专利名称：用于增强免疫应答的方法和含有mTOR抑制剂的组合物的制作方法
技术领域：
本发明主要涉及调控免疫应答，并且更具体地，涉及采用哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抑制剂来增强个体中细胞介导的免疫应答。
背景技术：
在临床和临床前研究中正在积极评估癌症疫苗。理论上，招募免疫系统来攻击癌症是有吸引力的。免疫系统能够识别肿瘤特异性抗原，并且消除病变细胞，而对正常组织没有影响。然而，用癌症疫苗来治疗患者的成功应用还难以实现，并且在增强癌症疫苗的功效方面的研究正在进行中，这一需求尚未得到满足。
发明简述本发明提供了增强疫苗功效的组合物和方法。在一个实施方式中，本发明提供了一种增强个体中对一种抗原的免疫应答的方法。所述方法包括给予个体所述抗原以及mTOR 抑制剂。mTOR抑制剂和抗原可以作为或不作为同一组合物的组分给予，并且可以同时或依次给予。优选在给予抗原后给予所述mTOR抑制剂。在另一个实施方式中，本发明提供了一种包含分离的CD8+T细胞群和mTOR抑制剂的组合物。所述组合物还含有⑶8+T细胞所特异性针对的抗原，并且还可包含佐剂，例如 IL-12。免疫应答增强可以包括针对个体中带有所述抗原的细胞的细胞介导的免疫应答增强。应答增强可包括表现出针对带有所述抗原细胞的细胞毒性的CD8+T细胞增加。免疫应答增强也可或任选地包括表现出维持能力提高和/或对所述抗原的抗原召回应答提高的CD8+T细胞，或特异性针对所述抗原的效应CD8+T细胞的数量增加和/或活力提高。这些免疫应答的组合还可由本发明的组合物和方法来引发。免疫应答增强可以表现为在个体中抑制表达所述抗原的细胞的生长，表达抗原的细胞死亡，和/或通过延长个体的存活，或本领域技术人员已知的任何其他方式。在各种实施方式中，用本发明的方法和组合物治疗的个体是需要增强对一种抗原的免疫应答的个体。所述个体可为此前没有接受过mTOR抑制剂的个体。这种个体的例子包括但不限于已经做过针对如器官移植的免疫抑制治疗的个体。在一个实施方式中，个体为需要治疗癌症的个体。预期本发明可以适用于与任何mTOR抑制剂一起使用，且适用于增强针对能被递呈给CD8+T细胞的任何抗原的细胞介导的免疫应答(其可包含或不包含体液免疫应答和/或先天免疫应答)。 附图简述
图1、引导天然CD8+T细胞进行I型效应细胞成熟的指令增强且维持mTOR的活力。 (A和B)评估用BOK(抗原+B7. 1) (士) IL-12刺激的OT-I细胞，(A)用ICS评估IFN- γ和
(B)细胞毒性(初级，刺激后72小时；次级，二次刺激后M小时)<0. 0002。(C-E) 用抗原(Ag)(所述抗原为包含在kr lie Ile后有Asn Phe Glu、其后有Lys和Lue的肽 (OVAp)，用量为 IOnM)加 B7. 1 (100 μ g/ml)(抗原+B7. 1) (士)IL-12 Qng/ml)刺激的 0Τ-Ι 细胞，在指定时间点用ICS评估(C)磷酸化的mTOR，⑶磷酸化的S6K，以及(E)磷酸化的核糖体S6。为了抑制mTOR，在加入抗原、细胞因子前30分钟加入雷帕霉素(20ng/ml)。数据代表具有类似结果的至少3个独立实验(数据用平均值士 SEM表示)。图2、IL-12通过PII和STAT4增强抗原诱导的mTOR活性。
(A和B)以ICS评估用抗原+B7. 1(士)IL-12和LY^4002(10yM)刺激的OT-I细胞， (A) 48小时时磷酸化的Akt，或⑶在指定时间点磷酸化的S6K。(C)野生型或Matf—OT-I 细胞在有或没有IL-12存在下用抗原+B7. 1刺激，在指定时间点分析磷酸化的S6K ；***p < 0.0001。所示实验代表具有类似结果的三个独立实验。(数据用平均值士 SEM表示)。图3、持续的mTOR活性是⑶8+T细胞的遗传性I型效应细胞分化所必需的。(A-C) 在抗原+B7. 1 (士)IL-12和雷帕霉素刺激的OT-I细胞中用ICS评估初级期和次级期的(A) IFN- Y ； ‘ **p < 0. 0002 ；η. s.，不显著；(B)溶细胞活力；或(e)用ICS评估72小时时的颗粒酶B表达。(D和E)用抗原+B7. 1 (士) IL-12刺激OT-I细胞，并且在刺激12小时后加入雷帕霉素，以评估细胞的(D)48小时时的S6K磷酸化，和(E)在初级期和次级期的IFN-Y 产生。所示实验代表具有类似结果的至少3个(A和B)和2个(C-E)独立实验(数据用平均值士 SEM表示)。图4、IL-12-增强的mTOR磷酸化是⑶8+T细胞的T_bet决定的I型效应细胞成熟所必需的。(A-C)用抗原+B7. 1 (士) IL-12和雷帕霉素刺激的OT-I细胞，(A)用RT-PCR评估在指定时间点的T-bet的mRNA，⑶用ICS评估在指定时间点的T_bet蛋白表达，以及
(C)在抗原召回前后用ICS评估T-bet蛋白表达。**p< 0. 0035 ；***p < 0. 0005。(D)用抗原 +B7. 1 (士)IL-12刺激野生型和TbUl+ OT-I细胞，并且评估在初级期和次级期的IFN- γ 产生。***ρ < 0. 0001。(Ε和F)用抗原+Β7. 1 (士)IL-12和雷帕霉素刺激的OT-I细胞，转入 T-bet-ER逆转录病毒载体(士)4-HT (IOnM)，并且用ICS评估(E) T_bet蛋白表达，以及(F) 在次级期(168小时)的IFN-y. (G和H)用抗原+B7. 1(士)胰岛素(lU/ml)和雷帕霉素刺激的OT-I细胞，用ICS评估(G) 48小时时的S6K磷酸化以及(H) 72小时时的T_bet表达。 所示实验代表至少3个(A，B, D，E和F)和2个(C，G和H)具有类似结果的独立实验(数据用平均值士 SEM表示)。图5、抑制mTOR促进CD8+T细胞中持续的Eomes表达和记忆表型标记物。(A和B)用抗原+B7. 1 (士)IL-12和雷帕霉素刺激OT-I细胞，(A)在指定时间点用RT-PCR评估Eomes的 mRNA，以及(B)用ICS评估在72小时时的Eomes蛋白表达。Y <0. 03。(C)用抗原+B7. 1(士) IL-12和雷帕霉素刺激的OT-I细胞，转入T-bet-ER逆转录病毒载体(士)4_HT (IOnM)，并且在96小时时评估Eomes蛋白表达。(D)用抗原+B7. 1 (士)IL-12和雷帕霉素刺激OT-I细胞，并在72小时时评估CD62L、CD69、KLRGl、CD127和CD122表达。(E)在指定时间点的Bcl-2 和Bcl-3mRNA表达。(F和G)用抗原+B7. 1 (士) IL-12和雷帕霉素刺激OT-I细胞72小时， 洗涤 2 次，并且存在(F)IL-7(10ng/ml)，*p < 0.02，和(G) IL-15 (10ng/ml). *p < 0. 02 下再放置72小时，在144小时时计算细胞回收百分比(％)。所示实验代表具有相似结果的3 个独立实验(数据用平均值士 SEM表示)。图6、抑制mTOR增加了记忆CD8+T细胞产生。用抗原+B7. 1 (士)IL-12和雷帕霉素刺激OT-I细胞(Thyl. 1+)，在72小时收取细胞，并且过继转移(2x IO6细胞)给BL/6受体。 (A)在转移后24小时，淋巴结中，**p < 0. 0052 ；脾中，**p < 0. 0037 ；和肝中，**p < 0. 0012 和*、< 0. 0011中的过继转移OT-I细胞的绝对数目。