专利名称：植物生长调节剂在增强藻类生长中的应用的制作方法
植物生长调节剂在增强藻类生长中的应用相关申请的引用本申请根据35U. S. C. § 119(e)要求于2009年1月13日提交的美国临时专利申请系列号61/204，920 (其完整内容在此引作参考)的优先权。
背景技术：
藻类是地球上最丰富的、分布最广的物种之一。目前已知的藻类超过150，000种， 可能更多的种类还有待发现。对于大多数藻类的种，尽管已知其基本区别特征和品性，但关于如何在总体生命分类中分类所有不同的藻类种仍然存在一定的不确定性。藻类(包括许多不同大小和颜色的植物样形式，硅藻类和蓝藻菌)构成地球上生命的最重要的类群之一，负责我们大部分的大气，并构成许多其他生物形式的食物链的基础。围绕藻类或与藻类共生地进化的整个生态系统和藻类环境包括食物源、掠食者、病毒和许多其它我们一般与高等生命形式相关联的环境因素。尽管藻类有着这样的重要性和范围外，但是人类的直接利用有限。特别在亚洲，作为食物栽培或收获藻类，经常为“海草”的形式。藻类也广泛地用于生产诸如色素和食物添加剂的多种成分。藻类也被用于工业化处理，以浓缩和去除重金属污染，被称之为硅藻土的硅藻残余物被用作过滤介质以及用于其它用途。藻类也可以生产油料、淀粉和气体，它们可以用于生产柴油燃料、醇(例如乙醇) 和氢气或沼气。虽然其它生物材料也可以生成这些燃料，但藻类的特点是高产率和理论上的低成本。藻类的生长速度可比其它形式的植物快10到100倍。藻类也能在生产所期望的油和淀粉方面有高产率，在某些情况下，这些形式的产量可达它们本身重量的60%之多。除了高产量的好处以外，利用藻类生产生物产品不会和农业竞争耕地，它既不需要农田也不需要淡水。而且因为藻类是光自养生物，所以它们使用最基本的输入就能够达到所有这些，在大部分情况下只需要阳光、水、空气、二氧化碳和简单营养物。尽管藻类作为燃料来源的潜在好处是不言而喻的，但实际上由于多种原因过去的尝试遇到了挫折和困难。例如，藻类细胞的最佳增殖条件就没有明确定义，通常不同于增值生物产品(例如，油/脂质或者多糖)的最佳生产所需要的。发明概述本发明提供了使用某些植物生长调节剂(例如，生长激素)调节藻类生长的系统和方法，例如，为了生产增值生物产品(例如，油或淀粉)的目的。因此本发明的一方面提供了增强藻类细胞增殖的方法，包括在植物生长调节剂或其模拟物的存在下培养该藻类，以增加藻类细胞数。在特定的实施方式中，藻类的细胞数至少增加了大约5 %、10 %、20 %、50 %、75 %、 2-倍、5-倍、10-倍、20-倍、50-倍、100-倍、500-倍、1000-倍、IO4-倍(41ogs)、105-倍 (51ogs)、106-倍(61ogs)、107-倍(71ogs)、IO8-倍(81ogs)、IO9-倍(91ogs)或者更多。在特定的实施方式中，藻类细胞的分裂速率至少增加了大约S^UO^JO^、 50%,75%,100%,200%,500%U, 000%等等或者更多。
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在特定的实施方式中，在该培养条件下，藻类培养的群体倍增时间是大约0. 05-2天。在特定的实施方式中，植物生长调节剂包括选自植物生长素(Auxin)、细胞分裂素 (Cytokinin)、赤霉素(Gibberel 1 in)和/或其混合物的至少一种、两种、三种、四种、五种或更多种生长激素。优选地，生长激素包括选自植物生长素、细胞分裂素或赤霉素的每种激素种类/类别的至少一种或两种。