专利名称：产生免疫应答的组合物和方法
技术领域：
本发明涉及分子遗传学和免疫学领域。尤其是，本发明重点在于表达载体和这些载体用于动物的给药方法。
政府支持此处叙述的工作至少部分是由国立卫生研究院(National Institutesof Health)资助(P01 AI43045，P01 AI49364，和R21 AI44325)支持的。因此，美国政府对本发明具有特定的权利。
背景技术：
疫苗对世界健康卫生具有深刻而持久的影响。天花已经根除，脊髓灰质炎接近消除，而诸如白喉，麻疹，腮腺炎，百日咳，和破伤风等疾病依然存在。尽管如此，当前疫苗解决的只是人和家养动物遭受的少数感染。没有疫苗的常见感染性疾病每年就要耗费美国约1千2百亿美元(Robinson等，美国微生物学会(American Academy ofMicrobiology)，1996年5月31日-6月2日)。在第一世界国家，诸如免疫缺陷性病毒等正在出现的传染病，以及例如耐药性肺结核等再度出现的疾病对疫苗开发造成了新的威胁和挑战。在经常得不到有效疫苗或者受到价格过高限制的第三世界国家，对新和改进疫苗的需要更为明显。
HIV-1感染的传播使得这一新近出现病原体的疫苗开发成为世界健康卫生的主要优先顶目。DNA疫苗的预临床试验显示单独DNA在黑猩猩体内能够预防高度减毒HIV-1的攻击(Boyer等，NatureMed.3526-532，1997)，然而在猕猴体内不抗毒力更强的SIV的攻击(Lu等，Vaccine 15920-923，1997)。DNA激活和衣壳糖蛋白加强免疫相结合已经提高了抗SIV和HIV非致病嵌合体同源攻击的中和抗体相关的防护(Letvin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA949378-9383，1997)。测试了八个不同方案对一系列SHIVs(猿和人类免疫缺陷性病毒嵌合体)攻击的防护能力的对比试验显示抑制攻击感染的最好免疫方案包括通过皮内接种DNA进行激活并使用重组禽痘病毒载体组合物进行加强免疫(Robinson等，Nature Med.5526，1999)。攻击性感染的抑制不依赖于攻击病毒中和抗体存在。尽管这些和许多其它努力，用于包括HIV感染的疫苗仍然是不能市售获得。
发明概述AIDS流行的持续强度显示了对抗人类免疫缺陷性病毒(HIV)有效疫苗的迫切需要，HIV频繁地突变并以一些不同分化体(或者亚型)和重组体的形式存在。可能自然或者因为人为干预而出现的这些亚型和重组体形式可以通过它们核酸序列的差异而加以区别。我们已经开发出了DNA载体，病毒载体和重组病毒，例如重组修饰的牛痘Ankara(MVA)病毒(如后所述)，它们能单独或者以组合形式用作抗HIV分化体，亚型，或者重组体形式HIV或者抗多重HIV分化体，亚型，或者重组体形式(除非另作说明，术语“分化体”是指包括亚型或者重组体形式HIV)的疫苗。此外，该载体能够编码各种抗原，这些抗原可以是获自一种分化体或者两种或多种不同分化体，并且可以通过操纵抗原的选择和/或载体制备方式(例如混合)来产生抗各种分化体(例如患者很可能接触的分化体)的保护性免疫应答。
目前还存在对抗诸如引起天花的天花病毒等痘病毒有效疫苗的需要；当前的天花疫苗具有产生大量不良副作用的小危险。尽管天花已经根除，天花作为生物武器仍然威胁着人类。此处叙述的病毒载体可用于产生抗痘病毒的免疫应答。因此，施用这些载体的方法(不考虑遵循的确切方案)还可以引发对抗诸如天花等病症赋予保护性或者治疗性效应的免疫应答(即，可以在受试者已经接触导致诸如天花等病毒性疾病的病原体之前或者之后(例如1-4天或更多天后)施用痘病毒载体)。这些方法是有效的，而不考虑这些载体是否含有疫苗插入片段或者这些插入片段编码何种蛋白(例如，获自HIV的蛋白或者引发抗一种或多种HIV分化体免疫应答的蛋白)。