(B-E)在转移后第40天用IFA-OVA 免疫受体小鼠，并在3天后检测次级CD8+T细胞应答。(B)免疫前(第40天)和免疫后(第 43天)脾脏内过继转移细胞的绝对数目。括号中的数字表示CD Sa+Thyl. 1+细胞从第40天到第43天的扩增倍数，且(C)在第43天脾脏中的IFN-Y分泌⑶Sa+Thyl. 1+细胞的绝对数目广ρ < 0. 01广ρ < 0. 008。括号中的数字表示⑶脾脏中CD Sa+Thyl. 1+细胞上IFN-γ 表达和颗粒酶B表达的MFI以及(E)在第43天体内抗原特异性细胞溶解。所示结果代表了 2个独立实验(数据用平均值士 SEM表示)。图7、抑制mTOR促进了⑶8+Τ细胞介导的抗肿瘤免疫。(A和B)将天然和72小时条件性OT-I细胞过继性转入BL/6受体。在过继性转移OT-I细胞后M小时，小鼠接种MlO6 E.G7肿瘤细胞。显示了(A)从肿瘤接种开始肿瘤大小(mm3)随时间的变化以及(B)肿瘤接种开始无瘤存活百分比随时间的变化。所示结果为两个独立实验的代表。图8、肾细胞癌模型。在植入表达肿瘤抗原CA9的RENCA肿瘤后10天，Balb/C小鼠中用坦罗莫司抑制mTOR增强了癌症疫苗(hspl 10和CA9复合物)的抗肿瘤效果。每条线代表单个小鼠中的肿瘤生长。为了产生疫苗，CA9(抗原靶标)和HSP110(热休克蛋白佐剂)按照摩尔比1 1混合，在43°C孵育30分钟。在第0天，将hlO5 RenCa-CA9细胞植入小鼠。疫苗在第10、17和对天通过皮内注射给予。在第11到16天、第18到23天和第 25到30天，通过腹腔内注射注射给予坦罗莫司。图9、在植入表达gplOO的B16肿瘤后10天，在所治疗的C57/BL6小鼠中，用坦罗莫司(temsirolimus)抑制mTOR增强了癌症疫苗(gplOO和CA9复合物)的抗肿瘤效果。 每条线代表单个小鼠中的肿瘤生长。为了产生疫苗，gplOO(抗原靶标)和CA9(佐剂)按照摩尔比1 1混合，在室温孵育30分钟。在第0天，将hlO5 B16-gpl00细胞植入小鼠。 疫苗在第10、17和M天通过皮内注射给予。在第11到16天、第18到23天和第25到30 天，通过腹腔内注射给予坦罗莫司。
图10、采用ELISP0T测试检测用CA9+gpl00免疫引起gpl00-特异性IFN-γ应答。
图11提供了显示mTOR抑制剂增强了针对所建立的卵巢肿瘤的免疫介导的保护的数据图表。
图12提供了显示mTOR抑制剂增强了免疫介导的抗胸腺瘤功效的数据图表。
图13提供了显示mTOR抑制剂增强了稳态增殖(HP)-诱导的抗肿瘤免疫的数据图表。
图14提供了显示mTOR抑制剂增强免疫介导的肿瘤保护的数据图表。
图15提供了显示mTOR抑制剂治疗增强了 HP-诱导的抗肿瘤⑶8+T细胞应答的数
5据图表。
图16提供了显示mTOR抑制剂增强卵巢肿瘤的CD8+T细胞介导的过继性细胞转移 (ACT)治疗的数据图表。
发明详述本发明提供了用于调控免疫应答的组合物和方法。在一个实施方式中，本发明提供了包含分离的⑶8+T细胞群和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抑制剂的组合物。所述组合物还包含一种⑶8+T细胞特异性针对的抗原。如本发明所用，“⑶8+”T细胞表示表达⑶8 (分化抗原8)的T细胞。⑶8是一种已充分了解的跨膜糖蛋白，其作为T细胞受体(TCR)的共同受体。CD8结合人的抗原递呈细胞表面的I类主要组织相容性复合物(MHC-I)蛋白。在另一个实施方式中，本发明提供了增强个体中对于一种抗原的免疫应答的方法，所述方法包含给予个体所述抗原和mTOR抑制剂。抗原和mTOR抑制剂以足以增强个体内对所述抗原的免疫应答的有效量给予。mTOR抑制剂和抗原可以同时或非同时给予。免疫应答增强可包含在个体中增强对带所述抗原的细胞的细胞介导的免疫反应。 所述增强可与控制已经给予的抗原(以及可选的任何佐剂)但不是mTOR抑制剂相关。细胞介导免疫应答增强可包括但不限于，表现出针对带有所述抗原的细胞的细胞毒性的CD8+T 细胞增加，或表现出维持能力提高和/或对所述抗原的抗原召回应答提高的CD8+T细胞，或特异性针对所述抗原的效应CD8+T细胞的数量增加和/或活性提高，或是上述类型的细胞介导免疫应答的组合。由本发明的方法引发的细胞介导免疫应答增强可以伴随着体液免疫和/或先天免疫应答的有益变化。在一个实施方式中，免疫应答增强可表现为抑制表达所述抗原的细胞的生长，个体中表达抗原的细胞的死亡，和/或延长个体的存活。在本发明中，我们表明白细胞介素12 (IL-U)通过磷酸肌醇3激酶和STAT4转录因子的通路，在天然CDS+(OT-I)T细胞中增强且维持抗原和共刺激分子(B7. 1)-诱导的mTOR激酶活力。然而，通过代表性的mTOR抑制剂(雷帕霉素)抑制mTOR活性，逆转了 IL-12-诱导的效应细胞功能，因为缺乏转录因子T-bet的持续表达。我们表明，雷帕霉素处理IL-12条件性OT-I细胞，促进持续的脱中胚蛋白表达并且产生记忆细胞前体，所述记忆细胞前体表现出在过继转移后增强维持和抗原召回反应。记忆细胞前体表现出比IL-12条件性效应细胞OT-I细胞更强的抗肿瘤功效。因此，并不想被任何特定的理论束缚，认为本发明首次公开了 mTOR是转录程序的核心调控因子，所述程序确定了 CD8+T细胞的效应细胞和/或记忆细胞的命运。除了发现mTOR在确定CD8+T细胞发育命运中的作用，我们证明了在疫苗治疗方案中加入mTOR抑制剂能对个体提供治疗和预防效果。具体地说，我们表明了在本发明的各种实施方式中使用坦罗莫司和雷帕霉素，以提高癌症疫苗在癌症动物模型中的免疫效果。 与此相关，已知坦罗莫司具有直接抗增殖(抑制细胞生长)的特性，且已经批准用于晚期肾细胞癌(RCC)的治疗。有人曾建议使用mTOR抑制剂和其他抑制细胞生长药剂来治疗癌症(T.Abraham 和 J. Gibbons ;C1 in Cancer Res Q007) 13 :3109-3114)，但是本领域不提倡或建议使用mTOR抑制剂和疫苗的组合。相反，坦罗莫司和雷帕霉素通常用作免疫抑制剂， 并且本领域认识到将疫苗和抑制具有免疫抑制效果的药剂联用会不理想。例如，因为其免疫抑制特性，Spaner提倡反对使用雷帕霉素作为癌症疫苗免疫佐剂，并指出同样的警告也适用于其他与mTOR相关的PHK通路抑制剂，所述抑制剂被认为介导T细胞的细胞周期进展。(Spaner, D. E.，白细胞生物学杂志(Journal ofLeukocyte Biology)第 76 卷，2004 年8月，第338-351页)。此外，在负责外周耐受和免疫抑制的T细胞类型中，调节性T细胞(Tregs)被认为是至关重要的。自然产生的调节性T细胞占总⑶4+T细胞的5-10%，并且可根据 CD25 和 F0XP3 的表达来鉴别(&ikaguchi S :Nat Immunol 6 :345-52,2005) 然而，本领域表明，抑制mTOR功能在体外和体内导致小鼠调节性T细胞扩增。(Battaglia M， 等·血液(Blood) 105 :4743-8,2005 ；Battaglia等糖尿病(Diabetes) 55 1571-80，2006)。 此外，在人中，抑制mTOR已被证明是在体外促进调节性T细胞扩增，并在体内加强对调节性 T细胞的抑制能力(Monti P，等·糖尿病(Diabetes) 57 :2341-7，2008)。