一种可降解环境激素双酚A的红球菌DSH及其应用的制作方法

本发明涉及生物工程技术领域，具体是一种可降解环境激素双酚a的红球菌dsh及其应用。

背景技术：

在过去半个世纪，环境激素对人类和野生动物赖以生存的自然环境造成了严重的危害，已经成为全球范围内共同亟待解决的环境污染问题，引起了人们的广泛关注。环境激素作为一种常见的内分泌干扰物，与机体正常情况下分泌的雌性激素在结构和功能上类似。一旦进入机体，不仅可以扰乱机体正常的内分泌激素的合成与代谢，影响生长发育和性别分化，还能引起神经、内分泌、免疫等多系统发育异常和生殖障碍，甚至致畸和致癌等。

环境激素能够利用洋流作用从低纬度地域转移至高纬度地域，乃至能够到达极地生态系统。另外，由于环境激素能通过食物链在高等生物体内富集和放大，对人类健康和动物生态安全产生巨大威胁。双酚a(bisphenola，bpa)，在众多的外源性内分泌干扰物中被公认为是对环境的潜在影响和危害最大的几种雌激素之一。首先，污染范围广，在空气、土壤以及河流中都检测到bpa，且浓度达到ng/l级。其次，在人体内没有特定的代谢系统，难以降解，去除上有较大困难，对人类健康危害较大。因此，受到了国内外研究者的广泛关注。

目前，去除环境中bpa的方法总体上可以分为物理方法、化学方法以及生物方法。物理方法主要是采用活性炭等吸附剂对bpa进行吸附去除；化学方法是采用高级氧化法氧化处理bpa，主要有电化学氧化法及催化氧化法等；生物方法主要是筛选、分离和驯化bpa降解菌对bpa进行去除。生物方法具有运行成本低、污染物去除彻底等优点，同时也是治理污水处理厂以及环境中受雌激素污染的水体和土壤的主要途径。关于用生物方法去除环境中雌激素的课题，国内研究起步相对较晚，而且，研究者对环境激素的研究也主要集中在雌激素的毒理学研究、检测方法探索以及雌激素污染的风险评价上，对环境激素的微生物降解特性及降解机理的研究较少，急需开展广泛深入的研究。随着环境激素污染的日益加剧，探寻一种高效、经济、绿色的环境激素去除方法，对控制和治理环境激素污染具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种能够稳定、高效的可降解环境激素双酚a的红球菌dsh及其应用，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种可降解环境激素双酚a的红球菌dsh，红球菌属(rhodococcussp.)，命名为红球菌dsh，其保藏编号为cgmccno.12392；该红球菌dsh于2016年4月25日保藏到中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

所述红球菌dsh的16srdna的片段的序列如序列表中seqidno：1所示。

作为本发明进一步的方案：上述红球菌dsh，按以下步骤制备：

1)采集药厂污水处理厂的活性污泥作为微生物源；

2)以双酚a为唯一碳源，将菌株dsh培养在双酚a的浓度为5mg/l的无机盐培养基中，在30℃，120rpm的恒温振荡培养箱中培养72h。

3)从每个无机盐培养基中取200μl菌液置入新鲜的无机盐培养基中(其中该无机盐培养基中bpa浓度为10mg/l)，在30℃，120rpm的恒温振荡培养箱中连续培养7d。然后，再从每个无机盐培养基取200μl菌液置入新鲜的无机盐培养基(其中该无机盐培养基中bpa浓度为20mg/l)，在30℃，120rpm的恒温振荡培养箱中连续培养7d。

4)按上述步骤继续将菌液接种到含有bpa浓度分别为40mg/l、60mg/l、80mg/l、100mg/l(重复三次)的新鲜无机盐培养基中培养。

5)取1ml菌液用无菌水稀释成梯度为10^-2～10^-8，将经过不同梯度稀释的菌液涂布到lb琼脂培养基上，经过反复划线，最终得到纯化的红球菌dsh。

其中，所述无机盐培养基的成分包括：na2hpo44.260g/l；kh2po42.650g/l；mgso4·7h2o0.200g/l；(nh4)2so41.500g/l；cacl20.020g/l；用0.1mol/lnaoh和0.1mol/lhcl调ph为7.0；加入1ml的微量元素。