本发明提供了可用于将核酸递送到细胞的质粒载体和病毒载体；同时本发明包括不含有疫苗“插入片段”的载体，当免疫或者治疗患者时，该载体将包括蛋白抗原的编码核酸，所述蛋白抗原可以诱导或者增强抗病原体(例如一种或多种HIV分化体(或者亚型或者重组体形式))的免疫应答。此处叙述的核酸或者多核苷酸具有来源于cDNA(或者mRNA)或者基因组DNA，及其衍生物(能够与诸如核糖或者脱氧核糖等戊糖连接的嘧啶或者嘌呤环)的线性排列的天然存在和/或合成的核苷酸(或者核苷)。核酸序列可以或者可以不与天然存在的序列相同(例如该序列可以编码突变体形式的HIV蛋白以使得疫苗更安全)。下面讨论可通过本发明描述载体表达的具有特定特性和特定序列的蛋白。
质粒或者病毒载体可以包括代表存在于一种或多种HIV分化体或者其片段及其衍生物中的一种或多种基因的核酸，当它表达时，引发抗该核酸所衍生自或者获自的病毒(或者病毒分化体)的免疫应答。该核酸可以纯化自HIV，或者它们可以是先前克隆，亚克隆，或者合成的，而它们无论如何可以与天然存在的核酸序列相同或者不同。本发明的质粒载体可以是此处所述的表达载体，表达构建体，质粒载体等或者简单地说，质粒，而不考虑它们是否包括疫苗插入片段(即，编码抗原或者免疫原的核酸序列)。也存在类似变化的术语“病毒载体”(例如，我们所指的“病毒载体”为“痘病毒载体”，“牛痘载体”，“修饰的牛痘Ankara载体”，或者“MVA载体”)。这些病毒载体可以包含或者可以不包含疫苗插入片段。
此处叙述的的DNA分子和病毒载体可用于产生重组病毒，该重组病毒能与质粒载体结合使用预防性地或者治疗性地免疫患者。
因此，在一方面，本发明的要点在于包括但是不局限于载体的组合物(包含药学上或者生理学容许的组合物)，该载体可以是具有疫苗插入片段的质粒或者病毒载体。该插入片段可以包含此处叙述序列的一种或多种(该插入片段和代表性序列的特征于后面详细地叙述；任何这些序列或者其组合能被作为插入片段使用)。当该插入片段表达时，表达的蛋白(多种蛋白)可能产生抗一种或多种HIV分化体的免疫应答。通过在单一载体(多载体疫苗也是有用的，将在下面作进一步叙述)的插入片段中包含一种以上分化体在，可以提高免疫应答可有效抗一种以上分化体的可能性。例如，为了提高产生抗分化体B和分化体C免疫应答的可能性，可以对给受试者施用包含编码分化体B和分化体C蛋白插入片段的载体。受试者可以是生活在HIV分化体B和C流行地区或者在其间旅行的人。当然，单一分化体的一种或多种蛋白的表达也是有益的，并且这样的载体也在本发明范围内(此外，可以使用任何具有此处叙述典型插入片段特征或者序列的插入片段，而该插入片段本身是本发明的特征)。
在另一方面，本发明特征在于包括但是不局限于两种载体的组合物(包括药学或者生理学容许的组合物)第一种载体(即包含疫苗插入片段的载体)编码引发(例如诱导或者增强)抗HIV第一种分化体免疫应答的一种或多种抗原，而第二种载体编码引发(例如诱导或者增强)抗HIV第二种分化体免疫应答的一种或多种抗原。然而，该组合物可以包括多于第一和第二种载体的载体；它们可以包括3，4，5，6或更多种不同载体(“不同载体”所指的载体包括不同调控元件(例如不同启动子)，或者编码不同抗原或者抗原组合，或者在其他方面改变的载体(例如“骨架”序列不同的载体)。在一些实施方案中，该组合物可以包括引发抗2，3，4种，或者大多数若非全部HIV分化体的免疫应答所要求的那些载体。