专利名称：新型巴氏杆菌菌株的制作方法
新型巴氏杆菌菌株相关专利的交叉引用本申请要求于2009年1月沈日提交的第61/147，174号美国临时申请的权益，该申请的全部，包括所有的附图
、表格或图示。
背景技术：
据估计，目前植物寄生线虫对世界农业造成的作物损失每年超过1000亿美元。防止这种损害成为一个重大挑战。随着熏蒸剂甲基溴的即将减少，发展和注册用于线虫防治的新的合成化合物已迫在眉睫。植物病原线虫特别地难以控制是因为他们体外覆盖着一层厚厚的、不透水的角质层或虫体壁，并且具有极少数的感官神经元。由于许多害虫防治化合物是作为神经毒素使用，植物病原线虫暴露于体外的神经元的数量之少使得杀线虫化合物的有效目标面积减少，，结果导致具有极高神经毒素性能的杀线虫化合物的开发。此外，因为植物病原线虫存在于土壤或植物根部，所以将植物病原线虫暴露给防治试剂难以实现并且由于这些有毒的化合物的使用使得地下水位处于污染的危险中。基于神经毒素的杀线虫剂的使用已被证明污染地下和地表水。因此，为了公众健康原因，这些化合物中的许多正从市场上退出。肾形线虫，别名肾线虫(Rotylenchulus reniformis)，是线虫属中最具经济重要性的种类。雌性肾形线虫部分地生长在植物根部内，它们对植物的根系造成重大损害。术语“肾形的”是指成熟雌性线虫的肾形的身体。肾形还能致使植物对其他致病有机体更敏感。肾形线虫寄生于各种植物的根部，包括棉花，豇豆，甘薯，大豆，菠萝，茶，以及各种蔬菜例如番茄，秋葵，南瓜(squash)，和莴苣(lettuce)。肾形线虫的致病性对农业影响极大。例如，在美国路易斯安那州肾形线虫使棉花产量减少40 60%，同时伴随着枯萎病 (Fusarium wilt)的增力口。栽种前对土壤进行熏蒸是一种广泛采用的防治线虫的方法。甲基溴是使用最广泛的熏蒸剂之一，但由于其具有破坏臭氧性能，被提名停止使用。此外，这种土壤熏蒸法的实施不加选择地杀死土壤中的有机体，面临着在除去致病有机体的同时除去有益微生物的危险。在世界范围基础上，一种有效的、对环境有益的杀线虫剂的整体市场份额估计接近10 亿美元。早在1888 年，巴氏杆菌(Pasteuria)首次被 Metchnikoff (Annales de 1' Institut Pasteur2 :165-170)描述为水蚤的一种寄生细菌。随后，Cobb描述了一种 Ix ^ ii. Dorylaimus bulbiferous ^ Ei 1 If lif (Pasteuria) (2nd ed. Hawaiian Sugar Planters Assoc. , Expt.Sta. Div. Path. Physiol. Bull. 5 163-195,1906)。细菌的生命周期开始于内孢子粘合到土壤中线虫的角质层。巴氏杆菌在线虫体内增殖，并且经过几个已有记录的形态学阶段，包括菌丝结构和菌体，最终形成内孢子。当线虫体解体时内孢子被释放。细菌在线虫体内的生长减少或抑制线虫排卵，严重地限制了线虫繁殖的速率。宿主作物的经济损失通常是由线虫的第一子代造成的，这种损失可以利用巴氏杆菌通过降低植物根部区域子代线虫的含量而得到阻止的。尽管巴氏杆菌菌株已经在多种线虫种类上生成，例如南方根结线虫(Meloidogyne incognita) [Verdeho,S.禾口 R. Mankau. 1986. Journal of Nematology, 18 :635]禾口花生牛艮结线虫(Meliodogyne arenaria)[美国专利US6，919，197]，但是目前为止还没有在肾形线虫上观察到或成功地培育出巴氏杆菌菌株。
发明内容
本发明提供一种新的、有利的寄生于肾形线虫的巴氏杆菌菌株。该菌株已由美国菌种保藏委员会(American Type Culture Collection)保藏，保藏编号为ATCC PTA-9643。这些细菌能够产生具有独特的和有用的性能的内孢子，这些内孢子能够附着到线虫上，侵染线虫，在线虫体内生长并再生成孢子，并且杀死肾形线虫和其他植物致病线虫。本发明还包括所公开的巴氏杆菌菌株的突变体，这些突变体本质上具有相同的或改进的杀线虫性能。突变体的制造程序为微生物领域公知技术。例如，广泛应用紫外线和亚硝基胍达到突变目的。本发明进一步涉及所列举的微生物的变体。这些变体可以通过，例如多核苷酸序列，这些多核苷酸序列与来自所列举的分离的微生物的序列有高度同源性来识别，除此之外，这些变体与分离的微生物一样具有期望的防治肾形线虫的生物活性。