因此，来自本领域现状的预期是，将mTOR抑制剂与疫苗联用会不利于产生对于疫苗的抗原成分的免疫应答， 因此预计不会提高或增强对于疫苗的抗原性组分的免疫应答。然而，我们意外地发现了向癌症疫苗治疗方案中加入mTOR抑制剂，能够提高针对疫苗的抗原性组分的免疫应答，通过免疫介导的反应抑制肿瘤细胞的生长，并能与对照相比延长存活时间。因此，鉴于已经明确的mTOR抑制剂作为免疫抑制剂的作用，目前发现，当与疫苗治疗方案联用时，抑制mTOR可增强针对癌抗原的免疫应答，这是令人惊奇的。在这方面，特别是，我们表明了 mTOR抑制剂 (雷帕霉素和坦罗莫司)能在建立的小鼠RCC和黑色素瘤模型中增强癌症疫苗的功效。此外，还利用建立的小鼠模型，我们证明雷帕霉素增强针对卵巢肿瘤和胸腺瘤的免疫介导的保护。此外，我们还表明雷帕霉素治疗可增强稳态增殖(HP)诱导的抗肿瘤免疫，还可以提供针对基于持续性免疫记忆的肿瘤挑战的预防性功效。因此，本发明提供了一种用于增强疫苗(尤其是癌症疫苗)功效的方法，这是至今为止都没有的且令人惊讶的。因此，预计本发明能增强任何疫苗治疗方案，所述治疗方案至少一部分通过细胞介导的免疫应答发挥作用。在一个实施方式中，本发明的方法施用于需要增强对一种抗原的免疫应答的个体。在一个实施方式中，个体为没有经过用mTOR抑制剂的免疫抑制治疗的个体。这种个体的非限制性例子包括那些还没有用mTOR抑制剂进行自身免疫疾病或器官移植的治疗的个体。个体可为疑似患有癌症、已经确诊患有癌症、或是基于如遗传易患病体质或行为或职业危险因素等具有患癌症风险的个体。mTOR是一个已经了解清楚的蛋白，其在人中由FRAPl基因来编码的。其编码核苷酸和氨基酸序列是本领域已知的，并且可以通过2006年6月沈日登录的GenBank检索号 BC117166来获得，其在此引入作为参考。基于本说明书所呈现的公开内容，可以预期任何mTOR抑制剂可适用于本发明的组合物和方法，并且任何个体表达的任何mTOR蛋白都可作为所述抑制剂的合适靶标。优选使用对抑制mTOR具有选择性和/或特异性的抑制剂，而不是广谱的激酶抑制剂。因此，在各种非限制性的实施方式中，mTOR抑制剂可为雷帕霉素，坦罗莫司，依维莫司托林和特弗洛利莫司(deforolimus)，上述物质的类似物，以及mTOR抑制剂和/或其类似物的组合。还预期任何抗原都适用于本发明，只要所述抗原包含适用于与I型MHC分子结合的抗原递呈细胞递呈的氨基酸序列。因此，抗原可以包含或不包含蛋白或肽。所述抗原可为重组抗原，其可为化学合成的，其可为从细胞培养物中提取的，或其可为从个体中获得的生物样品中提取的。抗原可以在感染的生物体中的细胞上呈现，或是抗原可以由患病的或感染的细胞、组织或器官表达。所需的抗原可为已经了解清楚地，但也可为未知的，除了已知或预测它在如来自特定细胞或组织型的裂解液中存在。可用于本发明的抗原可以是商业化的或是根据标准方法制备的。在一个实施方式中，所述抗原为肿瘤抗原。肿瘤抗原可为商品化抗原，也可以用常规技术获得，例如通过重组方法，或由肿瘤细胞裂解物制备。从肿瘤裂解物获得的抗原可以是分离的，或裂解物本身可作为一种或几种抗原。所述抗原可以纯化的形式或部分纯化或不纯的形式进行使用。如本发明所用，“纯化的”表示从其他化合物或实体中分离出来。所述抗原可以未纯化的、部分纯化的、基本纯化的或纯抗原的形式加入到本发明的组合物中， 和/或用于本发明的方法中。当其基本上从所有其他化合物分离开来时，认为抗原是纯化的，即其至少约 90 %，91 %，92 %，93 %，94 %，95 %，96 %，97 %，98 %，99 % 或超过 99 % 纯。 部分纯化或基本纯化的抗原可为与至少大于50 %，至少大于60%，至少大于70 %，或至少 80%或更多的天然一起发现的物质中分离出来，例如，如其他细胞蛋白、膜和/或核酸等细胞物质。在各种实施例中，癌症细胞抗原可由癌症细胞表达，其具体例子包括但不限于纤维肉瘤，粘液肉瘤，脂肪肉瘤，软骨肉瘤，成骨肉瘤，脊索瘤，血管肉瘤，内皮肉瘤，淋巴管肉瘤，腹膜假黏液瘤，淋巴管内皮肉瘤，滑膜瘤，间皮瘤，尤文氏瘤，平滑肌肉瘤，横纹肌肉瘤， 结肠癌，胰腺癌，乳腺癌，卵巢癌，前列腺癌，鳞状细胞癌，基底细胞癌，腺癌，汗腺癌，皮脂腺癌，乳头状癌，乳头状腺癌，囊腺癌，髓样癌，支气管癌，肾细胞癌，肝癌，胆道癌，绒癌，精原细胞瘤，胚胎癌，肾母细胞瘤，宫颈癌，睾丸肿瘤，肺癌，小细胞肺癌，膀胱癌，上皮癌，神经胶质瘤，星形细胞瘤，髓母细胞瘤，颅咽管瘤，室管膜瘤，松果体瘤，血管母细胞瘤，听神经瘤， 寡树突神经胶质瘤，脑膜瘤，黑色素瘤，神经母细胞瘤，视网膜母细胞瘤，白血病，淋巴瘤，多发性骨髓瘤，胸腺瘤，瓦尔登氏巨球蛋白血症(Waldenstrom' s macroglobulinemia)，重链病。所述抗原可为由感染性病原体或感染性生物体表达的抗原，其非限制性例子包括病毒，细菌，真菌，原生动物，或任何其他寄生虫或其他的感染性病原体在另一个实施方式中，本发明提供了增强个体中针对所需抗原的免疫反应的方法，包括给予所述个体一种组合物，所述组合物包含特异性针对所述抗原的CD8+T细胞以及有效量的mTOR抑制剂。所述分离的CD8+T细胞可能是特异性针对所述抗原，但相对于抗原为天然的，或者它们可以在用于本发明的方法前已经接触了需要增强其免疫应答的所述抗原。任选地，在将其给予所述个体前，分离的CD8+T细胞可以接触所需抗原，例如通过将CD8+T细胞与将所述抗原递呈给所述CD8+T细胞的抗原递呈细胞一起孵育。所述CD8+T细胞可以是采用任何已经熟知的各种技术和试剂，从想要增强其对所需抗原的免疫反应的个体中分离出来的。因此，所述CD8+T细胞可被重新导入个体中，用以实施本发明的方法。在另一个实施方式中，本发明提供了包含分离的⑶8+T细胞群和mTOR抑制剂的组合物。所述CD8+T细胞特异性针对需要增强免疫应答的抗原。所述组合物适用于本发明所述的方法，因为当将CD8+T细胞回输到个体中并且遇到所述抗原时，CD8+T细胞接触mTOR抑制剂，提供给了他们参与针对所述抗原的细胞介导的免疫应答增强的能力。分离的CD8+T细胞可在组合物的细胞中占不同的百分比。例如，CD8+T细胞可占组合物中的T细胞或总细胞的至少 1 %，10 %，20 %，30 %，40 %，50 %，60 %，70 %，80 %，90 %，95 %，或 100 %，包括其间所有的整数比例。包含⑶8+T细胞和mTOR抑制剂的组合物还可进一步包含所述抗原。当抗原存在于包含分离的CD8+T细胞的组合物中时，抗原可能存在作为独立实体递呈，或在抗原与在 ⑶8+T细胞上呈现的T细胞受体(TCR)相互作用的任何情况下递呈。当抗原可以与⑶8+T 细胞的TCR相互作用时，CD8+T细胞可以被激活。可以在组合物中提供所述抗原使其能够被CD8+TCR识别的各种实施方式的例子，包括但不限于，所述抗原在抗原递呈细胞表面上与 MHC-I结合递呈(或在动物模型中的等效递呈)，所述抗原递呈细胞例如树突状细胞。任选地，所述抗原可为与任何其他天然或合成的分子或其他化合物、复合物、实体、物质等物理结合，这将有利于所述抗原被CD8+T细胞的TCR识别。例如，抗原可与MHC-I或其他用于将所述抗原递呈给CD8+TCR的合适分子形成复合物，且所述MHC-I或其他合适的分子(例如， 在包含C57BL/6小鼠⑶8+T细胞的组合物中的Kb)可以与一种物质物理结合，如乳胶珠、任何平面的塑料表面、或任何其他合适的物质，以促进所述抗原能正确进入CD8+T细胞的TCR， 使得所述抗原被CD8+T细胞识别。