例如，植物生长素包括吲哚乙酸(IAA)和/或1-萘乙酸(NAA)。其它植物生长素模拟物可以是2，4-0;2，4，5-1~;吲哚-3-丁酸(IBA) ；2-甲基-4-氯苯氧基乙酸 (MCPA) ；2-(2-甲基-4-氯苯氧基)丙酸(mecoprop，MCPP) ； (2，4- 二氯苯氧基)丙酸 (dichloroprop，2，4-DP)；或者(2，4-二氯苯氧基)丁酸(2，4-DB)。在特定的实施方式中，赤霉素包括GA3。在特定的实施方式中，细胞分裂素是腺嘌呤型细胞分裂素或苯脲型细胞分裂素。 例如，腺嘌呤型细胞分裂素或模拟物可以包括激动素(kinetin)、玉米素(zeatin)和/或 6-苄氨基嘌呤，苯脲型细胞分裂素可以包括二苯脲和/或噻苯隆(TDZ)。在特定的实施方式中，植物生长调节剂进一步包括维生素Bl或其类似物/模拟物。在特定的实施方式中，仅有一种所述生长调节剂(例如植物生长素家族的生长调节剂或细胞分裂素家族的生长调节剂)用于藻类生长。在特定的实施方式中，使用一种以上的所述生长调节剂。在特定的实施方式中，至少使用一种植物生长素家族的生长调节剂和至少一种细胞分裂素家族的生长调节剂，该至少一种植物生长素和该至少一种细胞分裂素的重量比大约为1 2到2 l(w/w)，优选为约1 l(w/w)。在特定的实施方式中，植物生长素和赤霉素的比例(w/w)大约为1 2到 2 1，优选为约1 1。在特定的实施方式中，植物生长素和维生素Bl的比例(w/w)大约为1 4到1 1，优选为约1 2。在特定的实施方式中，所述模拟物是苯氧乙酸化合物。在特定的实施方式中，所述方法进一步包括在含有最佳细胞增殖所需的无限制水平的营养物和微量元素的培养基中培养藻类。在特定的实施方式中，营养物包括一种或者多种炭、氮、磷、硫和/或氧源。优选地，营养物的浓度对细胞的分裂和/或生长是无毒的。在特定的实施方式中，培养基可以包括厌氧生物消化物(biodigestate)的液态分离物(separation)，需要时任选地补充额外的营养物。厌氧生物消化物可以由动物内脏、 家畜粪便、食品加工废物、市政废水、酒糟水、酒糟(distiller's grains)、或者其它有机物的厌氧消化产生。在特定的实施方式中，营养物的浓度对细胞的分裂和/或生长是无毒的。在特定的实施方式中，藻类在细胞分裂的最适温度下培养，对非嗜热藻类来说最适温度在大约0-40°C之间，而对嗜热藻类来说则在大约40-95°C，或者大约60-80°C之间。在特定的实施方式中，藻类在生物反应器中培养。优选地，生物反应器适应于最佳的细胞增殖。优选地，生物反应器可以灭菌。在特定的实施方式中，藻类利用异养、光异养或者自养的生理机制代谢。
在特定的实施方式中，藻类是杂色藻类(Chromophytes)、优选绿藻类 (Chlorophytes)或者硅藻类(Bacillariophytes) 0在特定的实施方式中，藻类是小球藻(Chlorella sp.)(例如普通小球藻(Chlorella vulgaris))、Auxenochlorella sp. (Auxenochlorella protothecoides)、棚藻(Scenedesmus sp.)禾口 Ankistrodesmus sp，等等。在特定的实施方式中，藻类具有无藻壳(frustule)的形式。在特定的实施方式中，藻类不是褐藻(Phaeophyceae)或者红藻。在特定的实施方式中，藻类不是破囊壶菌 (Thraustochytriales)0本发明的另一方面提供用于生产藻类产品的方法，包括在植物生长调节剂或其模拟物的存在下培养藻类，以积累藻类产品。