本发明进一步包括组合物以及组合物防治植物致病线虫的应用，所述的组合物包含杀线虫有效量的所公开的巴氏杆菌菌株的内孢子。在一种实施方式中，一种植物种子首先用粘附剂处理，该粘附剂能够粘附巴氏杆菌孢子和/或包含孢子的组合物。这些粘附剂可以是，例如，一种胶和/或一种或多种聚合物或共聚物。粘附剂的例子包括但不限于胶(例如ELMERS 胶)、聚醋酸乙烯酯、硅树脂材料、以及天然的无机材料(例如硅胶和粘土)。本发明的另一个方面提供了一种种子，该种子至少在其部分表面包覆有巴氏杆菌组合物，其中巴氏杆菌组合物包含有效量的用于线虫防治的巴氏杆菌孢子。序列简要说明SEQ ID NO 1是根据本发明一种实施方式所得到的细菌的部分16S rDNA序列。SEQ ID NO 2是根据本发明一种实施方式得到的细菌的部分spoIIAB序列。SEQ ID NO :3是根据本发明提供的一种实施方式所得到的细菌的部分atpA序列。SEQ ID NO 4是根据本发明一种实施方式所得到的细菌的部分atpF序列。
具体实施例方式本发明的细菌新菌株具有防治包括肾形线虫在内的植物致病线虫的杀线虫活性。微生物培养物保藏于美国菌种保藏委员会(ATCC，10801University Blvd. ,Manassas, Va. 20110-2209)。保藏物于2008年12月4日保藏，已经由保藏中心指定ATCC序列登陆号 (accession number)为 PTA-9643。本发明培养物业已在确保在本专利申请由专利与商标专员根据37CFR 1. 14和 35U. S. C122条款决定是否授权的未决期间可以获得培养物的条件下保藏。当本申请的相应文件或其后续申请提交的国家的专利法有要求时，该培养物是可以获得的。然而，应当理解，培养物的可得性不构成破坏政府授予的专利权而实施本发明的许可。此外，本发明的培养保藏物将根据微生物保藏的布达佩斯条约的规定保藏并使公众可得到，即，保藏物将被悉心保藏，以在自最近一次请求提供保藏样本起至少五年的时间内保持其存活并不受污染，且无论任何情况下，在自保藏日起至少30年的时间内或在任何可以发放公开培养物的专利的实施期间保持其存活并不受污染。当有请求提供样本而保藏处由于保藏物的状态不能提供时，保藏者明白其有更换保藏物的责任。当一项公开保藏培养物的专利授权时，所有对于公众获得培养保藏物的限制将不能撤回地被取消。此处使用的“分离的”是指菌株被从它自然存在的环境中移走。因此，分离的菌株可以以，例如，一种生物学上的纯培养物，或以与农用载体相连的孢子(或其他菌株形式) 存在。此处使用的术语“包含”进一步仔细考虑这些方案，在这些方案中组合物和/或方
法由或基本上由列举的组分和/或步骤组成。此处使用的“基本上由......组成”是指下
述情况，该情况下增加的组分和/或步骤只是那些不影响组合物和/或方法的杀线虫活性的组分和/或步骤。此处使用的“杀线虫有效量”是指能够杀死，防治，或侵染线虫；延迟线虫生长或繁殖；减少线虫种群；和/或减少由线虫引起的作物损失的巴氏杆菌孢子量。在一个具体的实施方式中，本发明提供了巴氏杆菌菌株ATCC PTA-9643和它的突变体。突变体的制备程序是微生物领域公知的技术。例如，广泛应用紫外线和亚硝基胍来达到突变目的。该菌株已经被鉴定为新的巴氏杆菌菌株。SEQ ID NOs :1-4是本发明细菌的一些基因的多核苷酸序列。在另一个方面，本发明提供了具有杀线虫活性的巴氏杆菌ATCC PTA-9643的变体。 在一种实施方式中，一个“变体”具有一个多核苷酸序列，其在高严格度条件下与SEQ ID NO 1-4中至少一个，优选2，3或所有的4个序列杂交。“杂交”是指一个反应，该反应中一种或多种多核苷酸反应生成一个复合体，通过双链核酸分子(DNA-DNA，DNA-RNA，或RNA-RNA)中一个特定嘌呤和一个特定嘧啶之间的氢键使该复合体稳定。主要的特定配对为鸟嘌呤与胞嘧啶以及腺嘌呤与胸腺嘧啶或尿嘧啶。 各种等级的杂交严格度均可使用。条件越严格，复合结构就要求更高的互补性。条件的严格度可以通过温度，探针浓度，探针长度，离子强度，时间，等等来控制。优选地，杂交是在高严格度条件下通过本领域公知的技术实施的，该技术描述在， 例如，Keller, G. H.