虽然一种载体可以编码一种抗原(例如Gag-Pol)，但是一种或多种载体(即，第一种载体，第二种载体，或者二者；第一种，第二种，第三种或者所有3种载体；等等)可以包括编码至少3种抗原的核酸(例如Gag-Pol和Env)，其中每种抗原可以引发主要抗相同HIV分化体的免疫应答(即第一种载体可以表达3种抗原，其中每种抗原产生主要抗分化体A的应答，并且第二种载体可以表达3种抗原，其中每种抗原产生主要抗分化体B的应答)。在其它实施方案中，一种或者多种载体可以引发抗一种以上HIV分化体的免疫应答(即，第一种载体可以表达产生抗分化体A应答的第一种抗原(例如Gag-Pol)而第二种载体可以表达产生抗分化体B应答的第二种抗原(例如Env))。因此，一种或多种载体可以引发抗一种以上HIV分化体的免疫应答。此处叙述的任何类型载体，无论它们是质粒或者病毒载体，或者无论它们是否分别编码引发主要抗一种，或多于一种HIV分化体的抗原，根据希望对其产生免疫力的特定HIV分化体，可以单独或者彼此结合使用。
疫苗插入片段本身(即，用作抗原或者免疫原的HIV蛋白的编码序列)也在本发明范围内。虽然在下面详细地叙述这些插入片段，我们这里应注意本发明特征在于代表修饰的HIV基因组的各种分离的核酸(例如以某些方式重组或者突变的基因组或者一种或多种HIV基因的重组体形式或者片段)。例如，可以从一种或多种基因删除一种或多种核酸或者用其它核酸替换(即该序列可以是一种或多种基因片段并可以包括点突变)。更具体地说，本发明特征在于代表具有安全突变的HIV基因组的分离的核酸(例如，LTRs和编码整合酶(IN)，Vif，Vpr和Nef序列的缺失)。该核酸可以编码Gag，PR，RT，Env，Tat，Rev，和Vpu蛋白，其中一种或多种可能包含安全突变(在下面详细地叙述特定的突变)。此外，分离的核酸可以是任何HIV分化体并且来自不同分化体的核酸可以组合使用(叙述如下)。在此处叙述的工作中，分化体B插入片段被表示为JS(例如JS2，JS7，和JS7.1)，分化体AG插入片段被表示为IC(例如IC2，IC25，IC48，和IC90)，而分化体C插入片段被表示为IN(例如IN2和IN3)。这些插入片段以及包含它们的载体(无论质粒或者病毒)都在本发明范围之内(在下面涉及特定的载体/插入片段组合，例如pGAI/JS2，pGA2/JS2等等)。
携带DNA的表达载体必定受限，因为它们只能用DNA编码产物(即蛋白)来免疫患者，并且细菌和寄生虫的蛋白也可被真核生物细胞进行非典型加工。现有DNA疫苗的另一问题是一些疫苗插入片段序列在细菌中DNA疫苗质粒生长和扩增期间是不稳定的。不稳定性可以出现在质粒生长期间，其中疫苗插入片段或者质粒载体的二级结构(“骨架”)可能被细菌内切酶改变。本发明的表达载体可以包含提高稳定性的终止序列。该终止序列及其它调节组分(例如，启动子和加Poly(A)序列)在下面详细叙述。
本发明的组合物可以施用于人包括儿童。因此，本发明特征在于通过施用一种或多种载体(例如一种或多种质粒，其可以或者可以不必具有相同的序列，组分，或者插入片段(即能够编码抗原的序列)和/或一种或多种病毒载体，其可以或者可以不必相同或者表达相同的抗原)免疫患者(或者引发患者免疫应答，包括多抗原决定簇CD8+T细胞应答)的方法。如上所述，这些载体，无论是质粒或者病毒载体，可以包含一种或多种获自或者衍生自(例如，突变序列是衍生序列)一种或多种HIV分化体的核酸。当这些序列表达时，它们产生引发对一种或多种HIV分化体免疫应答的一种抗原或者多种抗原。在特定的实施方案中，患者接受第一种和第二种载体。