瘿椒树亲缘关系鉴定方法与流程

本发明属于苗木育种
技术领域：
，涉及一种苗木育种的检测方法，具体涉及一种瘿椒树亲缘关系鉴定的方法。
背景技术：
：瘿椒树(tapisciasinensisoliv)属于瘿椒树科，是一种多年生落叶乔木，种群中雄株和两性株异株(雄全异株)，雄株不结果，两性植株6月初完成受精,受精后果实进入休眠状态直至第二年三月才开始发育，其自然种群中两性花可以产生可育花粉。瘿椒树为我国特有的古老的第三纪古热带孑遗树种，国家三级保护植物。其作为一种古老濒危树种，在研究生物进化，植物繁育系统演化，性别决定机制方面具有重要理论意义。srap(sequence-relatedamplfiedpolymorphism，序列相关扩增多态性)dna分子标记技术是美国加州大学li与quiros于2001年中开发出来的一种新型的基于pcr的双引物分子标记技术。其利用正向引物的ccgg与外显子区域结合而反向引物的aatt与内含子区域和启动子区域结合的特点对基因保守的orf(openreadingframe，开放阅读框)进行扩增，扩增结果与表型/基因型具有密切相关性，同时因为其具有很高的操作简易性和扩增多态性，srap标记在物种种群遗传结构及亲缘关系分析中得到了广泛的应用。目前已经成功应用于甘蓝，西葫芦，野牛草，棉花，荔枝等作物遗传多样性、品种鉴定、遗传图谱构建，遗传亲缘关系分析等方面。瘿椒树传统的育苗方式主要两种类型,即有性繁殖和无性繁殖,有性繁殖以种子繁殖为主。在苗木育种亲本选配中，传统方法依靠育种学家的田野形态鉴定手段，这在很大程度上限制了新品种选育的准确性和可靠性，分子标记的手段则有助于在育种之前提前理清育种材料之间的亲缘关系，大大节省了育种周期，节省了育种成本，提高了可靠性。在瘿椒树中利用srap分子标记方法进行亲缘关系鉴定和遗传多样性分析尚未见报道。技术实现要素：鉴于现有技术存在问题，本发明的目的在于提供一种瘿椒树亲缘关系鉴定方法，该方法操作简单，周期短，成本低效率高，对于瘿椒树育种中亲本选配具有重要指导价值。本发明采用以下技术方案来实现,包括如下步骤：一种瘿椒树亲缘关系鉴定方法，包括以下步骤，(1)提取不同居群瘿椒树基因组dna，构建总dna池、雄性dna池和两性dna池；(2)分别以总dna池、雄性dna池和两性dna池为模板进行srap-pcr扩增，扩增产物进行凝胶电泳及银染显色后得到多条多态性条带；以总dna池为模板时，采用的引物共10对，包括seqidno.1～no.20；以雄性dna池为模板或以两性dna池为模板时，采用的引物共10对，包括seqidno.21-no.40；(3)根据所述多条多态性条带得到不同居群不同性别瘿椒树的dna指纹图谱；(4)根据dna指纹图谱表分别得到不同居群和不同性别的瘿椒树亲缘关系树状图。步骤(1)中提取基因组dna是通过瘿椒树幼嫩叶片提取；构建dna池具体步骤包括：将每个居群瘿椒树雄性基因组dna和两性基因组dna等重量混合构建对应居群总dna池，每个居群瘿椒树雄性基因组dna构成对应居群雄性dna池，每个居群瘿椒树两性基因组dna构成对应居群两性dna池。步骤(2)中银染显色的染色液为质量浓度0.02％agno3。所述步骤(4)具体包括：根据dna指纹图谱表，计算不同居群瘿椒树间的遗传相似系数，通过遗传相似系数，采用非加权类平均法聚类分析，构件反映不同居群瘿椒树亲缘关系的树状图。本发明的有益效果是：(1)本发明所选用的引物对在不同居群瘿椒树中反应稳定，扩增片段清楚，利用8％非聚丙烯酰胺凝胶电泳，采用银染显色的方法获得的电泳条带多态性高，条带清晰，有利于结果统计。同时整个方法操作流程简单，用时短，成本低。(2)采用本发明方法可揭示不同瘿椒树种群间的亲缘关系远近，说明种群间的遗传多样性，从而在分子水平上加深对瘿椒树种质资源的亲缘关系的认识，可以为瘿椒树种质资源的准确鉴定，杂种优势的预测，亲本选配，苗木遗传分子育种等提供参考。(3)本发明将srap分子标记技术用于瘿椒树雄性及两性亲缘关系鉴定，能准确成功的辨析不同瘿椒树地理居群中，不同性别植株的演化关系，在研究被子植物繁育系统演化方面具有重要意义。附图说明图1是利用不同引物(p1：f1r10，p2:f1r17)对不同居群总dna池进行srap-pcr扩增后用8％非聚丙烯酰胺凝胶电泳图。