一种利用高温诱导确定大菱鲆性别分化时期的方法与流程

本发明属于鱼类养殖领域，具体地涉及一种利用高温诱导确定大菱鲆性别分化时期的方法。

背景技术：

鱼类的性别分化是指雌雄异体鱼类在生活史的早期发育阶段，具有双向发育潜力的原始性腺经过程序性发生的一系列事件,发育成精巢或卵巢的过程，其中有些鱼类伴随着性腺的分化还会出现第二性征。一般而言，性别决定方式主要是遗传决定的雌雄异体鱼类，决定性别的基础虽然是遗传基因，但是在性别分化过程中容易受到温度和外源激素等敏感外部因素的影响，导致最终分化完成的性别为雌雄间性或者与遗传决定性别相反的表型性别，而性别分化一旦完成，则会终生保持，不会再轻易受到外部环境的影响而发生性逆转。在这类鱼类的性别分化时期，施加或者控制可以引起性反转的敏感外部因素，就有可能定向诱导或抑制性反转，获得所期望的表型性别个体，因此明确性别分化时期是研发这类鱼类性别控制技术的关键基础知识之一。现有确定鱼类性别分化时期的方法，主要是在个体发育早期阶段，以一定的时间间隔连续取样，对所获取的每个样品，或者通过连续的组织切片观察性腺的组织结构，寻找性腺分化起始和结束的标志以确定性别分化时期，或者通过分子生物学方法检测性别分化相关基因的差异化表达发生的发育阶段，确定性别分化的起始时期。两种方法都需要实验人员具备特殊的专业训练，同时还需要借助于专门的仪器设备和实验室。

大菱鲆(scophthalmusmaximus)是包括我国在内的三大洲、十几个国家的海水重要养殖鱼类品种，2015年全球养殖产量达到6.5万t(fao，2017.fisheryandaquaculturestatistics.globalaquacultureproduction1950-2015)，其苗种生长性状的提升将会极大促进养殖产业的发展。大菱鲆雌雄生长速度差异显著，全同胞苗种同池养殖2年后雌鱼的体重是雄鱼的1.8倍(imslandetal.,1997，aquacultureresearch,28:101–114)，养殖全雌苗种的效率可以比养殖雌雄性比为1:1的混群苗种提高40％以上，因此，大菱鲆的全雌苗种生产技术从20世纪90年代开始，就先后成为英、法、西班牙和中国等国家的研究热点，但迄今未见成功的报道。作为研发全雌苗种制种技术的关键基础参数——大菱鲆的性别分化时期，现有研究方法确定的结果，组织切片观察法为全长35.2-69.3mm(韩伟国，2011，硕士学位论文，中国海洋大学)，而分子生物学检测法只能确定性别分化起始时期为59.0mm(ribas等，2016,molecularandcellularendocrinology，422:132-149)。至于其他确定大菱鲆性别分化时期的方法，目前还未见到报道。

技术实现要素：

本发明提供了一种利用高温诱导确定大菱鲆性别分化时期的方法，以解决现有确定方法存在成本高和难度大等问题。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种利用高温诱导确定大菱鲆性别分化时期的方法，它的步骤如下：

1)建立全同胞家系：选取来源于同一对大菱鲆亲本的同一批受精卵进行孵化，将所获初孵仔鱼同池培育至仔鱼末期阶段；

2)高温诱导实验：设置除了水温以外其它养殖条件和管理一致的对照组和实验组，将步骤1)培育的仔鱼分别放养于实验组和对照组水槽中，此后对照组水温保持恒定，实验组分别在不同发育阶段开始进行一段时期的高温诱导处理，然后保持与对照组相同的水温进行培育，直至对照组和实验组苗种的规格均达到能够通过解剖观察鉴定性别的规格；

3)性别分化时期的确定：对步骤2)所述方法培育达到规格的苗种进行解剖观察判断性别，确定对照组和实验组的雄性表型比例，作出实验组雄性表型比例与高温诱导开始时苗种规格之间的关系图，图中雄性表型比例折线变化明显的区间所对应的苗种规格，就是大菱鲆的性别分化时期。

进一步，对照组的培育水温为18±0.5℃，实验组，苗种移入时培育水温都与对照组相同为18±0.5℃；然后分别在水槽内苗种平均全长达到设定的规格10mm、20mm、30mm、40mm或50mm时，将水温每天提升2-3℃，达到25℃后一直保持为25±0.5℃，直至苗种平均全长达70mm，此后每天降低水温1-2℃，直至18℃，以后恒温养殖至全长超过150mm。

本发明与现有技术相比的有益效果如下：

1)现有的组织学和分子生物学确定鱼类性别分化时期的方法，都需要对每个样品进行连续组织切片观察或者采用实时定量pcr分析性别分化相关基因的表达量，需要处理和分析的样品数量较大，对实验人员专业知识和技能的要求都比较高，都需要专业的设备和实验室条件。本发明不需要上述专业技能和条件，在试验现场就可以进行，实验成本也显著比现有组织学方法和分子生物学方法低。