所述组合物还可进一步包含任何各种熟知的共刺激分子。 本领域的技术人员应理解，本发明所述的组合物适用于制备用于给予个体CD8+T细胞，和/ 或可直接给予个体，或可进一步纯化、组合、处理或与任何各种其他药剂混合，和/或进行会使组合物适合给予个体的加工，以求提供针对任何所需抗原的疫苗治疗方案的治疗或预防效果增强，其中针对所述抗原能产生细胞介导的免疫应答。在一个实施方式中，所述组合物还包括细胞因子，例如IL-12。获取生物样品和从样品中分离CD8+T细胞的方法是本领域所熟知的。例如，根据T 细胞表面标记物来区分和分离T细胞的常规细胞分选技术，可以用来获取分离的CD8+T细胞群，用于本发明的组合物和方法中。例如，可通过使用商业化设备和试剂，从个体中获取包括血液和/或外周血淋巴细胞的生物样品，并且从所述样品中分离CD8+T细胞。从而获取分离的CD8+T细胞群。所述CD8+T细胞可以进一步定性，和/或通过使用其他细胞表面标记物根据表型来分离，所述细胞表面标记物例如⑶44，L-选择素(⑶62L)，⑶122，⑶154， CD27, CD69, KLRGl, CXCR3, CCR7, IL_7Ra。这些细胞也可能是通过反向选择 CD4+/NK1. Γ, B220，⑶lb+，⑶19+细胞来进行最初的分离。这些细胞可为天然的(⑶62L1高表达，⑶44低表达，IL-7Ra高表达，⑶122低表达，或抗原遭遇型；⑶62L(中第水平表达)，⑶44高表达， IL-7Ra(高表达或低表达)和⑶122中高度表达。在任何合适的容器、设备、细胞培养基、 系统等中，分离的CD8+T细胞群可以与mTOR抑制剂和/或抗原混合使用，并可以在体外培养和/或接触一种或多种抗原、以及任何其他试剂或细胞培养基，以使T细胞扩增和/或成熟和/或分化，从而获得任何所需的特性，这类特性是本领域技术人员已知的。例如，可以处理分离的CD8+T细胞，使其产生针对带有需要增强对其免疫应答的抗原的细胞的细胞毒性， 所述CD8+T细胞可以增强维持和/或抗原召回反应以递呈所述抗原，或所述CD8+T细胞可具有效应T细胞的功能和/或表型特征。本发明的组合物可包含药学上可接受的载体，赋形剂和/或稳定剂。适用于与所述药剂混合的组合物的例子可参见的成分与代理混合适合一些例子可以参见宾夕法尼亚
9州费城的利平科特-威廉姆斯-威尔金出版社的《雷明顿药典制药科学与实践》O005) 第 21 版(Remington :The Scienceand Practice of Pharmacy(2005) 21st Edition, Philadelphia,PA. LippincottWilliams&Wilkins.)。所述组合物还可进一步包含任何合适的佐剂，包括但不限于，刺激iToll样(TLR) ,NLR以及所有DAMPS和PAMPS的免疫佐剂，包括不完全弗氏佐剂，弗氏完全佐剂，沙门氏菌鞭毛蛋白肽/蛋白，含CpG的DNA，尿酸晶体，乳化油，病毒载体，RNA和/或单链DNA，其可用于加入与所述抗原混合或是注射入提供抗原的宿主。本领域技术人员会认识到如何设计用于实施本发明所述方法的给药治疗方案，考虑到下列因素，例如所述抗原的分子修饰，待治疗个体的大小和年龄，以及个体疑似患有或已确诊患有的疾病的类型和阶段。所述抗原和mTOR抑制剂可以作为同一组合物的组分同时给予。优选在给予所述个体所述抗原之后给予所述mTOR抑制剂。例如，最初给予mTOR抑制剂可在给予所述抗原后数小时进行，直到抗原给予后60天，包括此间的所有天数和小时时间点。此外，优选提供重复给予所述mTOR抑制剂。例如，在本发明的方法的一个实施方式中，mTOR抑制剂至少每天一次给予，并且持续一段至少一周的时间。mTOR抑制剂可以每天给药持续一周以上，例如从8-60天，包括其间的所有整数。在一个实施方式中，mTOR抑制剂给药不超过20天，由于我们已经确定给药超过20天会降低增强效果。将包含在本发明的组合物中和/或将用于本发明的方法的mTOR抑制剂的量可依据本发明的公开内容，由本领域的技术人员确定。在一些实施方式中，包含15μ g雷帕霉素的组合物每天一次给药持续5-8天，有效地增强了小鼠癌症模型中免疫系统介导的效应。 根据例如基于体重的mg/kg量，根据任何特定人类患者和任何给定的mTOR抑制剂，预计可以按比例决定mTOR抑制剂的量以及给药治疗方案。本发明的方法可与常规治疗结合来实施，所述常规治疗用于治疗与所述抗原相关的疾病或病症。例如，如果方法用于增强个体中对一种肿瘤抗原的免疫反应，治疗形式包括但不限于化疗，手术干预和放射治疗，可以在本发明的方法之前、同时或随后进行。下列实施例用于说明本发明，而不对本发明构成限制。 实施例1本实施例提供了对用于获得如实施例2-9中所述数据的材料和方法的描述。小鼠和试剂在RPCI根据IACUC指导规范来饲养、安排住宿和使用C57BL/6， CD4+TCR 转基因 Rag2+(OT-II)，CD8+TCR 转基因 Rag21/-(0T_I，野生型)，Stat4+0T_I Rag2+，以及Tbdl+OT-I Rag2+小鼠。rmIL-12 (2ng/ml)由惠氏有限公司免费提供(剑桥，马萨诸塞州)。IFN-a是由T. Tomasi (RPCI)免费提供的。rmlL-7购自P印rotech公司 (落基山，新泽西州)。2-DG、4-HT和雷帕霉素购自西格玛奥德里奇公司(圣路易斯市，密苏里州)。LY^0042购自Calbiochem公司。胰岛素购自诺和诺德公司(普林斯顿，新泽西少H ) 0刺激OT-I细胞。根据已知技术，用表达H_2Kb/卵清蛋白抗原和B7. 1的乳胶微球来刺激天然的OT-I细胞。用抗CD3-/抗CD28-包被的乳胶珠来刺激天然的OT-II细胞。在一些实验中，根据已知技术，将称为BOK (MEC. B7. SigOVA 表达H_2Kb，OVAp和B7. 1)的来源于胚胎成纤维细胞的细胞株用作抗原递呈细胞，来刺激天然的OT-I细胞。
体外评估次级抗原召回反应。为了在体外研究次级抗原召回反应，用培养基洗涤在72小时收获的OT-I细胞(初级)三次，并且在M孔板中只加入IL-7 (10ng/ml)重新再培养72小时(lx 105/ml)。在144小时时，收获细胞，用培养基洗涤3次，调节细胞数量(5x 105)，并且只用Ag/B7. 1再刺激M小时(次级刺激)。在168小时时，用流式细胞仪和体外功能测试来评估回收的细胞。逆转录病毒转染和T-bet诱导。根据厂商使用说明，采用Lipd^93DNA体外转染试剂(SignaGen生物技术公司)，将T-bet-ER RV (雌激素反应性逆转录病毒载体)与逆转录病毒包装载体pCL-Eco —起共转染进入Platinum-Ε细胞。第二天更换培养基，并且在转染3天后收集逆转录病毒上清液。为了转染，刺激天然OT-I细胞M小时，然后用带有凝聚胺(8 48/!111，西格玛奥德里奇公司)的逆转录病毒上清液悬起，然后在30°C以2200rpm旋转转染90分钟。在旋转转染后，细胞在含有与以前相同极性化环境的新鲜培养基中培养， 还加入了 4-HT (IOnM)。在最初刺激后72小时，细胞洗涤3次，并且维持在除了存在4-HT和 IL-7 (10ng/ml)外没有任何刺激的情况下。统计学分析。对于统计分析，采用独立样本t检验。不同组织间的肿瘤生存采用 Kaplan-Meier生存曲线和对数阶统计。显著性定为P < 0. 05。