图2是利用引物f1r10对不同居群雄性及两性进行srap-pcr扩增后用8％非聚丙烯酰胺凝胶电泳图。图3为基于10对srap引物对瘿椒树7个地理种群10个样本(总dna池为模板扩增)进行遗传相似度分析结果表。图4为基于10对srap引物对瘿椒树7个地理种群10个样本(总dna池为模板扩增)进行亲缘关系和聚类分析所构建的树状图。图5为基于10对srap引物对瘿椒树7个地理种群17个样(雄性dna池及两性dna池为模板进行扩增)本进行亲缘关系和聚类分析所构建的树状图。图6为基于对比例1的条带。具体实施方式下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。多态性条带为分子标记中的常规概念，多态是指不同个体对于同一分子标记pcr条带不同，条带的有无，大小，多少等。实施例1：本实施例提供一种瘿椒树亲缘关系鉴定方法，具体过程如下：(1)提取不同居群瘿椒树雄性基因组dna和两性基因组dna，分别构建不同居群和不同性别的dna池；dna提取：对采集自七个不同居群共十个雄性样本和十一个两性样本(除snb，其余样本两性果实均在受精后第二年发育)的瘿椒树幼嫩叶片进行硅胶干燥保存，具体的采样点编号，样地名称，及采集数量见表1。表1采集信息采用tiangen的plantgenomicdnakit对上述11组瘿椒树雄性及两性植株幼嫩叶片进行基因组dna提取，每组提取雄性5株dna，两性5株dna。具体操作过程按照此试剂盒说明书严格执行即可，说明书略。构建dna池：按照bsa(bulkedsegerantanalysis，群体分离分析方法)，在每组中取雄性及两性植株各五株的dna等量混合构建此样本的总dna池，获得xy，ql，ns32，ns101，xx，ys，sk，xf，yn，sn共10个srap-pcr扩增用总dna池。其中ql，ns32，ns101均采自样地宁陕，xx，ys均采自样地永顺。这样做的目的是为了对最终所构建的亲缘关系和聚类分析树状图的准确性进行检验，检验标准为：如果树状图将同一取样地的不同样本聚为一类，则说明所构建的树状图准确性及可靠性高，能准确反映瘿椒树不同地理居群之间的亲缘关系，遗传进化关系。相反，如果树状图将同一取样地的不同样本没有聚为一类，则说明所构建的树状图准确性及可靠性差，不能准确反映瘿椒树不同地理居群之间的亲缘关系，遗传进化关系。按照bsa在每组中，分别取雄性5株的dna等量混合构建该组雄性样本的dna池，分别取两性5株的dna等量混合构建该组两性样本的dna池，获得xy，ql，ns32，ns101，sn，xx，ys，sk，xf，yn，共10个雄性srap-pcr扩增用dna池，xy，ql，ns32，ns101，sn,snb,xx，ys，sk，xf，yn，共11个两性srap-pcr扩增用dna池，其中ns32，ns101均采自样地宁陕。(2)以总dna池、雄性dna池和两性dna池为模板进行srap-pcr扩增，扩增产物进行凝胶电泳及银染显色后得到多条多态性条带。以总dna池为模板时，采用的引物共10对，见表4；以雄性dna池为模板或以两性dna池为模板时，采用的引物共10对见表5。上述引物对的获取方法如下：以上述步骤得到的dna池为模板进行srap扩增，对400(20fx20r，fr分别代表正向和反向)srap引物进行筛选，筛选所用引物序列如表2，得到扩增产物，扩增产物进行凝胶电泳和银染显色后选择，有条带，多态性良好，条带清晰可辨的引物对，筛选结果如表3；srap-pcr扩增体系及扩增程序由本实验室预先优化方法获得，采用15μl反应体系进行srap扩增：2xtaqpcrmastermix7.5μl；上游引物f(10μm)0.5μl；下游引物r(10μm))0.5μl；植物dna池模板(50ng/μl)0.5μl；灭菌水6μl补足15μl。其中，2xtaqpcrmastermix包含500μmdntps、50mmph8.7tris-hcl、20mmkcl、4.0mmmgcl2、0.1utaqpolymerase/μl。srap-pcr扩增程序如下：94℃预变性3min30sec，一个循环；94℃变性30sec，一个循环；35℃低温退火30sec，5个循环；72℃延伸1min30sec，一个循环；94℃第二次变性30sec，一个循环；52℃高温退火45sec，35个循环；72℃延伸1min30sec，一个循环；72℃延伸10min；16℃保存。