2)与大多数鱼类一样，大菱鲆的性别分化始于性腺体细胞的形态和结构的分化。现有技术方法中，组织切片观察法，由于切片厚度和光学显微镜分辨率的限制，观察和确定性腺体细胞的形态和结构比较困难，因此只能以特定的性腺结构变化，如卵巢腔和输精管的形成作为性别分化的起始标志，这样所确定的性别分化起始时期就会晚于真正的性别分化起始时期。而分子生物学检测性腺相关基因表达量差异变化的方法，在不确定性别决定基因的情况下，需要检测的基因数量常常达到数十个，即使这样，所检测的基因可能并不包括关系最密切的基因。实际上，现有采用组织学和分子生物学方法确定的大菱鲆性别分化起始时期分别为35.2mm和59.0mm，均晚于本发明确定的20.1mm，组织学方法确定的性别分化结束时期69.3mm也晚于本发明确定的43.0mm，因此采用本发明确定的大菱鲆性别分化时期更为准确。

附图说明

图1高温诱导确定大菱鲆性别分化时期的实验设计；

图2苗种雄性表型比例与开始进行高温诱导时苗种规格的关系；

图3大菱鲆5月龄苗种性腺解剖特征：a卵巢；b精巢

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明进行进一步的说明，但本发明的保护范围不受实施例任何形式上的限制：

实施例

一种利用高温诱导确定大菱鲆性别分化时期的方法，它的步骤如下：

(1)构建全同胞家系：选取成熟度良好的普通大菱鲆雌鱼与雄鱼各一尾，通过人工挤压的方式分别获得卵和精子，置于干燥洁净的器皿内，采用干法进行人工授精，受精卵冲洗干净后放入孵化网箱中流水孵化，孵化水温13～15℃，仔鱼孵出后移入苗种培育池按常规方法进行培育，培育水温18±0.5℃。

(2)高温诱导实验：设置18个体积200l的玻璃钢水槽，分为1个对照组和5个实验组，每组3个重复。15日龄苗种平均全长达到7.0mm左右时，随机从育苗池中随机选取苗种分别移养于18个水槽中，每个水槽的苗种数量都控制在1500尾左右。整个实验过程中对照组水温始终控制在18±0.5℃，其余5个实验组，苗种移入时培育水温都与对照组相同，为18±0.5℃，然后分别在水槽内苗种平均全长达到设定的规格10mm、20mm、30mm、40mm和50mm时，将水温每天提升2-3℃，达到25℃后一直保持为25±0.5℃，直至苗种平均全长达70mm，此后每天降低水温1-2℃，直至18℃以后恒温养殖至全长超过150mm(150日龄)。本实施例中实验组开始进行高温诱导时苗种的实际规格如下：

对照组：平均全长为12.30±1.45mm，20日龄；

10mm组：平均全长为12.30±1.45mm，20日龄；

20mm组：平均全长20.05±1.24mm，28日龄；

30mm组：平均全长30.11±2.15mm，40日龄；

40mm组：平均全长43.00±3.64mm，54日龄；

50mm组：平均全长51.53±2.34mm，65日龄。

(3)性别分化时期的确定：对照组和实验组苗种全长都超过150mm(日龄>150)后，每组分别随机抽取60尾幼鱼，麻醉后解剖观察性腺的形态，肉眼鉴定性别。全长超过150mm以后，大菱鲆性腺位于体腔下缘，其中卵巢为左右对称的囊状结构，呈倒戟状且中部向后突出(图3-a)，精巢位于膀胱表面，左右两侧各有1条白色细带状结构(图3-b)，肉眼很容易区分。

本实施例中，对照组雄鱼比例为46.94±3.24％，高温实验组雄鱼比例分别为10mm组73.43±3.88％，20.0mm组74.40±6.36％，30mm组58.18±1.62％，40.0mm组53.60±1.60％，50mm组53.06±5.25％。大菱鲆苗种雄性表型比例与开始高温诱导时苗种规格的关系如图2所示，从图2中可以看出，大菱鲆性别比例对高温的敏感期，图2中10mm点和50mm点分别代表开始进行高温诱导的最小和最大全长，两点之间涵盖了大菱鲆性别分化时期；由于高温可以导致部分遗传雌性大菱鲆性反转为表型雄性，从10mm至20mm两点间的任何规格开始进行高温诱导，诱导时期都涵盖了整个性别分化时期，因此10mm点至20mm点对应的雄性比例最高且没有显著差别；随着性别分化的进行，高温诱导效率开始下降，因此从20mm点以后开始诱导，雄性比例呈逐渐下降趋势；40mm点以后性腺分化已经完成，此时再进行高温诱导，遗传雌性不会形反转为雄性表型，因而从40mm至50mm点开始诱导，苗种雄性比例相似，且与对照组相比没有显著差异。因此，从图2苗种雄性表型比例的变化规律可以推测，20mm点至40mm点对应的规格应为大菱鲆的性别分化时期，即大菱鲆的性别分化时期为20.1-43.0mm(孵化后28-54日龄)，性别分化起始和结束时期所对应的雄性比例分别为74.4％和53.6％，与对照组的46.9％的统计差异，起始时期显著，结束时期不显著，说明所确定的分化时期统计学上有意义。