第一种载体可以编码第一种HIV分化体的一种或多种抗原(这些抗原可以引发(例如，诱导或者增强)抗这种HIV分化体的免疫应答)而第二种载体可以编码第二种HIV分化体的一种或多种抗原(同样，这些抗原可以引发(例如诱导或者增强)抗第二种HIV分化体的免疫应答)。在另一实施方案中，受试者可以接受编码来自第三，第四，第五种等HIV分化体(及其突变型)、编码一种或多种抗原的第三，第四，第五种等载体。此外，如其它实施方案所述，该抗原(多种抗原)可以来自任何HIV分化体(例如，分化体A-L的一种或者多种)或者任何HIV分离物。
当组合物包含在它们的骨架，调控元件，或者(多个)插入片段方面有区别的载体时，载体在该组合物中的比值和它们的给药途径可以不同。一种载体与另一种载体的比值可以相等或者大略相等(例如大略1∶1或者1∶1∶1等)。或者，该比值可以是任何期望比例(例如1∶2，1∶3，1∶4...1∶10；1∶2∶1，1∶3∶1，1∶4∶1...1∶10∶1等)。因此，本发明特征在于包含各种载体的组合物，表达抗原载体的相对含量大略相等或者在期望比例。当已制备预成型混合物时，当然可以通过给予两种或多种包含载体的组合物实现相同目的(例如，在相同时间(例如彼此相差在几分钟内)或者几乎相同时间(例如连续几天))。
质粒载体可以单独施用(即质粒可以和其它类型疫苗制剂一起或者单独一次或者数次施用(例如施用或者不施用蛋白或者诸如病毒载体等其它类型载体))并且，任选地同佐剂一起或者与可选择的加强免疫结合进行(例如在此之前)(例如诸如重组修饰的牛痘Ankara(MVA)病毒等活的载体疫苗，该载体疫苗含有编码抗原的DNA插入片段，所述抗原相同于或者不同于该免疫“激活”部分编码的抗原)。例如病毒载体或者MVA病毒可以包含至少一些所施用质粒包含的序列作为接种方案“激活”部分(例如编码一种或多种以及可能所有同样的抗原的序列)。佐剂可以是“基因佐剂”(即通过DNA序列递送的蛋白)。同样地，如下所述，可以不施用基于质粒(或者“DNA”)的疫苗，而通过施用活载体疫苗来免疫患者(或者引发免疫应答，包含多抗原决定簇CD8+T细胞应答在内)。因此，在其它实施方案中，本发明特征在于只具有重组病毒或者病毒载体的组合物(选择性地含有一种或多种此处叙述的插入片段，或者具有它们特征的插入片段)以及它们的施用方法。基于病毒的疗法(例如“只有MVA”或者“MVA-MVA”疫苗方案)与此处叙述的“DNA-MVA”方案相同，并且任何疫苗中的MVAs可以是任一期望的比例。例如，在任何情况下(无论免疫方案只使用基于质粒的免疫原，只携带病毒的免疫原，或者两者的结合)，可以包含佐剂以及通过施用大量载体而施用包含获自任何HIV分化体的各种抗原。
术语“免疫”(及其变体)意味着可以将本发明的组合物施用给还没有感染病原体的受试者(因此此处应用的术语“受试者”或者“患者”包括显然健康的或者非HIV感染个体)，但是本发明不限于此；还可以施用本发明描述的组合物来治疗已接触或者已知感染病原体(例如，任何HIV分化体，包含目前已知的A-L分化体及其突变型或者重组体形式)的受试者或者患者。
DNA和rMVA免疫的优点是免疫原可以由MHC类别I和类别II分子呈递。内源合成的蛋白立即进入加工途径将肽抗原决定簇负载到MHC I和MHC II分子上。MHC I呈递的抗原决定簇引发CD8细胞毒性T细胞(Tc)应答，而MHC II呈递的抗原决定簇引发CD4辅助T细胞(Th)应答。相反，并非细胞合成的免疫原主要局限于MHC II抗原决定簇的负载，因此引发CD4 Th而非CD8 Tc应答。此外，DNA质粒只在转染细胞中表达免疫抗原并可用于使免疫应答只集中于期望免疫的抗原。