在特定的实施方式中，藻类细胞数增加不超过大约1,000^^300^^200^^100% 或者50%。在特定的实施方式中，藻类的生物质显著增加。例如，在特定的实施方式中，藻类的生物质至少增加大约5%、10%、20%、40%、60%、80%、100%、150%、200%。在特定的实施方式中，由于所述的藻类产品积累，藻类的生物质大量增加。在特定的实施方式中，藻类在氮限制的培养基或含有为藻类产品合成优化的氮水平的培养基中培养。在特定的实施方式中，植物生长调节剂包括一种油刺激因子。例如，油刺激因子可以包括腐殖酸盐，例如黄腐酸(fuvic acid)或者腐殖酸。在特定的实施方式中，藻类在生物反应器中培养。优选地，生物反应器适应于藻类产品的最佳生产。在特定的实施方式中，藻类产品是油或者脂质，如包含Omega-3、0mega-6和/或 0mega-9的藻类产品。在特定的实施方式中，藻类产品是淀粉(或者多糖)。当期望的藻类产品是淀粉或者多糖时，藻类优选地不经受氮限制的生长条件。本发明的另一方面提供适合本发明的藻类生长过程的系统。优选地，生物反应器可以灭菌，以在异养和光异养的条件下促进未污染的藻类生长。可预期的是这里所描述的所有实施方式可以和其它实施方式的特征相组合，无论是否适合。附图简述
图1显示在用0. 酵母提取物和0. 5%葡萄糖改良的布氏(Bristol，s)培养基中生长7天的对照普通小球藻(Chlorella vulgaris)。图2显示在用0. 酵母提取物、0. 5%葡萄糖和黄腐酸改良的布氏培养基中生长 7天的普通小球藻。图3显示原壳小球藻(Chlorella protothecoide)在存在或不存在植物生长调节剂组合的条件下的示例生长曲线。图4显示原壳小球藻在存在或不存在植物生长调节剂组合的条件下的示例生长曲线。图5显示原壳小球藻在存在或不存在植物生长调节剂组合的条件下的示例生长曲线。
图6显示原壳小球藻在存在或不存在植物生长调节剂组合的条件下的示例生长曲线。发明详述本发明的一个方面部分地基于发现藻类生长(例如，在指数生长期或指数生长后期的细胞增殖)可以被特定的植物生长调节剂或其模拟物所刺激。所以本发明的一个方面提供一种增强藻类细胞增殖的方法，包括在植物生长调节剂或其模拟物的存在下培养藻类，以增加藻类细胞数。植物激素或调节剂影响植物中的基因表达和转录水平、细胞分裂和生长。人类合成了大量的相关化合物，并用于调节栽培的植物、杂草、体外生长的植物和植物细胞的生长。这些人造化合物有时叫作植物生长调节剂，或简称为PRG。这些合成的调节剂可以和自然存在的调节剂相同，或者可以包含在自然界中未曾发现的化学修饰。这里所使用的“生长激素(或其模拟物)，，包括天然的植物激素和人造/合成的调节剂、其模拟物或者衍生物。 优选地，生长激素/调节剂、或其模拟物至少在一种浓度下刺激藻类生长，优选地在与下列实施例(例如，实施例3到7)所使用的类似或者相同的条件下。术语“生长激素”和“生长调节剂”在这里可以交换使用。大体上，植物激素和调节剂分为5大类，其中一些由许多不同的化学物质构成，这些化学物质在植物与植物之间在结构上可能不同。基于它们的结构相似性和它们对植物生理学的效应，这些化学物质各自被一起归入这些类别之一。另外的植物激素和生长调节剂不容易归入这些类别。恰恰相反，它们天然存在或由人类或其它生物体所合成，包括抑制植物生长或者中断植物体内的生理过程的化学物质。这五种主要的类别是脱落酸(也被称为ABA)；植物生长素；细胞分裂素；乙烯； 和赤霉素。