其中，微量元素的成分包括：nicl2·6h2o0.024g/l；cocl2·6h2o0.190g/l；h3bo30.006g/l；zncl20.070g/l；cucl2·2h2o0.002g/l；mnso4·h2o0.061g/l；na2moo4·2h2o0.024g/l。

lb琼脂培养基的成分包括：胰蛋白胨10g/l；酵母提取物5g/l；nacl10g/l；待lb琼脂培养基完全溶解后，调ph为7.4。

本发明另一目的是提供所述红球菌dsh在降解环境激素中的应用。

作为本发明进一步的方案：环境激素为双酚a。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明通过对生产双酚a的药厂的活性污泥进行富集驯化、纯化分离以及复筛，得到红球菌dsh。本发明筛选出的红球菌对双酚a具有很强的降解能力，将红球菌dsh培养在以双酚a为唯一碳源的培养基中连续培养7天，能将浓度为100mg/l的双酚a快速降解，降解率在96％以上，该红球菌dsh能稳定、高效的降解双酚a，可将其应用于处理环境中双酚a的生物降解与环境修复。

附图说明

图1是本发明的红球菌(rhodococcussp.)dsh在lb琼脂培养基上形态图。

图2是本发明的红球菌(rhodococcussp.)dsh革兰氏染色图。

图3是本发明的红球菌(rhodococcussp.)dsh在电子显微镜下的形态图。

图4是本发明的红球菌(rhodococcussp.)dsh的系统发育树。

图5是本发明的红球菌(rhodococcussp.)dsh对双酚a的降解率和od值的结果图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明所提供的红球菌dsh来源于药厂的污水处理厂活性污泥中，经过富集驯化、纯化分离及复筛所得。红球菌dsh在lb琼脂培养基上，菌落呈圆形，表面圆润，边缘完整，呈浅粉色，不透明，直径约1.5～3.0mm(图1)，革兰氏染色呈阳性(图2)，在扫描电镜下观察菌株的形态为：呈球形，无鞭毛(图3)。吲哚、v-p、半乳糖阴性，能将明胶液化，能水解蔗糖、果糖、葡糖糖，鸟氨酸脱羧酶、精氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶、精氨酸双水解酶呈阳性。将菌株的16srdna的基因序列输入到ncbi在线blast比对程序与基因库中的核酸数据进行同源性比对检索。比对结果表明，红球菌dsh的16srdna基因序列与红球菌属(rhodococcus)中的多株红球菌和马红球菌的16srdna的基因序列有较高的同源性。选取红球菌属中的18株细菌的16srdna基因序列，并选取分支杆菌属(mycobacterium)中的2株细菌16srdna基因序列做外群，使用mega软件并根据neighbor-joining进行系统进化树分析，构建的无根系统发育树(图4)，结合红球菌dsh的形态特征和生理生化指标，初步鉴定dsh为红球菌，命名为红球菌(rhodococcussp.)dsh。该红球菌dsh于2016年4月25日保藏到中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.12392。