相反，活病毒载体，例如重组MVA病毒能表达许多抗原(例如载体抗原以及免疫抗原)并且产生抗载体和免疫原的免疫应答。因此，我们认为这些活病毒载体可以由于其表达的大量抗原高效地加强DNA引发的应答，优选加强高度靶向DNA引发的免疫应答。这些活病毒载体也刺激增加免疫应答的促炎症性细胞因子的产生。因此，施用此处叙述的一种或多种DNA载体(用作“激活”)和随后施用一种或多种重组体MVA病毒(用作“加强”)，可以比单独的DNA或者单独的活病毒载体更有效地引发细胞和体液免疫。在通过DNA表达载体和/或重组病毒施用疫苗的范围内，需要在细菌宿主中稳定并且在动物中安全使用的质粒。本发明公开了增加了稳定性的基于质粒的疫苗，并且公开了将它们施用给动物包括人类的方法。
DNA或者rMVA编码的抗原必定是蛋白的。术语“蛋白”，“多肽”，和“肽”可广泛地互换，尽管术语“肽”通常是用来指氨基酸残基的短序列或者较大蛋白的片段。无论如何，可以通过使用重组体技术表达天然来源纯化或者合成的DNA(例如，本发明描述的疫苗插入片断和扩增)获得通过肽键连接的氨基酸残基连续系列。
基于DNA疫苗(和诸如基于痘病毒载体等病毒载体)的其它优点叙述如下。在下面的附图和说明中阐明了本发明一种或多种实施方案的详细内容。根据说明书和附图和权利要求书，本发明的其它特征，目标和优点是显而易见的。
附图1是质粒构建体pGA1的示意图。显示了载体中存在的元件(例如启动子的特性和位置，这里是包含内含子A的CMV启动子)，多克隆位点，终止序列(这里是λT0终止子)，和选择基因(这里是卡那霉素抗性基因)。此外还显示了用于将疫苗的插入片段克隆到质粒的特定限制性内切酶位点。
附图2a和2b涉及pGA1。附图2a是pGA1(SEQ ID NO1)核苷酸的序列表，而附图2b是pGA1功能区域，在SEQ ID NO1内的位置，和该序列起点的列表。
附图3a和3b涉及pGA1.1。附图3a是pGA1.1(SEQ ID NO2)核苷酸的序列表，而附图3b是pGA1.1功能区域，在SEQ ID NO2内的位置，和该序列起点的列表。pGA1.1不同于pGA1，因为它在多克隆位点中含有EcoR I限制性内切酶位点。
附图4a和4b涉及pGA1.2。附图4a是pGA1.2(SEQ ID NO3)核苷酸的序列表，而附图4b是pGA1.2功能区域，在SEQ ID NO3内的位置，和该序列起点的列表。pGA1.2不同于pGA1.1因为它在多克隆位点中含有BamH I限制性内酶切位点。
附图5是质粒构建体pGA2的示意图。显示了元件存在于载体中的特性和位置(例如启动子(这里CMV启动子不内含子A)，多克隆位点，终止序列(这里是λT0终止子)，和选择基因(这里是卡那霉素抗性基因)。此外还显示了用于将疫苗的插入片段克隆到质粒的特定限制性内切酶位点。
附图6a和6b涉及pGA2。附图6a是pGA2(SEQ ID NO4)核苷酸的序列表，而附图6b是pGA2功能区域，在SEQ ID NO4内的位置，和该序列起点的列表。
附图7a和7b涉及pGA2.1。附图7a是pGA2.1(SEQ ID NO5)核苷酸的序列表，而附图7b是pGA2.1功能区域，在SEQ ID NO5内的位置，和该序列起点的列表。pGA2.1不同于pGA2因为它在多克隆位点中含有EcoR I限制性内酶切位点。
附图8a和8b涉及pGA2.2。附图8a是pGA2.2(SEQ ID NO6)核苷酸的序列表，而附图8b是pGA2.2功能区域，在SEQ ID NO6内的位置，和该序列起点的列表。PGA2.2不同于pGA2.1因为它在多克隆位点中含有BamH I限制性内酶切位点。
