年2月8日
发明者A·辛克莱尔, C·史密斯, J·W·洛温塔尔, R·J·莫尔, T·J·多兰 申请人:墨尔本大学, 默多克儿童研究所