一种酶解法生产降血糖肽过程的实时监控方法与流程

本发明属于食品生物技术领域，具体涉及一种酶解法生产降血糖肽过程的实时监控方法，更具体地涉及利用拉曼光谱监控麦胚蛋白降血糖肽制备过程的方法。

背景技术：

随着经济水平的不断提高，人们饮食条件越来越好，然而缺乏运动以及不合理的生活作息，导致糖尿病的发病率逐年增加。长期高血糖会导致蛋白尿、高血压、动脉粥样硬化、神经系统病变和感染等并发症状，严重影响着人类健康。

α-葡萄糖苷酶抑制剂是一类抑制小肠内α-葡萄糖苷酶活性的物质，可以显著降低人们的餐后血糖。开发新型α-葡萄糖苷酶抑制剂是众多研究人员的努力方向。近年来，已有利用山杏、杂色蛤、蚕丝、蛋清和乳清原料制备降血糖肽的报道。

小麦是我国的主要粮食作物之一，麦胚是小麦加工过程中的副产品。麦胚虽然只在小麦麦粒中占1.3％～3.8％，但它是小麦籽粒中最重要的精华部分，麦胚中含有众多优质蛋白、脂肪和维生素矿物质等营养物，还含有多种具有生物活性的物质，如gsh、黄酮类物质、二十八烷醇、麦胚凝集素等，有着“人类天然营养宝库”的美称。近年来，随着国内外学者和企业对小麦麦胚中胚芽油和维生素e的开发利用。人们只看到小麦胚芽油的营养价值，却忽视了麦胚蛋白，它占全部麦胚质量的30％，长期以来没有得到很好的利用，因此是巨大的资源浪费，目前人们开始越来越关注脱脂麦胚的后加工处理。

研究表明，麦胚蛋白经胰蛋白酶水解后得到的多肽具有抑制α葡萄糖苷酶作用，有好的降血糖效果。目前已经建立一套完整的酶解制备、多肽分离纯化的工艺路线。蛋白质酶解是一个复杂的变化过程。由于受底物浓度、蛋白酶浓度、外界因素(超声波、微波等)影响，导致酶解反应终点控制难以进行，质量难以控制。降血糖肽的活性是通过生化的方法，检测其对α-葡萄糖苷酶的抑制效果。该方法耗时长，无法用于酶解反应的实时监控。

因此迫切需要建立一种快速监控酶解目标产物含量或活性的方法，以期获得更多高效的目标产物，将有利于提高降血糖肽产品的稳定性，确保产品质量的可靠性。此外，对于其他酶解反应过程的监控也有广阔的应用前景。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明通过在线获得酶解反应液的拉曼光谱，并对拉曼光谱进行一系列的处理，通过基线校正，退卷积分峰，非线性拟合，计算酶解反应液中蛋白的二级结构组成，将这些二级结构的变化与降血糖肽的活性建立关联，从而实现对酶解反应的实时监控，即提出一种酶解法生产降血糖肽过程的实时监控方法，本方法可以实现提高麦胚降血糖肽的产率，便于大规模生产的应用。

技术方案：为实现上述技术目的，本发明的酶解法生产降血糖肽过程的实时监控方法，包括如下步骤：

(1)采用旁路设置石英流动比色池的方法检测酶解液的拉曼光谱：

酶解反应池的酶解液通过泵由管路进入旁路的石英流动比色池，再经管路流回酶解反应池，激光光源经光纤耦合探头照射在石英流动比色池内的酶解液上，拉曼信号也经光纤耦合探头收集进入光谱仪，从而获得酶解液的拉曼光谱；

(2)拉曼光谱数据的处理：

对拉曼光谱进行剪切，范围1700～1645cm^-1，进行基线校正，采用二次多项式的平滑方法，窗口宽度5-11点；基线校正选择rubberband校正、基线点数48-64，傅立叶白退卷积选择lorentzian函数，其中，退卷积因子2、噪声减低因子0.5，退卷积结束进行基线校正，基线校正的参数同上；谱线拟合在1700～1645cm-1范围内分配9-15个拟合峰进行拟合，最终获得子峰，计算各子峰的面积；根据子峰的峰位，指认子峰所属的二级结构，最终计算出α-helix、random-coil、β-sheet和β-turn的组成比例，指认的规则是：1650～1660cm^-1为α-helix，1660～1665cm^-1为random-coil，1665～1680cm-1为β-sheet，1680～1700cm^-1为β-turn；

(3)建立二级结构组成比例与酶解蛋白抑制α-葡萄糖苷酶活性的模型：

采用非线性支持向量机(svm)的方法，建立酶解液蛋白二级结构的组成与其抑制α-葡萄糖苷酶活性的非线性支持向量机模型，其中，非线性支持向量机采用高斯核函数，根据训练集的留一法交叉验证来优化获得惩罚系数c、损失函数参数ε和高斯参数γ；