其中2xtaqpcrmastermix购自北京天根，引物由上海生工生物有限公司合成。400对srap-pcr筛选所用引物具体如表2所示，筛选后，后续srap-pcr扩增中涉及到的引物具体如表3所示；以每个居群总dna池为模板时，srap-pcr扩增所采用的10对引物组合见表4所示；以10个雄性srap-pcr扩增用dna池，10个两性srap-pcr扩增用dna池，为模板扩增所采用的引物组合见表5所示。表2引物筛选所用的400对引物ts-f1tgagtccaaaccggatats-r1gactgcgtacgaattaatts-f2tgagtccaaaccggagcts-r2gactgcgtacgaatttgcts-f3tgagtccaaaccggaatts-r3gactgcgtacgaattgacts-f4tgagtccaaaccggaccts-r4gactgcgtacgaatttgats-f5tgagtccaaaccggaagts-r5gactgcgtacgaattaacts-f6tgagtccaaaccggacats-r6gactgcgtacgaattgcats-f7tgagtccaaaccggacgts-r7gactgcgtacgaattcaats-f8tgagtccaaaccggactts-r8gactgcgtacgaattcacts-f9tgagtccaaaccggaggts-r9gactgcgtacgaattcagts-f10tgagtccaaaccggaaats-r10gactgcgtacgaattcatts-f11tgagtccaaaccggaacts-r11gactgcgtacgaattctats-f12tgagtccaaaccggagats-r12gactgcgtacgaattctcts-f13tgagtccaaaccggttats-r13gactgcgtacgaattctgts-f14tgagtccaaaccggtccts-r14gactgcgtacgaattcttts-f15tgagtccaaaccggtgcts-r15gactgcgtacgaattggtts-f16tgagtccaaaccggtaats-r16gactgcgtacgaattgtcts-f17tgagtccaaaccggtagts-r17gactgcgtacgaatttcgts-f18tgagtccaaaccggttgts-r18gactgcgtacgaattatgts-f19tgagtccaaaccggtgtts-r19gactgcgtacgaattagcts-f20tgagtccaaaccggtcats-r20gactgcgtacgaatttag表3后续srap扩增涉及到的引物列表上游引物f5＇-3＇下游引物r5＇-3＇ts-f1tgagtccaaaccggatats-r1gactgcgtacgaattaatts-f2tgagtccaaaccggagcts-r2gactgcgtacgaatttgcts-f3tgagtccaaaccggaatts-r4gactgcgtacgaatttgats-f4tgagtccaaaccggaccts-r6gactgcgtacgaattgcats-f5tgagtccaaaccggaagts-r10gactgcgtacgaattcatts-f6tgagtccaaaccggacats-r11gactgcgtacgaattctats-f10tgagtccaaaccggaaats-r12gactgcgtacgaattctcts-f14tgagtccaaaccggtccts-r14gactgcgtacgaattcttts-f15tgagtccaaaccggtgcts-r17gactgcgtacgaatttcg表4srap-pcr扩增采用的引物组合列表seqid上游引物f5＇-3＇下游引物r5＇-3＇1-2ts-f1tgagtccaaaccggatats-r10gactgcgtacgaattcat3-4ts-f1tgagtccaaaccggatats-r17gactgcgtacgaatttcg5-6ts-f2tgagtccaaaccggagcts-r6gactgcgtacgaattgca7-8ts-f3tgagtccaaaccggaatts-r2gactgcgtacgaatttgc9-10ts-f4tgagtccaaaccggaccts-r12gactgcgtacgaattctc11-12ts-f5tgagtccaaaccggaagts-r4gactgcgtacgaatttga13-14ts-f6tgagtccaaaccggacats-r6gactgcgtacgaattgca15-16ts-f10tgagtccaaaccggaaats-r14gactgcgtacgaattctt17-18ts-f14tgagtccaaaccggtccts-r11gactgcgtacgaattcta19-20ts-f15tgagtccaaaccggtgcts-r1gactgcgtacgaattaat表5srap-pcr扩增采用的引物组合列表seqid上游引物f5＇-3＇下游引物r5＇-3＇21-22ts-f1tgagtccaaaccggatats-r10gactgcgtacgaattcat23-24ts-f2tgagtccaaaccggagcts-r6gactgcgtacgaattgca25-26ts-f5tgagtccaaaccggaagts-r4gactgcgtacgaatttga27-28ts-f10tgagtccaaaccggaaats-r14gactgcgtacgaattctt29-30ts-f11tgagtccaaaccggaacts-r3gactgcgtacgaattgac31-32ts-f12tgagtccaaaccggagats-r3gactgcgtacgaattgac33-34ts-f13tgagtccaaaccggttats-r14gactgcgtacgaattctt35-36ts-f15tgagtccaaaccggtgcts-r1gactgcgtacgaattaat37-38ts-f17tgagtccaaaccggtagts-r12gactgcgtacgaattctc39-40ts-f20tgagtccaaaccggtcats-r19gactgcgtacgaattagc凝胶电泳：pcr扩增产物用8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳进行分离。每孔上样7μl，300v电压,200a电流，100w功率，直至指示带距胶底部3-5cm，停止电泳，电泳2h。试剂配方：100ml8％聚丙烯酰胺凝胶工作液中：纯水52.7ml，30％母液26.6ml，5×tbe缓冲液20ml，10％过硫酸铵溶液0.7ml，temed0.065ml。30％聚丙烯酰胺凝胶母液配方：聚丙烯酰胺145g，甲叉双丙烯酰胺5g，加双蒸水定容至500ml；5×tbe缓冲液配方：tris27g，硼酸13.75g，0.5mph8.0edta10ml,定容至500ml,电泳缓冲液为1×tbe。银染显色：具体包括如下步骤：水洗：将电泳后凝胶从玻璃板揭下，放入染色盘中，用清水冲洗三遍，每次15sec；在染色盘中倒入250ml染色液，放在摇床上匀速染色10min；倒掉染色液，用清水小心冲洗凝胶三遍，每次15sec；在染色盘中倒入250ml显色液，放在摇床上染色约10min后出现清晰条带；倒掉显色液，用清水冲洗凝胶15sec；将显影的凝胶在胶片观察灯上，用手机拍照。检测所用试剂配方：0.02％agno3染色液：1gagno3加双蒸水定容至500ml；显影液：naoh6g,naco30.2g，甲醛2ml加双蒸水定容至500ml。如图1所示，是利用不同引物(p1：f1r10，p2:f1r17)对不同居群总dna池进行srap-pcr扩增，用8％非聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染显色之后的多态性条带，其中m为dl2000marker(takara)。如图2所示，是利用引物f1r10对不同居群雄性dna池及两性dna池瘿椒树进行srap-pcr扩增，用8％非聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染显色之后的多态性条带。表示雄性植株，表示两性植株。