实施例2本实施例表明引导天然CD8+T细胞进行I型效应细胞分化的指令增强mTOR活性。为了研究天然⑶8+T细胞指令性(信号1、2和3分别为-抗原[Ag]，B7. 1 [共刺激] 和IL-12 [细胞因子])规划成I型效应细胞功能的机制，我们开始研究以确认IL-12在用贴壁细胞系刺激的OT-I细胞向I型效应细胞成熟中起到决定性作用，所述贴壁细胞系称为 Β0Κ，表达H-2Kb、0VAp和B7. 1。加入IL-12导致OT-I细胞中在72小时大量产生IFN-γ和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活力(图IA和1Β，初级)。此外，当初级效应OT-I细胞(72小时)在IL-7中再放置72小时(在144小时测得12% IFN- y )，并且用Ag和Β7. 1再次刺激(见实施例1)，只有IL-12条件性OT-I细胞重新诱导IFN- γ和CTL活力(图IA和IB ； 次级)。因此，IL-12在⑶8Τ细胞效应细胞成熟中具有决定性作用。尽管激酶mTOR已经用作各种胞外信号的综合因子和内部能量水平传感器来决定细胞的命运，mTOR在引导天然CD8+T细胞向I型效应细胞分化的整体指令中的作用还不清楚。首先，我们在有或没有IL-12的情况下，，在刺激后的不同时间点监测OT-I细胞中抗原和B7. 1激活mTOR的能力。用抗原+B7. 1刺激天然OT-I细胞，在2小时开始诱导mTOR磷酸化(活化)，其在12小时达到最大值，且在48小时几乎检测不到(
图1C)。值得注意的是，加入IL-12在2小时时增强了抗原+B7. 1诱导的mTOR磷酸化，其在刺激后48小时保持 (
图1C)。因此，尽管抗原+B7. 1诱导mTOR磷酸化，加入IL-12增强并且维持了 0Τ-Ι细胞中的mTOR磷酸化。为了验证诱导mTOR磷酸化也会导致其激酶活力，我们监测了 p70S6K磷酸化(Ser 371)的动力学，这是mTOR激酶活力的直接靶标。尽管抗原+B7. 1和抗原+B7. 1 加IL-12都在12小时诱导相似量的S6K磷酸化(最大值)，存在IL-12能维持S6K磷酸化直到48小时(
图10)，与mTOR磷酸化相关(
图1C)。同样，在IL-12条件性OT-I细胞中， S6K下游底物S6磷酸化(Ser235和236)也增强和持续(图IE)。抗原+B7. 1 士 IL-12刺激诱导在OT-I细胞中S6K和S6磷酸化，被雷帕霉素(mTOR复合物-1抑制剂)所抑制(图ID 和IE)，从而确认指令能够激活mTOR和其在OT-I细胞中的激酶活性。IL-12以雷帕霉素敏感性方式进一步提高在抗原+B7. 1刺激的OT-I细胞中诱导母细胞转化和⑶98表达。这些发现确定mTOR是引导天然CD8+效应T细胞应答的指令的靶标，并且提示mTOR激酶在调控 IL-12决定的⑶8+T细胞的I型分化中的潜在作用。 实施例3本实施例表明在CD8+T细胞中IL-12增强mTOR活力需要PII和STAT4。为了确定控制⑶8+T细胞中mTOR活力的分子通路，我们分析抗原-，B7. 1-和IL-12-诱导的磷酸肌醇3激酶(PI3K)-Akt激酶通路为⑶8+T细胞中的mTOR信号传导所需要的。评估抗原 +B7. 1 士 IL-12刺激的OT-I细胞的Akt磷酸化(Thr308)，作为PII活性的功能性检测。虽然在有或没有IL-12情况下用抗原+B7. 1刺激30分钟，诱导了相似量的Akt磷酸化，在IL-12 存在下Akt磷酸化增强直至48小时，其由PII抑制剂(LY^40(^)所抑制(图2A)，从而证实了 IL-12在OT-I细胞中增强了抗原+B7. 1诱导的PII活性。此外，抑制PI3K，阻断了 IL-12增强的mTOR活性(在2、12和48小时观察S6K磷酸化)(图2B)，表明在抗原刺激的 OT-I细胞中抗原+B7. 1和IL-12激活的PII活性是诱导mTOR激酶的活性所必需的。IL-12引导⑶8+T细胞向效应细胞成熟发展的能力需要STAT4转录因子。为了确定在OT-I细胞中IL-12增强mTOR活力是否依赖于STAT4，在用抗原+B7. 1 士 IL-12刺激后， 我们监测野生型(WT)或乂站疒力！1-!细胞诱导S6K磷酸化的能力。与我们对抑制PII的发现不同，在OT-I细胞中缺乏STAT4，在早期时间点O小时和12小时)不会影响IL-12诱导的S6K磷酸化，但是不能保持诱导的S6K磷酸化的量(48小时)(图2C)。因此，IL-12诱导的PII和STAT4在OT-I细胞内调控mTOR活力中发挥不同的作用。
实施例4本实施例表明了维持mTOR活性是遗传性I型效应细胞功能所必需的。因为在抗原刺激过程中存在IL-12，增强mTOR的活性，并且是对于I型效应细胞成熟是决定性的，我们分析是否维持mTOR激酶活性是OT-I细胞中IL-12程序性I型效应细胞功能所需要的。 要做到这一点，我们用BOK士 IL-12和雷帕霉素刺激天然OT-I细胞，并且从初级和次级激活的OT-I细胞群中分析效应细胞功能。向IL-12条件性OT-I细胞中加入雷帕霉素没有影响从初级激活的OT-I细胞产生IFN- γ，但它们的CTL活性降低，同时颗粒酶B表达降低(图 3A，3B, 3C ；初级)。相反地，我们注意到在次级激活细胞群中IL-12条件性效应细胞功能完全逆转(IFN- γ生产和CTL活性)(图3A和;3B ；次级)。这种IL-12条件性I型效应细胞功能的阻抑，不是由于雷帕霉素诱导抑制细胞增殖和/或蛋白质的合成，因为IL-12存在下这些细胞的活化，导致大量产生IFN- γ。这些结果表明，IL-12诱导的天然⑶8+T细胞的I 型效应细胞功能决定需要mTOR的活性。此外，我们观察到在初级刺激后144小时，雷帕霉素处理抑制了 IL-12诱导IFN-Y生产和CTL活性。这些结果进一步证实，雷帕霉素处理抑制I型效应细胞功能，并在次级激活细胞群(168小时)中观察到效应细胞功能缺失(图3A 和3B ；次级)，相信这纯粹是因为这些细胞无法重新诱导IFN-γ产生，而不是由于雷帕霉素处理的细胞的难以控制的状态。为了确定由IL-12处理导致的持续mTOR活性是否是I型效应细胞功能所需要的， 在抗原+B7. 1刺激后，我们通过在12小时时加入雷帕霉素，阻断了 IL-12诱导的mTOR活性的持续性(mTOR活化在12小时达到高峰；图IC和1D)(图3D)，并且从初级和次级激活的 OT-I细胞群中评估它们产生IFN-γ的能力。在12小时加入雷帕霉素阻断了 IL-12诱导的效应细胞功能，就像在处理0小时观察到的(图3E ；初级激活与次级激活应答相比)。因此，在最初12小时诱导的mTOR活性可能不足以引导CD8+T细胞的I型效应细胞功能，并指出在CD8+T细胞中IL-12诱导的mTOR活性的持久性(12小时或更高版本)对于引导I型效应细胞功能的重要性。 实施例5本实施例表明了 IL-12增强mTOR活性对于持续的T_bet表达是重要的。由于 T-bet的持续表达是对决定I型效应细胞命运是必要且充分的，(Matsuda等，2007)，且在 OT-I细胞中抑制mTOR逆转了 IL-12决定的I型效应细胞成熟(图3)，我们随后进行T_bet mRNA表达的动力学分析，来确定雷帕霉素处理是否会影响在OT-I细胞中T_bet的表达(图 4A)。在所有测试时间点(24-96小时)，加入IL-12增强并且维持了 Ag+B7. 1诱导的T-bet 表达。然而，抑制mTOR没有影响Ag+B7. 1加IL-12诱导的早期T-bet表达(24-48小时)， 但阻止了 IL-12诱导持续的T-bet mRNA表达(96小时几乎检测不到)，相应地，OT-I细胞缺乏T-bet蛋白表达(图4B)。