和 Μ. M. Manak 的《DNA Probes))和姐妹篇((DNA Probes =Background, Applications, Procedures》($禾中片反*，二片反，Nature Publishing Group，1993)。 ^ Cold Spring Harbor Laboratory Press 出片反白勺((Molecular Cloning manuals)) 中，包 舌 Sambrook 禾口尺ussell 的〈〈Molecular Cloning :A Laboratory Manual)) (2001)中有广泛描述。这些出版物中的每一种的整体内容通过引用并入本发明。用于杂交的高严格度条件的非限制性例子是，在65°C至少约6X SSC和1%SDS，先在约42°C下用含约20% (ν/ν)甲酰胺的0. IX SSC洗涤lOmin，然后在65°C下用0. 2X SSC 和0. 1% SDS洗涤。杂交条件的非限制性例子为低于特定溶液中特定序列的热熔点(Tm)约 1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，或 25°C。Tm 是取决于离子强度和PH的温度，在该温度下50%的目标序列杂交得到一个完全匹配探针。Tffl典型地随着Na+浓度增加而升高，因为钠阳离子会静电屏蔽核甘酸的磷酸根阴离子，并最小化他们之间的斥力。引入的洗涤可以是约5，10，15，20，25，30min,或更久一次，且如果需要可以增加严格度。Tffl的估算为本领域所公知。例如，熔点温度可能由下列公式描述(Beltz，G. Α.， ΚΑ. Jacobs,Τ. H. Eickbush,P. Τ. Cherbas,and F. C. Kafatos,Methods of Enzymology,R. Wu, L. Grossman and K. Moldave[eds. ]Academic Press, New York 100:266-285,1983)。Tm = 81. 5°C +16. 6Log[Na+] +0. 41 (% G+C) -0. 61 (% 甲酰胺)-600/碱基对中的复合长度(length of duplex)。一种更准确的Tm的估算可以通过最近邻模型获得。参见[Breslauer， et al. ， Proc.Natl. Acad. Sci. USA,83 :3746-3750(1986) ] 、 [SantaLucia, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 95 1460-1465 (1998)] > 文 ^ [All￡wi&&ffltaLuci￡i， Biochemistry 36 10581-94(1997)]以及[Sugimoto et al.，Nucleic Acids Res.，24 :4501-4505 (1996)]。 Tm也可以根据常规方法，通过在一种精选溶液中采用差示扫描量热法(Duguid et al., Biophys J，71 =3350-60,1996)，或者采用本领域公知的其他方法，例如紫外监测熔融进行测定。随着杂交条件的严格度增加，可以获得更高等级的同源性。可用于鉴定此处所述的DNA序列的存在的典型方法包括但不限于使用特定的寡核苷酸检测特定的DNA序列杂交，DNA直接测序，限制性内切酶降解，核糖核酸酶保护，化学裂解，以及连接酶介导检测法。巴氏杆菌ATCC PTA-9643的变体的一个例子是一种包含多核苷酸的菌株，该菌株超过85，90，95，98，或99%的序列与SEQ ID NOS :1_4中任何一个或全部序列一致。Fl-Atpase 的晶体结构由[Stocker 等，Structure, 15(8) :904-914(2007)]给出， 并且Fl-Atpase的功能已经得到了广泛研究，参见，例如[Itoh等.，“Mechanically driven ATP synthesis by Fl-Atpase, "Nature 427(6973) :407-8 Q004)]，以及其中引用的参考文献。在本发明某些实施方式中，atpA的变异序列编码的多肽保留了至少1处，2处，3 处,4处，5处或所有SEQ ID NO :4与来自分支巴氏杆菌(Pasteuria ramosa)的NCBI gi 93007315的相应部分的差异。spoIIAB 蛋白质是一种抗-σ 因子。