(3)根据每对引物扩增产物的凝胶电泳结果建立指纹图谱，即以样本编号为横行，以每条谱带的引物及其条带位置为纵行，条带位置是指，按照从上到下即由大片段向小片段的读带方向从1开始编号。在每一横纵坐标交结处，根据条带的有无转换成[0,1]矩阵数据表，即强扩增谱带和弱扩增谱带记为“1”，无带记录为“0”，从而将电泳胶图中条带的有无转化成[0,1]矩阵，分别绘制所有引物对供试品种的dna指纹图谱表，所采用的10对srap引物共产生119条差异条带。以表6所列10个样本为例，利用10对引物的扩增结果构建的指纹图谱表如下(以f1r10-4为例，“f1r10”表示上下游引物标号，“-4”表示多态性谱带是从上到下第四条被计数的条带)。表7用10对srap引物对10个雄性dna池，11个两性dna池扩增结果构建的指纹图谱表。(为了最终的结果简洁，在构建指纹图谱时候将扩增时候用于对照的雄性ql,ys，两性的ql,ys样本删除，同时只保留来自同一地理居群的ns32，ns101)。表6用10对srap引物对10个样本扩增结果构建的指纹图谱表表7不同居群雄性dna池及两性dna池扩增后构建的dna指纹图谱(4)根据dna指纹图谱表，分别得到反映不同居群和不同性别的瘿椒树亲缘关系的树状图。利用nntsys-pc(2.1版本)，根据相似矩阵采用upgma(非加权类平均法)法聚类分析，得到遗传相似系数，并根据遗传相似系数构建遗传关系树状图，最后对七个居群10个样本之间的亲缘远近关系(遗传相似度)及聚类进行分析。遗传相似度结果见图2所示，横坐标和纵坐标均为采样样本编号，数字代表遗传相似度，数字大小代表了遗传相似度的高低，数字越大代表遗传相似度越高，聚类进行分析结果见图3，横坐标为cofficient(遗传相似系数)，ⅰⅱⅲ为聚类结果。利用10对于srap引物组合产生的119条dna差异条带段计算了10个供试样本之间的遗传相似系数。srap标记揭示10个样本材料间遗传相似系数值变化范围为0.429～0.906。其中，ql与sn居群之间遗传相似系数最低0.429，说明这两个居群亲缘关系最远，ns32与ns101居群之间遗传相似系数最高0.906，说明这两个样本之间亲缘关系最近，同时ql与ns32，ns101三个居群之间遗传相似系数变化范围0.656～0.906，xx与ys居群之间遗传相似系数0.664，因为ql与ns32，ns101三个样本均来自于同一样地宁陕，xx与ys两个样本来自于同一样地永顺，相似系数高，说明了遗传相似性分析结果的可靠性高。xy与ql居群之间遗传相似系数0.726，说明这两个居群亲缘关系近，这与这两个居群在地里上都位于陕西省是一致的。表明srap标记可以用来揭示材料间的亲缘关系的远近和材料间的遗传变异。树状图：不同居群：根据srap标记计算的遗传相似系数矩阵，按upgma法(非加权类平均法)构建了材料间的遗传关系聚类图。srap聚类图结果表明，遗传相似系数值约0.56时，可将所有供试材料划分为3大类：第i类群包含4个样本材料(xy、ql、ns32和ns101)，第ii类群包含5个样本材料(xx、ys、sk、xf、yn)，第iii类群只包含1份材料sn。从以上的聚类结果可以看出，同一地理位置的不同样本首先聚在一起：xy、ql、ns32和ns101聚在一起组成第i类群，xx,ys聚在一起，属于第ii类群，而sn单独组成第iii类群，表明sn居群与其他九个居群亲缘关系远，同时在进化树上首先区分出来，表明sn居群在进化位置上处于较原始位置。表明各种质的聚类结果与地理来源有明显的联系，同时也表明了地理来源也不能作为亲缘关系远近划分的唯一依据。总之，通过这种方法可以非常清晰和直观地说明各个居群之间的亲缘关系远近和聚类关系，为育种上面亲本选配提供理论依据，对我国瘿椒树新品种培育具有重要参考价值。不同居群不同性别：根据srap标记计算遗传相似系数矩阵，按upgma法构建了8个雄性dna池，9个两性dna池，共17个样本材料间的遗传进化关系树状图。结果表明，瘿椒树snb及sn两性为最原始的种群，而sn雄性则出现的较晚，暗示了瘿椒树种群现在的雄全异株繁育系统可能由两性祖先进化而来。同时sn雄性与sk雄性，两性,xf雄性，两性聚为第ii类群，表明其遗传关系接近，xy,ns32，ns101，yn这四个居群的雄性及两性聚为第i类群，表明这四个居群的雄性及两性遗传关系接近，而sn两性及snb单独为第iii类群，并且在进化上处于原始位置。