此外，在12小时抑制mTOR活性，也能够导致Τ-bet表达缺失，与I型效应细胞成熟中观察到的缺失类似(图3E)。因此，IL-12增强(提高且持续) mTOR活性是在⑶8+T细胞中持续T-bet表达所必需的。为了说明在抗原召回期间雷帕霉素介导的抑制IFN-Y产生是因为它无法重新诱导T-bet表达，我们通过用IL-7处理72小时(144小时)使IL-12条件性OT-I细胞(72 小时I型效应细胞)静止，并且在抗原召回前(144小时)和抗原召回后(168小时)评估它们的T-bet表达。在初次用Ag+B7. 1加IL-12的条件性OT-I细胞中检测到中度T_bet表达，这是在雷帕霉素处理后被抑制的(图4C)。值得注意的是，一旦抗原召回，IL-12条件性 OT-I细胞重新诱导了 T-bet蛋白的量显著更高，其是雷帕霉素处理敏感性的(图4C)。这些观察结果表明，雷帕霉素处理抑制了持续T-bet表达，这可能导致抑制IL-12介导的I型效应细胞成熟。IL-12条件性的Tbx21+0T-细胞也未能产生I型效应功能(图4D，次级) 的事实也支持了这一结论，尽管它们在初级阶段产生IFN-Y的能力没有收到影响(图4D， 初级)。这些观察结果与在雷帕霉素处理的IL-12条件性OT-I细胞一致(图3)，并进一步支持了我们的观点，抑制mTOR导致的缺乏持续T-bet表达，抑制了⑶8T细胞中IL-12条件性I型效应细胞分化。为了直接确定雷帕霉素处理后缺乏T-bet表达是否导致I型效应功能丧失，我们在雷帕霉素处理的IL-12条件性OT-I细胞中诱导T-bet的异位表达，并评估其从次级激活 OT-I细胞群重新诱导IFN- γ产生的能力。采用T-bet-ER逆转录病毒载体(T-bet_ER RV)， 其中T-bet表达受到他莫昔芬G-HT)调控(Matsuda等，2007)。事实上，向T-bet-ER-转染的OT-I细胞中加入他莫昔芬(Tm，IOnM)，导致雷帕霉素处理的IL-12条件性OT-I细胞中 T-bet表达大幅增加(图4E)并且恢复了 IFN-Y产生(图4F)。因此，这表明IL-12诱导的持续mTOR磷酸化，是⑶8+T细胞持续表达T-bet和T_bet依赖性I型效应细胞决定所必不可少的。代谢激素胰岛素通过胰岛素受体底物( 发挥作用以激活mTOR激酶，而一种糖酵解抑制剂2-脱氧葡萄糖Q-DG)导致阻断mTOR活性。因此，我们采用胰岛素和2-DG代谢性调节mTOR活性，并测试在OT-I细胞中它们是否会影响T-bet表达。事实上，向抗原 +B7. 1刺激的OT-I细胞加入胰岛素增强了 mTOR活性(S6Kp)以及mTOR依赖性的T_bet表达上升(图4G和4H)，而2-DG加入到抗原+B7. 1和IL-12刺激的OT-I细胞，导致mTOR活性和T-bet表达丧失。这些结果确定mTOR是调节⑶8+T细胞中T_bet表达的关键指令综合因子。
实施例6本实施例显示了在⑶4+和⑶8+细胞中对mTOR激酶的需求差异。由于用雷帕霉素处理CD4+T细胞诱导表达R)Xp3的调节性T细胞的功能丧失和/或分化偏离，我们分析抑制抗原+B7. 1和IL-12诱导的mTOR活性是否影响⑶8+T细胞I型效应细胞分化，因为阻止了活化、增殖和/或导致分化偏离产生不同的效应细胞亚型。与已发表的CD4+T中结果相同， 我们的结果表明，雷帕霉素处理显着降低活化(⑶44表达)，增殖(CFSE稀释)以及⑶4+T 细胞的细胞回收(OT-II)。然而，雷帕霉素处理不影响⑶8+T细胞(OT-I)的早期(⑶69，12 小时)和晚期活化(CD44)，仅轻微影响增殖(CFSE)和细胞回收。此外，与CD4+T细胞中所报道的R)xP3表达不同，雷帕霉素处理的OT-I细胞不能持续表达R)xP3，这是赋予T细胞调控功能所必需的。此外，一旦抑制mTOR后缺乏T-bet，不能诱导分化偏离2型或17型亚族。 这些观测结果也在不同剂量雷帕霉素(20ng/ml-2yg/ml)下进行了验证。在较高剂量时， 雷帕霉素有效地抑制了 OT-I细胞中的mTOR活性(S6Kp和S6p)，但与⑶4+T细胞不同，它不能阻止激活、增殖以及分化偏离形成调节性T细胞亚群。这些结果表明，雷帕霉素对⑶4+和 CDS+T细胞具有不同的作用，它阻止IL-12诱导的I型CDS+效应细胞分化的能力，不是由于诱导功能丧失或是分化偏离形成其他效应细胞亚型。
实施例7本实施例表明，抑制mTOR诱导脱中胚蛋白持续表达，并且产生记忆前体⑶8+T细胞。因为用雷帕霉素处理阻断了 I型效应细胞分化，并且不能诱导功能丧失和其他转录调控因子的表达。我们接下来鉴定雷帕霉素处理的IL-12条件性OT-I细胞的命运。在效应细胞和记忆CD8+T细胞中，密切相关的转录因子T-bet和脱中胚蛋白是反向调节的。为了确定抑制mTOR减少了 T-bet表达，是否会导致诱导脱中胚蛋白，我们系统地分析了 OT-I细胞中的脱中胚蛋白mRNA表达。我们观察到在天然OT-I细胞中脱中胚蛋白适度表达，在用抗原 +B7. 1刺激后表达增强，并且加入IL-12后表达降低(图5A)。然而，向抗原+B7. 1加IL-12 条件性OT-I细胞中加入雷帕霉素，显著增强了脱中胚蛋白的表达，这是在各个测试时间点都保持的04-96小时)(图5A)。脱中胚蛋白mRNA的上升在蛋白质水平也被证实，因为雷帕霉素处理的IL-12条件性OT-I细胞会脱中胚蛋白产生明显增加(图5B)。值得注意的是，我们始终没有观察到在抗原+B7. 1加IL-12条件性OT-I中有非mRNA诱导的脱中胚蛋白上升(不显著)(图5A和5B)。为了测试在OT-I细胞中雷帕霉素介导的脱中胚蛋白上调是否是抑制mTOR的直接结果，还是由于它能抑制持续的T-bet表达的结果，我们在雷帕霉素条件性T细胞中异位诱导T-bet表达，并且分析在有或没有他莫昔芬的情况下脱中胚蛋白的表达。事实上，在雷帕霉素处理的OT-I细胞中诱导T-bet表达，降低了脱中胚蛋白的表达(图5C)。此外，我们持续观察在用抗原+Β7· 1和IL-12处理的TbUl+OT-I细胞中脱中胚蛋白的表达升高。总结起来，这些结果表明，在IL-12条件性OT-I细胞中，抑制mTOR 有选择地切换了从T-bet持续表达到脱中胚蛋白表达的转录程序。我们还确定IFN-α是否也可以在OT-I细胞中调节mTOR活性和T-bet表达。我们确定IFN- α不能在抗原+Β7. 1 刺激的OT-I细胞中增强mTOR活性和提高T-bet表达；然而，我们观察到了脱中胚蛋白的表达和IFN-γ产生升高。这些结果证实了，IL-12具有通过促进持续的mTOR和T-bet表达来决定I型效应细胞成熟，并且IFN- α缺乏这种活力，因为它不能促进持续的mTOR活性和 mTOR依赖性的T-bet表达。我们接下来想确定雷帕霉素诱导的T-bet到脱中胚蛋白表达的开关以及阻断I型成熟是否导致它们转换成记忆细胞前体。我们采用与记忆CD8+T细胞前体相关的标记物进行了 OT-I细胞的表型分析，即CD62L (淋巴结归巢)，CD69(淋巴结保留),CD127 (IL-7R α， 对记忆性T细胞维持至关重要)，⑶122 (IL-15Ri3且对记忆⑶8+T细胞稳态重建是必不可少的)，KLRGl (与记忆性⑶8+T细胞产生为负相关)，和Bcl-2 (抗凋亡且在记忆T细胞中表达增加)。与非雷帕霉素条件性的细胞相比，在雷帕霉素处理的IL-12条件性OT-I细胞中， ⑶62L的表达量显著较高，且表现为⑶69持续表达(图5D)。⑶69和⑶62L表达上升意味着雷帕霉素处理的OT-I细胞可能有更强的淋巴结归巢和保留能力。此外，与未处理的对照相比，在所有观测的时间点，雷帕霉素处理的细胞具有较高频率的KLRGlisa°)，同时提高且维持促生存基因的表达(Bcl-2和Bell)(图5D及5E)。因此，雷帕霉素处理促进了记忆 ⑶8+T细胞前体的表型指示。然而，雷帕霉素处理降低了⑶122的表达，且OT-I细胞表现出在体外对IL-15刺激的应答能力缺陷(图5D及5E)。这与雷帕霉素处理导致T_bet表达缺失、以及CD