(4)对蛋白酶解液的α葡萄糖苷酶抑制率进行实时监控：

在酶解过程中，根据步骤(1)动态获得酶解液的拉曼光谱，根据步骤(2)解析拉曼光谱，获得蛋白二级结构的组成，通过步骤(3)获得的非线性支持向量机模型，计算得到酶解液对α葡萄糖苷酶的抑制率。

优选地，步骤(1)中激光光源的功率150w～300w。

具体地，所述的酶解液为麦胚蛋白酶解液。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：

(1)本发明通过采集降血糖肽的制备过程中的拉曼光谱，对其进行分析计算，能够得到酶解反应产物对α葡萄糖苷酶抵制活性，具有方便、速度快的优点。此外，在检测过程中，无需化学试剂，检测成本低，并且不会对环境造成污染。这些优点是湿化学检测方法无可比拟的。

(2)本发明方法能够提高工业化生产麦胚降血糖肽的质量，因而产品能够更好的降低糖尿患者的血糖浓度，提高了人们的健康水平，有极大的社会价值，同时也有巨大的经济价值。

(3)本发明方法不仅对于麦胚降血糖肽的制备有效，也对酶解方法制备其他功能性肽也有借鉴作用。

附图说明

图1为实施例1麦胚蛋白酶解后的拉曼图谱；

图2为实施例1拉曼图谱剪切后图谱；

图3为基线校正后图谱；

图4傅立叶自退卷积拟合图谱。

具体实施方式

本发明提供了一种拉曼光谱监控麦胚降血糖肽制备的方法，实现对麦胚降血糖肽制备过程的实时监控，便于工业化的高效生产和管理，对于产品质量稳定性、可靠性有重要的保障作用。

以下通过具体的实施例详细说明本发明。

实施例1

浓度0.8％(w/v)的麦胚蛋白溶液，加胰蛋白酶量5000u/g。采用超声酶解方法，超声波频率28khz，功率100。通过旁路石英流动比色池在5分钟内采集酶解液的拉曼光谱。图1是酶解5分钟时的拉曼光谱。

实施例2

对实施例1所获拉曼光谱在范围1700～1645cm^-1内进行剪切，结果如图2所示。基线校正，采用二次多项式的平滑方法，窗口宽度5点。基线校正选择rubberband校正、基线点数64，结果如图3所示。

傅立叶自退卷积选择lorentzian函数(退卷积因子2、噪声减低因子0.5，分配9-15个拟合峰进行拟合，最终获得子峰，如图4所示。

根据指认规则，最终计算出α-helix、random-coil、β-sheet和β-turn的组成比例分别为24.5％、11.9％、38.7％和24.7％。

实施例3

浓度0.8％(w/v)的麦胚蛋白溶液50ml，加胰蛋白酶量5000u/g。使用功率为60w，频率为65khz的超声波，在48℃下酶解，分别在0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50min采集样品的拉曼光谱。同时在这些时间点，取样，灭酶，检测酶解液的抑制；

参照实施例1和实施例2的方法，分别对在上述时间点的拉曼光谱在1700～1645cm^-1范围进行剪切，基线校正。采用二次多项式的平滑方法，窗口宽度5点。基线校正选择rubberband校正、基线点数64，傅立叶白退卷积选择lorentzian函数(退卷积因子2、噪声减低因子0.5)。在1700～1645cm-1范围内分配9-15个拟合峰进行拟合，最终获得子峰。计算各子峰的面积。根据子峰的峰位，指认子峰所属的二级结构，计算出α-helix、random-coil、β-sheet和β-turn的组成比例。

根据这些时间点的蛋白酶解液的二级结构的百分比为输入变量，酶解液对α葡萄糖苷酶的抑制率为目标值，非线性支持向量机(svm)的方法，建立麦胚酶解液与其对α葡萄糖苷酶抑制率的模型，其中，非线性支持向量机采用高斯核函数，根据训练集的留一法交叉验证来优化获得惩罚系数c、损失函数参数ε和高斯参数下，得到参数c，ε和下分别为1.61、-0.96、31.62。此模型较好，r²为0.95。

实施例4

浓度1％(w/v)的麦胚蛋白溶液50ml，加胰蛋白酶量25000u/g。使用功率为28w，频率为40khz的超声波，在48℃下酶解，在酶解17min时，采集样品的拉曼光谱。同时在该时间点，取样，灭酶，检测酶解液的抑制。

解析拉曼光谱，获得蛋白二级结构的组成，根据实施例3所建立的模型，计算得到酶解液对α葡萄糖苷酶的抑制率32.5％。采用化学方法检测降血糖肽对α葡萄糖苷酶的抑制率为31.3％，两者稳合度好。

以上仅是本发明的实施工艺，本发明不局限于上述实施例，凡依据本发明的技术实质对以上实施例做任何简单修改，等同变化与修饰，均落实在本发明要求的保护范围内。