附图9是前病毒(整合DNA)形式的HIV基因组(HIV-1wt)和典型疫苗插入片段的示意图。这些典型的插入片段具有安全性突变，包含LTRs的缺失，整合酶(IN)，Vif，Vpr和Nef编码序列的缺失。该插入片段编码Gag，PR，RT，Env，Tat，Rev和Vpu蛋白。分化体B插入片段表示为JS(分化体B)，IC(分化体AG)和IN(分化体C)用阿拉伯数字表示特异性疫苗构建物(例如特异性分化体B疫苗构建物的实例JS2，JS7和JS7.1；特异性分化体AG疫苗构建物的实例IC2，IC25，IC48和IC90；和特异性分化体C疫苗构建物的实例IN2和IN3)。当被插入pGA1载体中时，带有插入片段的质粒被称为pGA1/JS2等；当被插入pGA2载体中时，质粒被称为pGA2/JS2等。
附图10a到10c涉及pGA2/JS2。附图10a是pGA2/JS2分化体B疫苗载体(SEQ ID NO7)的序列表，而附图10b是pGA2/JS2质粒7个功能区域的位置，这些区域内的基因序列(描述存在突变的位点)，和它们序列起点的列表。附图10c是改变的密码子，产生的氨基酸改变(例如C392S表示在第392位氨基酸残基丝氨酸取代半胱氨酸)，突变存在的基因组区域，和突变功能的列表。
附图11a到11c涉及pGA2/JS7。附图11a是pGA2/JS7分化体B疫苗载体(SEQ ID NO8)的序列表，而附图11b是pGA2/JS7质粒7个功能区域的位置，这些区域内的基因序列(描述存在突变的位点)，和它们序列起点的列表。附图11c是改变的密码子，产生的氨基酸改变(例如C395S表示在第395位氨基酸残基丝氨酸取代半胱氨酸)，突变存在的基因组区域，和突变功能的列表。
附图12a到12c涉及pGA2/JS7.1。附图12a是pGA2/JS7.1分化体B疫苗载体(SEQ ID NO9)的序列表，而附图12b是pGA2/JS7.1功能区域的位置，这些区域内的基因序列(描述存在突变的位点)，和它们序列起点的列表。附图12c是改变的密码子，产生的氨基酸改变，突变存在的基因组区域，和突变功能的列表。
附图13a到13c涉及pGA1/IC25。附图13a是pGA1/IC25分化体AG疫苗载体(SEQ ID NO10)的序列表，而附图13b是pGA1/IC25内功能区域的位置，这些区域内的基因序列(描述存在突变的位点)，和它们序列起点的列表。附图13c是改变的密码子，产生的氨基酸改变，突变存在的基因组区域，和突变功能的列表。
附图14a到14c涉及pGA1/IC2。附图14a是pGA1/IC2分化体AG疫苗载体(SEQ ID NO11)的序列表，而附图14b是pGA1/IC2内功能区域的位置，这些区域内的基因序列(描述存在突变的位点)，和它们序列起点的列表。附图14c是改变的密码子，产生的氨基酸改变，突变存在的基因组区域，和突变功能的列表。
附图15a到15c涉及pGA1/IC48。附图15a是pGA1/IC48分化体AG疫苗载体(SEQ ID NO12)的序列表，而附图15b是pGA1/IC48内功能区域的位置，这些区域内的基因序列(描述存在突变的位点)，和它们序列起点的列表。附图15c是改变的密码子，产生的氨基酸改变，突变存在的基因组区域，和突变功能的列表。
附图16a到16c涉及pGA1/IC90。附图16a是pGA1/IC90分化体AG疫苗载体(SEQ ID NO13)的序列表，而附图16b是pGA1/IC90内功能区域的位置，这些区域内的基因序列(描述存在突变的位点)，和它们序列起点的列表。附图16c是改变的密码子，产生的氨基酸改变，突变存在的基因组区域，和突变功能的列表。