122是CD8+T细胞中T-bet的直接基因靶标的事实相一致。虽然我们并没有观察到雷帕霉素处理后⑶127表达有任何变化，这些细胞在体外对IL-7的反应性更为敏感(图5D 和5G)。总体而言，这些数据表明，抑制mTOR赋予IL-12条件性CD8+T效应细胞类似记忆细胞的表型，同时持续表达记忆命运转录因子脱中胚蛋白。接着，我们研究IL-7条件性培养72小时的OT-I细胞，再培养72小时或抗原召回 (168小时)二是否影响它们的记忆细胞表型。我们确定雷帕霉素处理的OT-I细胞保持了它们的KLRGlte表型，但是没有了 CD69 表型。特别是，在72小时观察到的CD122 表型恢复，并且我们没有观察到⑶127表达变化。因此，用二IL-7静止雷帕霉素处理的OT-I 细胞充分保持了其记忆细胞前体表型，阻止了其维持CD69S表型的能力。
实施例8本实施例表明了抑制mTOR增加了记忆⑶8+T细胞的生成。基于雷帕霉素能在OT-I 细胞内阻断IL-12介导的I型效应细胞功能、控制持续T-bet用于脱中胚蛋白表达、并且诱导类似记忆细胞表型，我们分析雷帕霉素处理的IL-12条件性OT-I细胞是否会在过继转移后产生记忆反应。为了测试这一点，我们首先研究雷帕霉素处理OT-I细胞是否能表现出它们定位在二级淋巴器官中的能力发生变化，这是由它们⑶62L和⑶69表达升高来提示的。 在C57BL/6受体中M小时后检测过继转移抗原+B7. 1 士 IL-12和雷帕霉素条件性OT-I细胞 (Thyl. 1+)。雷帕霉素处理的OT-I细胞表现出在次级淋巴器官(淋巴结和脾脏)中的定位增加，并且相应地在三级位点例如肝(图6A)和血液中数量较少。非雷帕霉素处理的OT-I 细胞没有表现出这种定位模式(图6A)。然而，我们并没有观察到肺中的细胞频率有任何明显的差别。因此，抑制mTOR活性将抗原加IL-12条件性的⑶8+T细胞定位转向了次级淋巴
S ο为了确认产生记忆OT-I细胞前体的雷帕霉素处理是否能给予记忆细胞功能，我们评估了过继转移细胞的持久性(第40天)并且检测它们的抗原召回应答(第43天)。用抗原+B7. 1加IL-12处理OT-I细胞，表现出比抗原+B7. 1刺激的OT-I细胞持久性更强 (图6B)。然而，雷帕霉素处理显著提高了 OT-I细胞的持续能力，表现为在第40天检测到数量增加(图6B)。OT-I细胞的持续性增强，很大程度上是由于它们的生存能力和进行更大的稳态增殖能力的差异，因为与未处理的对照相比，雷帕霉素处理OT-I细胞表现出相同的CFSE稀释，但具有较高的生存相关基因表达(图5E)。此外，在抗原重新激发后，用克隆扩增来评估，雷帕霉素处理OT-I细胞产生很强的抗原召回反应(图6B)和效应细胞应答 IFN-Y、颗粒酶8的表达，以及CTL活性(图6C，6D，6E)。更重要的是，在雷帕霉素处理组， 每个细胞的IFN-Y和颗粒酶8表达上升，这表明在该组中体内细胞裂解杀伤增加，不仅是因为细胞的数量增加，而且是因为在抗原召回后效应细胞成熟增加。因此，雷帕霉素处理不仅增强了 CD8+T细胞的持久性，而且还赋予它们在抗原重新激发后更强的效应细胞能力。在早期(第5天)和晚期(第40天，记忆)时间点的过继转移OT-I细胞的表型分析表明，雷帕霉素处理的细胞在第5天具有更高的⑶127、⑶62L、⑶69表达，保持了它们的记忆细胞前体表型，但是这种表型在转移后第40天改变。此外，在第40天没有观察到T-bet和⑶122 的表达变化。总的来说，这些观察结果表明，雷帕霉素处理促进⑶8+T记忆细胞前体的生成， 其可定位在次级淋巴器官中并且在过继性转移后持续。然而，它们的表型随时间改变，并且产生强大的抗原召回效应细胞应答。
实施例9本实施例表明，雷帕霉素处理的IL-12条件性OT-I细胞的肿瘤疗效增强。在过继性细胞转移(ACT)中采用离体产生的肿瘤抗原特异性CD8+T效应细胞，在临床情况下产生肿瘤消退(Morgan等，2006)。为了测试雷帕霉素处理的IL-12条件性OT-I细胞的肿瘤疗效，我们将用或不用雷帕霉素处理的IL-12条件性OT-I细胞(72小时)过继性转移到完好的C57BL/6受体，所述受体带有E. G7肿瘤细胞，并且随着时间监测肿瘤大小(s. c (皮下)) 和存活率。与接受天然OT-I细胞的受体相比，接受抗原+B7. 1刺激的OT-I细胞的小鼠表现出边际效应(在第30天致死率从100%降到80% )，其被IL-12条件性OT-I细胞进一步增强(第30天致死率为50% )。雷帕霉素处理的IL-12条件性OT-I细胞显示出肿瘤疗效的显著增强，超过78%的受体动物无瘤存活直到第120天(图7B)。此外，与非雷帕霉素处理的对照相比，雷帕霉素处理的IL-12条件性OT-I细胞也表现出对肿瘤大小的控制显著提高 (图7A)。这些结果表明，抑制mTOR引导抗原和IL-12条件性⑶8+T细胞进行记忆反应，表显出比IL-12条件性⑶8+T效应细胞更强的肿瘤疗效。
实施例10本实施例表明坦罗莫司和雷帕霉素提高了在RCC和黑素素瘤小鼠模型中癌症疫苗的的抗肿瘤作用。在RCC模型中，热休克蛋白(HSP)作为免疫佐剂与目标抗原碳酸酐酶 IX(CA9)复合，所述抗原CA9在90%的透明细胞RCC表达。Balb/c小鼠植入工程化改造表达CA9的同源RENCA肿瘤。在攻击造成的肿瘤移植物的治疗模型中，小鼠在植入后10天用带或不带坦罗莫司的肿瘤疫苗治疗(图8)。从图8可以看到，单用疫苗只对肿瘤生长有中度效果。单用坦罗莫司导致肿瘤生长减少，而疫苗和坦罗莫司联用对肿瘤生长产生最强的效果。同样，在黑色素瘤模型中，疫苗和坦罗莫司联用对肿瘤生长的影响最大(图9)。在此模型中，CA9与黑色素瘤抗原gplOO复合。C57/BL6小鼠植入工程化改造表达gplOO的同系 B16肿瘤，小鼠在10天后用肿瘤疫苗进行治疗。采用小鼠卵巢癌模型也获得类似的结果，其
16中疫苗是用雷帕霉素增强的。 实施例11本实施例表明了坦罗莫司的增强效果是免疫介导的。具体地，坦罗莫司对体外 RENCA(肾肿瘤细胞)的生长具有直接作用，但是对于体外B16黑色素瘤的生长没有影响 (
图10)。这表明，在黑色素瘤模型中，坦罗莫司的主要作用是免疫介导的。与这种可能性一致，采用ELISP0T测试，CA9+gpl00免疫引起了脾细胞的gplOO特异性IFN-Y应答。同时用坦罗莫司治疗显著提高了这种应答(P < 0.05)。此外，在体内CTL测试中，坦罗莫司治疗提高了特异性杀伤。Riiel-I细胞过继转移给C57/BL6小鼠并且用带或不带坦罗莫司的 gpl00+CA9免疫。Rnel-I细胞是识别对应于gplOO. 13的25-33氨基酸的H_2Db_限制性表位的转基因细胞。14小时后，带有H-2Db-限制性表位的靶细胞注入流式细胞仪并且检测。 在没有接受坦罗莫司的组内特异性杀伤为66%。当坦罗莫司与疫苗一起给予时，特异性杀伤提高到78%。