具体操作过程如下所述。

实施例1红球菌(rhodococcussp.)dsh菌株的获取与保藏

采集药厂和污水处理厂的泥样、水样作为微生物源，冷藏运回实验室。并对样品进行唯一碳源培养。取15mg双酚a溶于30ml甲醇中，制成浓度为500mg/l的双酚a母液。取1ml双酚a母液加入到盛有100ml无机盐培养基的三角瓶中，使无机盐培养基中双酚a的终浓度为5mg/l。无机盐培养基组成(g/l)：na2hpo44.260；kh2po42.650；mgso4·7h2o0.200；(nh4)2so41.500；cacl20.020。用0.1mol/lnaoh和0.1mol/lhcl调ph为7.0，加入1ml的微量元素。微量元素组成(g/l)：nicl2·6h2o0.024；cocl2·6h200.190；h3bo30.006；zncl20.070；cucl2·2h2o0.002；mnso4·h2o0.061；na2moo4·2h2o0.024。将三角瓶放入恒温水浴锅中，60℃水浴30min，使甲醇完全挥发。将三角瓶瓶口用纱布、牛皮纸密封后放入高压灭菌锅中，温度121℃，高压灭菌20min。将泥样按体积比10％加入到盛有已灭菌的培养基的三角瓶中(培养基体积为90ml)；将水样按体积比10％加入到另一盛有已灭菌的培养基的三角瓶中(培养基体积为90ml)。在30℃，120rpm的恒温振荡培养箱中培养72h，每个培养基取200μl菌液加入新鲜培养基(双酚a浓度为10mg/l)，在30℃，120rpm的恒温振荡培养箱中连续培养7d。然后，从每个培养基取200μl菌液加入新鲜培养基(双酚a浓度为20mg/l)，在30℃，120rpm的恒温振荡培养箱中连续培养7d。按此法将菌液接种到含有双酚a浓度分别为40mg/l、60mg/l、80mg/l、100mg/l(重复三次)的新鲜无机盐液体培养基中培养。将经过不同梯度稀释的菌液涂布到lb琼脂培养基上，每个梯度做3个平行组。将lb琼脂培养基放入恒温培养箱，30℃，培养3d，观察菌落长势。挑取颜色、形态等不同的菌落在lb琼脂培养基上进行多次划线，直至分离出单个菌落。菌株dsh的平板划线图如图1所示。菌株dsh经过扩大培养后，一部分于-80℃甘油混合液保藏，一部分于4℃试管斜面保存。本发明的红球菌dsh已于2016年4月25日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，登记入册编号为cgmccno.12392。

实施例2红球菌(rhodococcussp.)dsh菌株的鉴定

用细菌的通用引物通过pcr扩增技术扩增dna。测序结果利用ncbi中的blast工具与genbank数据库中的16srdna基因序列进行同源性比对检索。比对结果表明，红球菌dsh的16srdna基因序列与红球菌属(rhodococcus)中的多株红球菌和马红球菌的16srdna的基因序列有较高的同源性。选取红球菌属中的18株细菌的16srdna基因序列，并选取分支杆菌属(mycobacterium)中的2株细菌16srdna基因序列做外群，使用mega软件并根据neighbor-joining进行系统进化树分析，构建的无根系统发育树，结合红球菌dsh的形态特征和生理生化指标，初步鉴定菌株dsh为红球菌，命名为红球菌(rhodococcussp.)dsh。

实施例3红球菌(rhodococcussp.)dsh对双酚a的降解能力

将菌株接种到含有浓度为50mg/l双酚a的无机盐培养基中，培养24h。将菌液倒入灭菌的离心管中，4000rpm离心10min，弃上清液，加入ph为7的磷酸盐缓冲溶液洗涤，再4000rpm离心15min，倒去上清液。如此反复洗涤3次，用漩涡混合器将菌体打散，最后，用磷酸盐缓冲溶液将菌液稀释到od600值为1.0，制成菌悬液备用。从每株细菌的菌悬液中取出200μl的菌液接种到以双酚a为唯一碳源，浓度为50mg/l的无机盐培养基中，在30℃，120rpm的恒温振荡培养箱中在30℃，120rpm的恒温振荡培养箱中连续培养7d，每天取一次样。将培养基经过预处理后，用高效液相色谱仪(high-performanceliquidchromatography，hplc)检测各株细菌对双酚a的降解能力(图5)。检测器uv(dualλabsorbancedetector，water2487)，色谱柱为zorbaxeclipseplusc18柱(150×4.6mm，3.5mm)。流动相体积比为乙腈∶水＝1∶1，检测器波长为275nm，流速为0.8ml/min，进样量为10μl。并用酶标仪检测细菌的生长状况，细菌的生长状况用od600表示。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。