其它已鉴定的植物生长调节剂包括油菜素内酯类(Brassinolides)(与动物甾醇激素在化学结构上类似的植物留醇。它们促进细胞伸长和细胞分裂、木质部组织分化和抑制叶片脱落)；水杨酸(在某些植物中激活基因，产生帮助抵御病原性侵入物的化合物)； 茉莉酸类(Jasmonates)(由脂肪酸生成并似乎促进生成用于抵御入侵生物体的防御蛋白质。据信它们也在种子萌发中有作用，并且影响种子中蛋白质的储存，还似乎影响根的生长)；植物肽激素类(包括所有的参与细胞与细胞之间信号传导的分泌小肽。这些小肽激素在植物生长和发育中起重要作用，包括防御机制、控制细胞分裂和膨胀以及花粉自交不亲合性)；聚胺类(迄今在所有已研究的生物中均发现的低分子量强碱性分子。它们在植物生长和发育方面有重要作用，并影响有丝分裂和减数分裂的过程)；一氧化氮(NO)(在激素和防御应答中作为信号)；独脚金萌发素内酯(Strigolactones)(与抑制芽分枝有关)。PRG的脱落酸类别包括通常在植物叶子中生成的一种化合物，该化合物来源于叶绿体，特别是在植物处于应激时。一般而言，他作为一种抑制性的化合物影响芽生长、种子和芽休眠。植物生长素是能正面影响细胞扩大、芽形成和发根的化合物。它们也促进其它激素的生成，并且与细胞分裂素联合，它们控制茎、根和果实的生长，并把茎转化为花。植物生长素通过改变细胞壁的塑性来影响细胞的伸长。植物生长素水平在光照下下降，在黑暗中上升。在高浓度下，植物生长素对植物具有毒性；它们对双子叶植物毒性最大，但对单子叶植物毒性小些。由于此特性，已经开发了包括2，4-D和2，4，5-T在内的合成植物生长素除草剂并用于杂草控制。植物生长素，特别是1-萘乙酸(NAA)和吲哚-3-丁酸(IBA)，通常也应用于在植物扦插时刺激根的生长。在植物中最常见的植物生长素是吲哚乙酸或IAA。植物生长素家族中最重要的一个成员是吲哚-3-乙酸(IAA)。在整株植物中，它产生植物生长素效应的主要部分，并是一种最有效的天然植物生长素。然而，IAA分子在水溶液中化学不稳定。其它自然存在的植物生长素包括4-氯吲哚乙酸、苯乙酸(PAA)和吲哚-3- 丁酸(IBA)。常见的合成植物生长素类似物包括1-萘乙酸(NAA) ,2,4- 二氯苯氧乙酸Q，4-D)等等。下面示出了几种可在本发明中应用的示例性的(非限制性的)自然和合成的植物生长素。
权利要求
1.一种增强藻类细胞增殖的方法，包括在一种或多种植物生长调节剂、其模拟物、或其混合物的存在下培养所述藻类，以增加藻类细胞数。
2.权利要求1的方法，其中藻类细胞数至少增加约5%UO^dOW.50^^75%、2倍、5 倍、10 倍、20 倍、50 倍、100 倍、500 倍、1000 倍、IO4 倍、IO5 倍、IO6 倍、IO7 倍、IO8 倍、IO9 倍或以上。
3.权利要求1的方法，其中藻类细胞分裂的速度至少增加约5^UOW .20^^50%、 75%、100%、200%、500%、1000% 或更多。
4.权利要求1的方法，其中藻类培养的群体倍增时间是大约0.05-2天。
5.权利要求1的方法，其中所述植物生长调节剂包括至少一种、两种、三种、四种、五种或更多种选自植物生长素、细胞分裂素、赤霉素和/或其混合物的生长激素。
6.权利要求5的方法，其中所述植物生长素包括吲哚乙酸(IAA)和/或1-萘乙酸 (NAA)。
7.权利要求5的方法，其中所述赤霉素包括GA3。
8.权利要求5的方法，其中所述细胞分裂素是腺嘌呤型细胞分裂素或苯脲型细胞分裂ο
9.权利要求8的方法，其中所述腺嘌呤型细胞分裂素包括激动素、玉米素和/或6-苄氨基嘌呤，所述苯脲型细胞分裂素包括二苯脲和/或噻苯隆(TDZ)。