对比例1：本对比例其他步骤同实施例1，不同点在于：本对比例步骤(2)中，所选取的引物对不同于表4和表5，对比例为以下引物的跑胶结果：a(f2r8)b(f7r3)c(f9r16)d(f19r20)。最终得到的条带如图6所示，a电泳无条带，b电泳条带不清晰，c电泳条带不利于数据统计，d电泳条带多态性差，用这些条带去进行后续的步骤，要么无法实施，要么得到的树状图不能正确反映瘿椒树的亲缘关系，其余本发明未选取引物跑胶结果均属于以上四种结果之一，或者以上四种结果组合，因此，引物是否正确在本发明的方法中显得很重要。<110>西北大学<120>瘿椒树亲缘关系鉴定方法<141><160><210>1<211>17<212>dna<213>上游引物ts-f1的核苷酸序列<220><223><400>15＇-tgagtccaaaccggata-3＇<210>2<211>18<212>dna<213>下游引物ts-r10的核苷酸序列<220><223><400>25＇-gactgcgtacgaattcat-3＇<210>3<211>17<212>dna<213>上游引物ts-f1的核苷酸序列<220><223><400>35＇-tgagtccaaaccggata-3＇<210>4<211>18<212>dna<213>下游引物ts-r17的核苷酸序列<220><223><400>45＇-gactgcgtacgaatttcg-3＇<210>5<211>17<212>dna<213>上游引物ts-f2的核苷酸序列<220><223><400>55＇-tgagtccaaaccggagc-3＇<210>6<211>18<212>dna<213>下游引物ts-r6的核苷酸序列<220><223><400>65＇-gactgcgtacgaattgca-3＇<210>7<211>17<212>dna<213>上游引物ts-f3的核苷酸序列<220><223><400>75＇-tgagtccaaaccggaat-3＇<210>8<211>18<212>dna<213>下游引物ts-r2的核苷酸序列<220><223><400>85＇-gactgcgtacgaatttgc-3＇<210>9<211>17<212>dna<213>上游引物ts-f4的核苷酸序列<220><223><400>95＇-tgagtccaaaccggacc-3＇<210>10<211>18<212>dna<213>下游引物ts-r12的核苷酸序列<220><223><400>105＇-gactgcgtacgaattctc-3＇<210>11<211>17<212>dna<213>上游引物ts-f5的核苷酸序列<220><223><400>115＇-tgagtccaaaccggaag-3＇<210>12<211>18<212>dna<213>下游引物ts-r4的核苷酸序列<220><223><400>125＇-gactgcgtacgaatttga-3＇<210>13<211>17<212>dna<213>上游引物ts-f6的核苷酸序列<220><223><400>135＇-tgagtccaaaccggaca-3＇<210>14<211>18<212>dna<213>下游引物ts-r6的核苷酸序列<220><223><400>145＇-gactgcgtacgaattgca-3＇<210>15<211>17<212>dna<213>上游引物ts-f10的核苷酸序列<220><223><400>155＇-tgagtccaaaccggaaa-3＇<210>16<211>18<212>dna<213>下游引物ts-r14的核苷酸序列<220><223><400>165＇-gactgcgtacgaattctt-3＇<210>17<211>17<212>dna<213>上游引物ts-f14的核苷酸序列<220><223><400>175＇-tgagtccaaaccggtcc-3＇<210>18<211>18<212>dna<213>下游引物ts-r11的核苷酸序列<220><223><400>185＇-gactgcgtacgaattcta-3＇<210>19<211>