参见[Duncan和 Losick，Proc Natl Acad Sci USA, 90 (6) :2325-2329(1993)] ο 多种晶体结构是可得的。参见[Masuda 等，J Mol Biol, 340(5) :941-956(2004)] ； [Campbell 等，Cell，108 (6) :795-807 (2002) ] 在本发明的某些实施方式中，spoIIAB的变异序列编码的多肽保留了至少1处，2处，3处，4处，5处或所有 SEQ ID NO :4 与来自穿刺巴氏杆菌(Pasteuria penetrans)的 NCBI gi 301732 和 / 或来自分支巴氏杆菌的NCBI gi93007308的相应部分的差异。大肠杆菌ATP合成酶b亚基的结构性和功能性数据被给出，例如在[Del Rizzo 等，J Mol Biol, 364(4) :735-46(2006)]；和[Claggett 等，J Bacteriol, 189 (15) M63-5471(2007)]。在本发明的某些实施方式中，atpF的变异序列编码的多肽保留了至少 1处，2处，3处，4处，5处或所有SEQ ID NO :3与来自穿刺巴氏杆菌的NCBI gi 41019057和 /或来自分支巴氏杆菌的NCBI gi93007313的相应部分的差异。在本发明的某些实施方式中，经常规的核糖体序列分析，寄生于肾形线虫的穿刺巴氏杆菌菌株，相比于任何目前已知的巴氏杆菌菌株，从系统发育上更接近于ATCC PTA-9643(或者，作为一种选择，相比于任何已知的非肾形线虫寄生的穿刺巴氏杆菌菌株， 更接近ATCCPTA-9643)。多种适用于16s rDNA分析的工具和数据是本领域已知的。由“nr” 数据库的NCBI Blast返回的下列序列登陆号提供了通过NCBI标识符(gi number)引用的 16s 核糖体序列:157357381 ； 145690675 ；55168340 ；215499254 ；29169172 ；197777542 ；
153816650；189353846 ；154483090 ；27360487 ；153816533 ；27359371 ；10039641 ；
153816651；153813776 ；169191254 ；77959837 ；223489039 ；224155181 ；197766214 ； 197782632 ；223475320 ；165924309 ；225111262 ；50363539 ；169189407 ；119632772 ； 167630417 ；147836457 ；321193 ；47570202 ；229499565 ；29565682 ；5531888 ；27360062 ； 197763227 ；121592110 ；227495267 ；3256603 ；197781048 ；154500167 ；154500794 ； 150251526 ；197735635 ；153813782 ；167425567 ；212632978 ；15921449 ；218151942 ； 163781875 ；169869672 ；78033426 ；157354103 ；40062645 ；115762746 ；83595848 ； 196018328 ；115379816 ；1780806 ；198417694 ；154500170 ；108707408 ；224033543 ； 223947683 ；226443382 ；237831283 ；195614328 ；194703406 ；212274346 ；149633895 ； 118086080 ；119178984 ；74007189 ；197768010 ；191162148 ；219461701 ；169213810 ； 167630416 ；19927 ；196018322 ；182701819 ；156341374 ；115467400 ；126433538 ； 119190145 ；56422945 ；50545958 ；223466311 ；212507121 ；197762411 ；169194840 ； 192291641 ；152012802 ；3831447 ；67903352 ；3256604 ；171686416 ；158294661 ；154273901 ； 119720343。在本发明的某些实施方式中，16s rDNA的变异序列编码的RNA保留了至少1 处，2处，3处，4处，5处，或所有与本段阐述的一种或多种(或任意组合)的16s rDNA的差异。在某些实施方式中，本段中用NCBI标识符表示的16srDNA可以从请求保护的发明中排除。大量的所述的细菌可以采用发酵技术生产。孢子形成自细菌的营养阶段后期发生，产生成熟的、休眠孢子。巴氏杆菌内孢子在干燥下不受损伤。因此，他们能在室温下长期储存。培育巴氏杆菌的方法为本领域所公知，并且包括，例如在US5，094，954和 US7, 067, 299中描述的方法，前述两个专利在整体上通过引用并入本发明。本发明进一步提供有益于害虫防治的细菌内孢子组合物。典型的例子是对线虫有致病性并在活的线虫组织内部或表面生长的细菌内孢子组合物。内孢子可以通过添加表面活性剂，分散剂，惰性载体和其他组分制成可湿性粉剂， 浓缩液体，颗粒剂(granules)或其他制剂，以获得一种杀线虫组合物，该组合物便于对特定目标线虫的处理和应用。商业成品总是具有高浓度的内孢子，典型地超过Ix IO7个孢子/ml或g干产品， 优选超过Ix IO9孢子/ml或g干产品。本发明所述的组合物还可以包括一种或多种下列成分其他杀虫剂，包括仅作用于地下的化合物；杀菌剂，如克菌丹，福美双，甲霜灵，咯菌腈，恶霜灵，以及这些材料的同分异构体，等等；除草剂，包括氨基甲酸盐、硫代氨基甲酸酯、乙酰胺、三嗪类、二硝基苯胺、甘油醚、哒嗪酮、尿嘧啶、苯氧羧酸类(phenoxys)、尿素和苯甲酸；除草安全剂，如苯并恶嗪、 二苯甲基衍生物、N, N-二烯丙基二氯乙酰胺、各种二卤代酰基、恶唑烷基和噻唑烷基化合物、乙酮类、萘酐化合物和肟衍生物；肥料；生物防治试剂，如其他选自下列自然产生或重组的细菌和真菌根瘤菌属、芽孢杆菌属、假单胞菌属、沙雷菌属、木霉属、球囊菌属、粘帚霉属和菌根菌属。这些制剂和应用过程为本领域公知，且与商业巴氏杆菌菌株一起使用。杀线虫化合物可以通过喷雾或涂敷于叶子表面来防治植物致病线虫。另外一种可以采用的方法是将内孢子混入颗粒剂中，非必需地包含一种引诱剂， 并将这些颗粒剂应用于土壤以防治土栖线虫。典型地，一接触水，孢子就从颗粒中释放，然后孢子附着到线虫上并侵染线虫，孢子接触并侵染线虫。制剂后的孢子也可以作为种子包衣应用于根部处理或植物整体处理。内孢子的应用量需具备有效杀线虫性。在一种实施方式中，内孢子量少于1夸脱 (quart)/英亩足以有效防治线虫。有利地，所述的组合物易于使用传统的应用设备进行应用。内孢子的作用方式使抗性演变不大可能发生。大部分可获得的杀线虫剂必须在栽种前施加于土壤中，因为这些化学品会在其他方面对植物造成伤害。相比之下，巴氏杆菌菌株不会对植物造成伤害，且可以在任意时间应用。本发明另一个方面提供了用本发明的巴氏杆菌组合物处理过的种子。一种实施方式提供的种子，至少在种子部分表面面积包覆巴氏杆菌组合物。在一种具体的实施方式中， 巴氏杆菌处理过的种子含有的孢子浓度为从约IO6至约IO9个孢子/粒种子。每粒种子含有的孢子量可以更多，例如1XIO10,1 X IO11或1 X IO12个孢子/粒种子。本发明材料和方法可以用于减少植物种类的损害，所述的植物种类包括但不限于，四季豆、草坪草、甘薯、西红柿、棉花、玉米、大豆、秋葵、莴苣、南瓜小果、蔬菜、菠萝、茶、 小麦、大麦、稻和油菜(Canola)。下面是实施例，用以举例说明实施本发明的步骤。这些实施例不应理解为是限制性的。所有的百分比是基于重量且所有溶剂混合比是基于体积，除非另有说明。实施例1-种子处理依照本发明，通过巴氏杆菌孢子包衣植物种子，巴氏杆菌孢子可以有效传递以防治植物致病性线虫。巴氏杆菌孢子可以随意地包到种子上或，优选地，先将巴氏杆菌孢子制成液体或固体组合物，然后包到种子上。例如，可以通过如下方法制备包含孢子的固体组合物将固体载体与孢子悬浮液混合，直到固体载体在孢子悬浮液中达到饱和。然后将混合物干燥获得期望的微粒(particles)。固体载体优选颗粒剂。颗粒剂可以是，例如，来自AXISbW硅藻土颗粒和/或来自 PROFILEb的绿色度粘土颗粒。各种添加剂，例如粘附剂、分散剂、表面活性剂及营养和缓冲成分，也可以包含在载体和孢子悬浮液混合物中。在一种具体的实施方式中，除孢子外，包衣可以进一步包含一层粘附剂层。所述的粘附剂应该是无毒的、生物可降解的，且带粘附性的。