附图17a到17c涉及pGA1/IN3。附图17a是pGA1/IN3分化体C疫苗载体(SEQ ID NO14)的序列表，而附图17b是pGA1/IN3内功能区域的位置，这些区域内的基因序列(描述存在突变的位点)，和它们序列起点的列表。附图17c是改变的密码子，产生的氨基酸改变，突变存在的基因组区域，和突变功能的列表。
附图18a到18c涉及pGA1/IN2。附图18a是pGA1/IN2分化体C疫苗载体(SEQ ID NO15)的序列表，而附图18b是pGA1/IN2内功能区域的位置，这些区域内的基因序列(描述存在突变的位点)，和它们序列起点的列表。附图18c是改变的密码子，产生的氨基酸改变，突变存在的基因组区域，和突变功能的列表。
附图19是HIV-1 Env糖蛋白的示意图。箭头表示gp160裂解成gp120和gp41的位点。在gp120中，断面线区域代表可变区(V1到V2)而明框描绘了保守序列(C1到C5)。在gp41胞外结构域，显示了几个结构域N末端融合肽和2个胞外结构域螺旋(N-和C-螺旋)。跨膜结构域用黑色框表示。在gp41细胞质结构域，显示了Tyr-X-X-Leu(YXXL)内吞作用基元和2个推测的螺旋结构域(螺旋-1和螺旋-2)。氨基酸残基以每间隔100计数。
附图20A和20B涉及质粒转化载体pLW-48。附图20A是pLW-48的图。附图20B展示了其序列。
附图21是质粒转化载体pLW-48的序列，Psy II启动子(其控制ADA衣壳蛋白表达)，ADA衣壳蛋白(截短的)，PmH5启动子(其控制HXB2 gag和pol的表达)，和HXB2 gag-pol(具安全性突变，在RT中灭活的点突变和整合酶的缺失)的图示。
附图22是质粒转化载体pLW-48和制备MVA重组病毒(MVA/HIV48)方案的图示。
附图23是分化体B gag pol的图示。
附图24是Psyn II启动子的图示。
发明详述本发明包括多个种类和类型的载体(例如质粒和病毒载体)，其每个可以但是未必包含一种或多种编码一种或多种抗原的核酸序列，这些抗原引发(例如诱导或者增强)免疫应答以抗抗原获自或者衍生自的病原体(编码引发免疫应答蛋白的序列此处被称为“疫苗插入片段”或者简单地被称为“插入片段”；当突变被引入天然存在的序列中时，产生突变体“衍生自”天然存在的序列)。我们指出所述载体未必编码抗原以清楚表明不具“插入片段”的载体是在本发明范围之内，而插入片段本身也是本发明的组成部分。
因此，本发明特征在于此处公开的核酸序列及其类似物，和包含那些核酸的组合物(附加插入片段的载体或者单独的插入片段；例如可能包含诸如脂质体钙，颗粒(例如金珠)等的载体，或者其它用于将DNA递送到细胞的试剂的生理学溶液)。类似物可以不同于此处公开的序列，而是在该序列(例如此处公开的JS，IC，或者IN序列)内类似位置包含相同或者类似的突变。可以在不同的HIV分化体中鉴定出给定残基或者结构域，尽管它不会出现在准确相同的排列位置。类似物还可以是包含突变的序列，虽然所述序列不同于此处叙述那些的序列，它们同样地使HIV基因产物失活。例如，比这里叙述的基因截短到更大或者更小程度但是同样失活(例如，缺失特定的酶活)的基因也在本发明范围内。
下文详细叙述的病原体和抗原包括人类免疫缺陷性病毒的任何分化体(例如来自任何已知的分化体或者来自任一分离物(例如，分化体A，AG，B，C，D，E，F，G，H，I，J，K或者L))。当载体包括来自病原体的序列时，可以将它们施用给患者以引发免疫应答。因此，此处也叙述了单独或者彼此结合施用编码抗原载体的方法。可以使用这种方法免疫患者(从而减小患者感染的危险)或者治疗已经感染的患者；当表达时，抗原可能引发细胞介导的和体液的免疫应答从而基本上防止感染(例如，免疫可以防止病原体后来的攻击)或者限制对患者健康影响的程度。虽然在许多实例中患者是人类患者，而本发明不作如此限定。还可以治疗包括非人灵长类动物，家养动物和家畜等其它动物。