17<212>dna<213>上游引物ts-f15的核苷酸序列<220><223><400>195＇-tgagtccaaaccggtgc-3＇<210>20<211>18<212>dna<213>下游引物ts-r1的核苷酸序列<220><223><400>205＇-gactgcgtacgaattaat-3＇<210>21<211>17<212>dna<213>上游引物ts-f1的核苷酸序列<220><223><400>215＇-tgagtccaaaccggata-3＇<210>22<211>18<212>dna<213>下游引物ts-r10的核苷酸序列<220><223><400>225＇-gactgcgtacgaattcat-3＇<210>23<211>17<212>dna<213>上游引物ts-f2的核苷酸序列<220><223><400>235＇-tgagtccaaaccggagc-3＇<210>24<211>18<212>dna<213>下游引物ts-r6的核苷酸序列<220><223><400>245＇-gactgcgtacgaattgca-3＇<210>25<211>17<212>dna<213>上游引物ts-f5的核苷酸序列<220><223><400>255＇-tgagtccaaaccggaag-3＇<210>26<211>18<212>dna<213>下游引物ts-r4的核苷酸序列<220><223><400>265＇-gactgcgtacgaatttga-3＇<210>27<211>17<212>dna<213>上游引物ts-f10的核苷酸序列<220><223><400>275＇-tgagtccaaaccggaaa-3＇<210>28<211>18<212>dna<213>下游引物ts-r14的核苷酸序列<220><223><400>285＇-gactgcgtacgaattctt-3＇<210>29<211>17<212>dna<213>上游引物ts-f11的核苷酸序列<220><223><400>295＇-tgagtccaaaccggaac-3＇<210>30<211>18<212>dna<213>下游引物ts-r3的核苷酸序列<220><223><400>305＇-gactgcgtacgaattgac-3＇<210>31<211>17<212>dna<213>上游引物ts-f12的核苷酸序列<220><223><400>315＇-tgagtccaaaccggaga-3＇<210>32<211>18<212>dna<213>下游引物ts-r3的核苷酸序列<220><223><400>325＇-gactgcgtacgaattgac-3＇<210>33<211>17<212>dna<213>上游引物ts-f13的核苷酸序列<220><223><400>335＇-tgagtccaaaccggtta-3＇<210>34<211>18<212>dna<213>下游引物ts-r14的核苷酸序列<220><223><400>345＇-gactgcgtacgaattctt-3＇<210>35<211>17<212>dna<213>上游引物ts-f15的核苷酸序列<220><223><400>355＇-tgagtccaaaccggtgc-3＇<210>36<211>18<212>dna<213>下游引物ts-r1的核苷酸序列<220><223><400>365＇-gactgcgtacgaattaat-3＇<210>37<211>17<212>dna<213>上游引物ts-f17的核苷酸序列<220><223><400>375＇-tgagtccaaaccggtag-3＇<210>38<211>18<212>dna<213>下游引物ts-r12的核苷酸序列<220><223><400>385＇-gactgcgtacgaattctc-3＇<210>39<211>17<212>dna<213>上游引物ts-f20的核苷酸序列<220><223><400>395＇-tgagtccaaaccggtca-3＇<210>40<211>18<212>dna<213>下游引物ts-r19的核苷酸序列<220><223><400>405＇-gactgcgtacgaattagc-3＇当前第1页12