这样的材料包括但不限于，聚醋酸乙烯酯；聚醋酸乙烯酯共聚物；聚乙烯醇；聚乙烯醇共聚物；纤维素，例如甲基纤维素，羟甲基纤维素和羟甲基丙基纤维素；糊精；藻酸盐；糖；糖蜜；聚乙烯吡咯烷酮；多糖；蛋白质；脂肪；油；阿拉伯胶；明胶；糖浆和淀粉。更多的例子可以在例如美国专利US7，213，367中找到，该专利的整体内容以引用的方式并入本发明。粘附剂层可以帮助孢子附着在种子表面并阻止可能发生的脱落。此外，包衣还可以包含其他化学或生物试剂，所述的化学或生物试剂与巴氏杆菌孢子结合对防治线虫和/ 或其他害虫产生有益效果。包衣还可以包含有助于促进种子发芽、和/或植物生长和/或健康状况的肥料和其他成分。因此，本发明提供了一种在植物种子上形成巴氏杆菌包衣的方法。在一种具体实施方式
中，所述的方法包括，将含有饱和量的巴氏杆菌孢子的干燥的颗粒混合物与用粘附剂包衣的种子结合。尽管种子处理方法可以应用于任何生理状态的种子，但优选种子处于足够坚硬状态以使处理过程没有损害产生。典型地，从地里收割植物；从植物上取下种子；并且将种子与任何其他非种子植物材料分离。种子优选地在一定程度上具有生物学上的稳定性，以使得处理方法不会对种子造成生物学上的损害。在一种具体实施方式
中，例如，处理方法应用于已被收割、清理且干燥至水分含量按重量计低于约15%的玉米种子。在一种另一种实施方式中，在用巴氏杆菌孢子处理前或处理过程中，种子已经先被干燥，再用水和/或其他材料预处理，然后被再次干燥。在上述的限制内，处理方法可以在种子收获和种子播种之间的任意时间应用于种子。此处使用的术语“未播种的种子”是指包括在种子收获和出于种子发芽和植物生长的目的将种子播种下地之间的任意时期的种子。此处使用的，当提及未播种的种子用包含巴氏杆菌的组合物进行处理，，该处理方法并不包括那些将巴氏杆菌应用到土壤而非种子的实施方式。巴氏杆菌孢子典型地以杀虫剂制剂的形式应用于种子。这种制剂可以包含一种或多种其他需要的组分，包括但不限于液体稀释剂，粘结剂，在应力条件下保护种子的填充剂和增塑剂，以改善包衣的柔韧性、粘附力和/或覆盖性。此外，可以在制剂中加入干燥剂，如碳酸钙，高岭土或膨润粘土，珍珠岩，硅藻土或任何其他的吸附材料。这些组分在种子处理方法中的使用为本领域公知，参见，例如，美国专利US5，876，739。本领域普通技术人员，可以容易地从现有技术中选择需要的组分用于制剂。本发明所述的种子也可以用下列一种或多种成分处理其他杀虫剂，包括那些仅作用于地下的化合物；杀菌剂，如克菌丹，福美双，甲霜灵，咯菌腈，恶霜灵，以及每一种材料的异构体，等等；除草剂，包括选自下列物质的化合物草甘膦，氨基甲酸酯盐，硫代氨基甲酸酯，乙酰胺，三嗪类，二硝基苯胺，甘油醚，哒嗪酮，尿嘧啶，苯氧羧酸类(Phenoxys)，尿素和苯甲酸；除草安全剂，例如苯并恶嗪，二苯甲基衍生物，N, N-二烯丙基二氯乙酰胺，各种二卤代酰基、恶唑烷基和噻唑烷基化合物，乙酮类、萘酐化合物和肟衍生物；肥料；生物防治试剂，如其他自然产生或重组的细菌和真菌，选自根瘤菌属、芽孢杆菌属、假单胞菌属、沙雷菌属、木霉属、球囊菌属、粘帚霉属和菌根菌属。这些成分的加入方式可以是作为种子表面单独的层膜，或作为选择，可以作为巴氏杆菌组合物的组成部分。优选地，本发明用于种子处理的新组合物或其他成分的用量不应抑制种子萌发， 或对种子造成植物性毒素损害。本发明用于处理种子的制剂可以是悬浮液；乳剂；微粒在水性介质(例如水)中形成的浆体；可湿性粉剂；可湿性颗粒剂(干燥易流动)；和干燥颗粒剂。如果制成悬浮液或浆体，制剂中活性成分的浓度以重量计优选约0. 5%至约99% (w/w)，更优选5-40%或由本领域普通技术人员制成其他制剂。如上所述，本发明所述的制剂可以包含其他常规的无活性的或惰性的成分。这些惰性成分包括但不限于常规的粘着剂；分散剂比如甲基纤维素(例如，Methocel A15LV 或Methocel A15C，作为分散剂/粘着剂的组合试剂用于种子处理中)；聚乙烯醇(例 ta Elvanol 51-05)；卵磷脂(例如Yelkinol P)；聚合物分散剂(例如聚乙烯吡咯烷酮 /醋酸乙烯酯PVPIVA S-630)；增稠剂(例如，粘土增稠剂如Van Gel B，用于增加微粒悬浮液的粘度并减少微粒悬浮液的沉淀)；乳剂稳定剂；表面活性剂；防冻剂化合物(例如尿素)；染料；着色剂，等等。适用于本发明的另外的惰性成分可以在McCutcheon' s, vol.1, “ Emulsifiers and Detergents, “ MC Publishing Company, Glen Rock, N. J.