实施例12本实施例展示了本发明的各种实施方式，其中每个表明使用mTOR抑制剂以增强抗癌免疫应答。在每个案例中，都采用Black 6小鼠。
图11所示的数据表明，雷帕霉素增强了对已建立的卵巢肿瘤的免疫介导保护。简单地说，带有卵巢肿瘤的第20天小鼠通过注射小鼠卵巢浆液性上皮细胞(“M0SEC”)来产生。免疫是采用基于鸡痘病毒载体(“Trio”也被称为“Tricom”(赛诺菲巴斯德公司)进行的，所述载体在MHC-I前后表达鸡卵清蛋白抗原。该病毒还表达三个参与T细胞活化的共刺激分子(B7. 1、LFA3 和 LFA-1)(例如，参见 Gamett，等· Curr Pharm Des. 2006 ；12 (3) 351-61，其在此引用作为参考)。监测荷瘤小鼠的存活。每个试验组有20只小鼠，并且实验重复两次。可从
图11中所示的数据看出，相对于对照组，加入雷帕霉素对荷瘤小鼠的免疫介导的存活具有很强的增强效果。
图12中所示数据表明，给予mTOR抑制剂增强了带有胸腺瘤的小鼠的免疫介导存活。在
图12中总结的数据反映了采用与
图11中所述的相同试验条件下接种表达鸡白蛋白的小鼠T细胞胸腺瘤的小鼠的分析。从这些数据可以看出，mTOR抑制剂(雷帕霉素)与疫苗免疫联用，能显著提高荷瘤小鼠的存活。
图13所示的数据表明，加入mTOR抑制剂可以提高稳态扩增
(HP)诱导的抗肿瘤免疫。特别是，辐射诱导的淋巴球减少症诱导天然CD8+T细胞中的 HP，其能产生功能性成熟和记忆。在带有肿瘤(胸腺瘤-EG. 7)的小鼠中，辐射后进行天然的肿瘤抗原特异性CD8+T细胞过继转移，产生了针对生长的肿瘤保护作用。如
图13所示， 当给予雷帕霉素时，增强了这种HP诱导的肿瘤免疫，使得雷帕霉素存在下淋巴球减少症导致天然CD8+T细胞成熟。因此，本发明有效地加强了对针对带有癌症抗原的细胞的各种诱导的免疫应答的作用。
图14提供了一个图形化的数据总结，表明本发明的预防效果增强。这些数据部分是使用OT-I细胞产生的。简单来说，从广泛使用的转基因OT-I小鼠获得OT-I细胞，其中所有的CD8+T细胞表达特异性针对Kb上递呈的一种卵清蛋白肽的TCR。所述肽的氨基酸序列是本领域已知的。如
图14所示，将天然OT-I细胞注入天然(naiLve)同系小鼠，然后用上述Tricom病毒构建物针对卵清蛋白抗原来免疫所述天然受体小鼠。免疫后，每天给予mTOR抑制剂(雷帕霉素)持续七天。如
图14所示的图表，其“0”代表胸腺瘤挑战GO天)的第一天。值得注意的是，数据表明，同源肿瘤挑战后40天，雷帕霉素治疗能显著提高病毒免疫小鼠的存活。这代表能产生记忆⑶8+T细胞以供持久的肿瘤免疫和阻断。因此，本发明提供了一种预防免疫的有效方法，其可用于例如具有患癌症风险的个体，以及具有复发危险的个体。
图15提供的数据表明mTOR治疗增强了 HP-诱导的抗肿瘤CD8+T细胞反应。特别是，如
图15所示，C57BL/6小鼠进行照射，并且用OT-I⑶8+T细胞重建它们的⑶8+T细胞群。 每天给予雷帕霉素，持续8天，随后用EG.7细胞(表达白蛋白抗原胸腺瘤细胞)挑战小鼠。 再次使用mTOR抑制剂，增强了 HP诱导的肿瘤免疫，如+雷帕霉素线所示的预防性免疫应答。
图16表明了本发明促进了对于卵巢肿瘤的CD8+T细胞介导的ACT (过继细胞治疗) 治疗的增强。具体地说，天然OT-I与所述抗原一起孵育，在有或没有IL-12的情况下，加入乳胶珠、I类MHC的C57BL/6小鼠等价物(H_2Kb)和mTOR抑制剂(雷帕霉素)72小时。收集离体产生的抗原特异性CD8+T细胞，并且注入荷瘤同系受体中(40天)，通过皮下或腹腔注射途径，采用过继转移方法在小鼠中产生M0SEC-0VA肿瘤。在皮下注射产生的肿瘤能进行肿瘤大小测量，而腹腔注射途径产生能用于确定存活时间的数据，其总结在所附图表中。 这些数据显示了控制卵巢肿瘤挑战(第40天)和促进存活的持续能力。因此雷帕霉素处理的抗原加共刺激完全激活的CD8+T细胞，通过与胸腺瘤保护类似的方式，采用过继细胞转移来促进卵巢肿瘤免疫。小鼠表现为无瘤长达300天，表明对于重新挑战的抗性，从而作为记忆性T细胞的指征。
权利要求
1.一种包含分离的⑶8+T细胞群和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的组合物。
2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，⑶8+T细胞构成组合物中所述细胞的至少 10%。
3.如权利要求1所述的组合物，还包含抗原，所述抗原对CD8+T细胞特异性，并且需要在个体中增强对该抗原的免疫应答。
4.如权利要求3所述的组合物，还包含白细胞介素-12(IL-12)。
5.如权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述抗原为肿瘤抗原。
6.一种在需要增强免疫应答的个体中获得对一种抗原的免疫应答增强的方法，包括给予个体所述抗原和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抑制剂。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述个体已经确诊或疑似患有癌症，其中， 所述癌症包含表达所述抗原的癌细胞。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，mTOR抑制剂是在抗原给予后给予个体的。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，mTOR抑制剂至少每天一次给予个体，持续至少7天。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，mTOR抑制剂给予个体连续不超过20天。
11.如权利要求6所述的方法，其特征在于，mTOR抑制剂为雷帕霉素或坦罗莫司 (temsirolimus)。
12.如权利要求6所述的方法，还包括给予所述个体包含特异性针对所述抗原的分离的⑶8+T细胞群。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，在给予个体CD8+T细胞之前，所述抗原已经递呈给⑶8+T细胞了。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，在给予个体CD8+T细胞之前，CDS+T细胞已经接触了 mTOR抑制剂。
15.如权利要求12所述的方法，其特征在于，在给予个体含有CD8+T细胞的组合物之前，所述CD8+T细胞是从个体中分离出来的。
全文摘要
本发明提供了用于增强对抗原免疫反应的组合物和方法。组合物包含分离的CD8+T细胞群和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的抑制剂。获取在个体中增强对抗原免疫应答的方法需要给予个体所述抗原和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的抑制剂。CD8+T细胞也可用于过继细胞转移(ACT)治疗。
文档编号A01N43/04GK102281761SQ201080004875
公开日2011年12月14日 申请日期2010年1月14日 优先权日2009年1月14日
发明者H·金, P·施里肯特, R·拉奥, Y·王, 李庆生 申请人:健康研究股份有限公司