10.权利要求1的方法，其中所述植物生长调节剂还包括维生素Bl或其类似物/模拟物。
11.权利要求5的方法，其中所述植物生长素与细胞分裂素的比例(w/w)约为1 2至 2 1 (w/w)，或约 1 1 (w/w)。
12.权利要求5的方法，其中所述植物生长素与赤霉素的比例(w/w)约为1 2至 2 1 (w/w)，或约 1 1 (w/w)。
13.权利要求1的方法，其中所述模拟物是苯氧乙酸化合物。
14.权利要求1的方法，还包括在含有非限制水平的营养物和最佳细胞增殖所需的微量元素的培养基中培养所述藻类。
15.权利要求14的方法，其中所述营养物包括一种或多种C、N、P、S和/或0源。
16.权利要求14的方法，其中所述营养物的浓度对于细胞分裂和/或生长是无毒的。
17.权利要求1的方法，其中所述藻类在细胞分裂的最适温度下培养，所述最适温度的范围对于非嗜热藻类为约0-40°C，对于嗜热藻类为约40-95°C，或约60-80°C。
18.权利要求1的方法，其中所述藻类在生物反应器中培养。
19.权利要求18的方法，其中所述生物反应器适合灭菌。
20.权利要求18的方法，其中所述生物反应器适应于最佳的细胞增殖。
21.权利要求1的方法，其中所述藻类利用异养、光异养或自养的生理机制代谢。
22.权利要求1的方法，其中所述藻类是杂色藻类。
23.权利要求1的方法，其中所述藻类是绿藻类或硅藻类。
24.权利要求1的方法，其中所述藻类具有无藻壳的形式。
25.权利要求1的方法，其中所述藻类不是褐藻(褐藻科)或红藻。
26.权利要求1的方法，其中所述藻类不是破囊壶菌。
27.—种生产藻类产物的方法，包括在植物生长调节剂或其模拟物的存在下培养藻类， 以积累藻类产物。
28.权利要求27的方法，其中藻类细胞数增加不超过一个log(1000%) ,300% ,200%, 100%或 50%。
29.权利要求27的方法，其中藻类生物质显著增加。
30.权利要求四的方法，其中藻类生物质增加至少约20%、40%、60%、80%、100%、 150%、200%。
31.权利要求四的方法，其中由于所述藻类产物的积累，藻类生物质大大增加。
32.权利要求27的方法，其中所述藻类在氮限制培养基(例如，约1.5-15mgN/L)或含有为藻类产物合成优化的氮水平的培养基中培养。
33.权利要求27的方法，其中所述植物生长调节剂包括油刺激因子。
34.权利要求33的方法，其中所述油刺激因子包括腐殖酸盐，如黄腐酸或腐殖酸。
35.权利要求27的方法，其中所述藻类在生物反应器中培养。
36.权利要求35的方法，其中所述生物反应器适合灭菌。
37.权利要求35的方法，其中所述生物反应器适应于藻类产品的最佳生产。
38.权利要求27的方法，其中所述藻类产品是油或脂质。
39.权利要求38的方法，其中所述藻类产品包括0mega-3、0mega-6和/或Omega-9。
全文摘要
本发明提供了通过使用植物生长调节剂(如生长激素、吲哚乙酸等等)和激素模拟物(苯氧乙酸化合物等等)提高自养、异养或光异养地生长的藻类产生生物质的方法。植物调节剂或其模拟物可进一步提高藻类培养物或收获的生物质中所期望的增值产品(诸如，生物柴油或淀粉)的比例。
文档编号A01H13/00GK102281756SQ201080004502
公开日2011年12月14日 申请日期2010年1月8日 优先权日2009年1月13日
发明者B·柯特克, M·S·布里尔, R·E·布里尔, W·麦卡费 申请人:α-J研究有限合伙公司