，U.S.A.，1996中查到。适用于本发明的另外的惰性成分可以在McCutcheon' s, vol.2, “ Functional Materials, “ MC Publishing Company,Glen Rock,N. J. ,U. S. A., 1996中查到。本发明的包衣制剂可以通过多种方法应用于种子，所述的方法包括但不限于在一个容器(例如一个瓶子或袋子)中混合，机械涂覆，搅拌，喷涂和沉浸。根据本发明，多种活性或惰性材料可以用于使种子与杀虫剂接触，所述的活性或惰性材料是例如常规的薄膜包衣材料，包括但不限于水溶性薄膜包衣材料，如SEP I RET (S印pic，Inc.，Fairfield, N. J.)和 0PAC0AT (Berwind Pharm. Services, ffestpoint, Pa.)。本领域公知的种子包衣方法和组合物经由本发明一种实施方式中的添加物改性后是有用的。这些包衣方法和应用的设备公开在，例如，美国专利US5，918，413，5，891，246, 5，554，445，5，389，399，5，107，787，5，080，925，4，759，945 和 4，465，017 中。种子包衣组合物公开在，例如，美国专禾U US5, 939，356，5，882，713，5，876，739，5，849，320，5，834，447， 5，791，084,5，661，103,5，622，003,5，580，544,5，328，942,5，300，127,4，735，015, 4，634，587，4，383，391，4，372，080，4，339，456，4，272，417 和 4，245，432 等中。本发明适用的粘结剂优选地包含由一种粘性聚合物组成，所述的粘性聚合物可以是天然的或合成的，且对被包衣的种子没有植物性毒素影响。粘合剂可以选自聚醋酸乙烯酯；聚醋酸乙烯酯共聚物；乙烯醋酸乙烯酯共聚物(EVA)；聚乙烯醇；聚乙烯醇共聚物；纤维素，包括乙基纤维素，甲基纤维素，羟甲基纤维素，羟丙基纤维素和羧甲基纤维素；聚乙烯吡咯烷酮；多糖，包括淀粉，改性淀粉，糊精，麦芽糊精，藻酸盐和壳聚糖；脂肪；油；蛋白质， 包括明胶和玉米蛋白；阿拉伯胶；虫胶；偏二氯乙烯和偏二氯乙烯共聚物；木质素磺酸钙； 丙烯酸共聚物；聚乙烯丙烯酸酯；聚环氧乙烷；丙烯酰胺聚合物和共聚物；聚羟乙基丙烯酸酯；甲基丙烯酰胺单体；和聚氯丁烯。种子处理中使用的巴氏杆菌的量根据种子类型和活性成分的类型变化，但是处理方法包括使种子与用量可以有效杀虫的巴氏杆菌接触。此处使用的有效杀线虫的量是指巴氏杆菌的用量可以杀死线虫，或将一贯地减少或延迟线虫造成的损害量。处理方法所用的杀虫剂必须不会抑制种子萌发，且在会对种子或植物造成损害的线虫生命周期内应能有效地保护种子和/或植物。一般，包衣在播种后约Ih到120天内有效。杀虫剂形成的包衣优选的类型是能够使杀虫剂通过扩散或运动缓慢地从基体释放到周围介质中。
除包衣层外，种子可以用下列一种或多种成分处理其他杀虫剂，包括杀菌剂和除草剂；除草安全剂；肥料和/或生物防治试剂。这些成分可以作为单独的层加入或可供选择地添加于杀虫剂包衣层中。杀虫制剂可以采用多种技术和机器应用于种子，如流化床技术，滚压方法， rotostatic种子处理器(rotostatic seed treater)和鼓轮包衣机。其他方法，如喷动床 (spouted beds)也可以是有用的。种子在包衣前可以被预先测量尺寸。包衣后，典型地，种子被干燥，然后被输送到尺寸测量器测量尺寸。这些过程为本领域公知。巴氏杆菌处理后的种子可以再包覆一层薄膜外覆层用以保护包衣。这种外覆层为本领域公知，且可以使用流化床和鼓轮薄膜包衣技术涂覆。在本发明的另外一种实施方式中，巴氏杆菌孢子可以采用固体基质引发引到种子上。例如，将一些巴氏杆菌孢子与一种固体基质材料混合，然后将种子放入与固体基质材料接触一段时间使杀虫剂能够被引到种子上。然后，任选地种子可以从固体基质材料分离出来并储存或使用，或者固体基质材料与种子的混合物可以直接储存或种植。本发明适用的固体基质材料包括聚丙烯酰胺，淀粉，粘土，二氧化硅，氧化铝，土壤，沙，聚脲，聚丙烯酸酯， 或者可以吸收或吸附杀虫剂一定时间并释放杀虫剂到种子内或种子上的任何其他材料。确定杀虫剂和固体基质材料彼此相适应是有益的。例如，应当选择固体基质材料使其能够以合理的速率释放杀虫剂，例如在若干分钟、若干小时或若干天的时间内释放完毕。与细菌营养体不同，巴氏杆菌孢子不会受到干燥的损害，他们可以在室温下长期储存。因此，本发明的一个优势是干燥和其他在包衣方法中使用的苛刻步骤可以应用于本发明的种子包衣，且不会明显降低孢子的有效性。本发明种子的保存期限长，在种植时间安排上允许有变化。此外，在运输和一旦播种下地的期间，巴氏杆菌孢子的存活率要比细菌营养体高得多。一般而言，孢子的有效量范围是从约1 X IO5至1 X IO12 (或更多)个孢子/粒种子。 优选，孢子浓度为约IX IO6至IXlO9个孢子/粒种子。在一种实施方式中，为获得颗粒混合物，巴氏杆菌孢子与颗粒剂的比例为约 3 X IO7至5 X IO7个孢子/g颗粒剂。在一种具体的实施方式中，约3 5ml含有约2 X IO7 个孢子/ml缓冲液的巴氏杆菌孢子悬浮液加入到约2g颗粒剂中。比例随颗粒的类型而定。 例如，约5ml孢子悬浮液可以应用于2g AXIS 颗粒剂，而约3ml孢子悬浮液优选对应同样数量的PROFILE 颗粒剂。粘附剂可以是与种子和土壤生物适合的任何商业胶，例如包含聚醋酸乙烯酯的艾尔默透明培养胶(Elmer，s clear school glue)。如果孢子产于线虫宿主内，可以额外加一个热处理步骤以杀死线虫。热处理步骤可以在孢子悬浮液与颗粒剂混合前应用于孢子悬浮液。可供选择地，该步骤可以在颗粒混合物形成后应用。此处提及或引用的所有专利，专利申请书，临时申请和公开出版物通过引证的方式整体纳入本文中，包括所有的图示和表格，在一定程度上它们与本说明书的明确教导并不冲突。需要明确的是此处所描述的实施例和实施方式仅仅是为了解释说明的目的，本领域普通技术人员据此可提出各种修改或变化，且这些都将包括在本申请的精神和范围内。
权利要求
1.一种分离的巴氏杆菌菌株，保藏于ATCC，ATCC序列登录号为PTA-9643，或所述菌株为具有杀线虫活性的保藏菌株的突变体或变体。
2.如权利要求1所述的分离的巴氏杆菌菌株，其中菌株为所述保藏菌株的变体，其中所述的变体的多核苷酸序列至少90%与SEQ ID NOS :1_4中的一个一致。
3.如权利要求2所述的分离的巴氏杆菌菌株，其中所述的变体的多核苷酸序列至少 95%与 SEQ ID NOS :1_4 中的一个一致。
4.如权利要求3所述的分离的巴氏杆菌菌株，其中所述的变体的多核苷酸序列至少 95%与序列SEQ ID NOS :1_4中的每一个一致。
5.如权利要求1所述的分离的巴氏杆菌菌株，其保藏于ATCC，ATCC序列登陆号为 PTA-9643。
6.如权利要求1所述的分离的巴氏杆菌菌株，其具有防治肾形线虫活性。
7.一种杀线虫组合物，包含杀线虫有效量的权利要求1所述的巴氏杆菌菌株，和一种农用载体。
8.如权利要求7所述的组合物，其中所述的载体是一种种子处理剂。
9.一种防治线虫的方法，其中所述的方法包括使线虫与杀线虫有效量的权利要求1所述的巴氏杆菌菌株接触。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述的线虫为肾形线虫。
11.如权利要求9所述的方法，用于保护作物，所述的作物选自四季豆、草坪草、甘薯、 西红柿、棉花、玉米、大豆、秋葵、莴苣、南瓜小果、蔬菜、菠萝、茶、小麦、大麦、稻和油菜。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述的作物为棉花。
13.如权利要求9所述的方法，其中所述的巴氏杆菌菌株应用于土壤以防治土栖线虫。
14.如权利要求9所述的方法，其中所述的巴氏杆菌菌株在种植前或种植过程中应用。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述的巴氏杆菌菌株作为种子包衣应用。
全文摘要
本发明提供了一种新的且有益的巴氏杆菌菌株，该巴氏杆菌菌株对于肾形线虫具有杀线虫活性。本发明提供了被称为ATCC PTA-9643的新细菌培养物及其突变体。还提供了包含巴氏杆菌菌株或其突变体或变体的杀线虫组合物和用于处理植物致病性及土栖线虫的方法。
文档编号A01N63/02GK102317434SQ201080005264
公开日2012年1月11日 申请日期2010年1月26日 优先权日2009年1月26日
发明者J·P·沃特斯, T·E·休利特 申请人:巴斯德生物科学有限公司