不管它们抗的病原体或者病原的亚型(例如HIV分化体(多种分化体))，此处叙述的组合物可以包括核酸载体(例如质粒)。此处提及的命名为pGA1，pGA2的质粒(当然包括载体本身)一种或多种特征或者特性(尤其是正向终止序列和强启动子)的载体可被用作疫苗或者治疗的基础。可以使用标准的重组技术(部分在下面的实施例中有说明)通过基因工程操作向这些载体引入编码抗原的序列，当将它们施用给患者并随后表达时可以引发(例如诱导或者增强)免疫应答，所述免疫应答给患者提供一些形式的对抗原获得或者衍生自病原体的保护(例如防止感染，防止疾病，或者改善疾病的一种或多种病征或者症状)。编码的抗原可以是任何HIV分化体或者亚型及其任何重组体形式。至于来自免疫缺陷病毒的插入片段，不同分离物显示出分化的多样性，每一分离物具有分化体共有序列整体类似的多样性(见例如Subbarao等，AIDS10(Suppl A)S13-23，1996)。因此，任何分离物可以合理代表其它相同分化体分离物序列。因此，可使用基因的天然变异体或者源于重组事件，旁路剪接，或者突变(这些变异体此处简单地称为“重组体形式”的HIV)的核酸分子制造本发明的组合物和实施本发明叙述的方法。
此外，可以将任何构建体内的一种或多种插入片段突变(这些人造的变异体此处也被称为“重组形式”的HIV(以及天然存在的重组体形式))以降低它们在人类中的天然生物活性(并且因此增加它们的安全性)。在JS2，JS7和JS7.1的说明中如上提到的以及如下所述(见例如实施例7-10)，可以将突变引入参与衣壳形成的序列中。例如可以突变(通过例如全部或者部分缺失)HIV非编码调节序列中顺式作用的RNA衣壳形成序列。另外，或者此外可以突变编码任何抗原性蛋白的序列(例如，任何HIV抗原，包括上列的那些(例如，病毒RT或者蛋白酶))。
例如，本发明的组合物包括具有2个载体的那些组合物(a)第一种载体含有编码一种或多种抗原的疫苗插入片段，这些抗原引发抗人类免疫缺陷性病毒(HIV)第一种亚型或者重组体形式的免疫应答以及(b)第二种载体含有编码一种或多种抗原的疫苗插入片段，这些抗原引发抗人类免疫缺陷性病毒(HIV)第二种亚型或者重组体形式的免疫应答。该组合物可以是药学上容许的并且可以包括载体或者佐剂(后面叙述)。此外，第一种载体的插入片段或者第二种载体的插入片段可以包括下述的两种或多种序列(a)gag，pol，env，tat，rev，nef，vif，vpr，或者vpu基因或者(b)它们的突变型以及，选择性地，(c)HIV基因组的非编码调节序列(包括单个启动子的序列)。至少两种或多种序列的一种可以是突变型或者突变以限制病毒RNA的衣壳形成(优选地，(多个)突变略微限制衣壳形成)。
可以使用本领域已知的技术引入突变并且测定它们的影响(例如对表达或者免疫原性的影响)；那些保持良好表达(例如表达大约和野生型对应物一样或者超过野生型对应物的抗原)，但是比它们野生型对应物的生物学活性小的抗原，在本发明范围内。评价免疫应答的技术也是有用的。例如可以检测抗病毒抗体或者病毒特异性T细胞。
突变型构建体(例如，疫苗插入片段)可以包括编码一种或多种此处叙述的取代突变的序列(见例如实施例)或者另一HIV分化体的类似突变。另外，或者可选择地，HIV抗原可以通过删除编码序列的部分来产生更小的活性。因此，本发明的组合物可以包括编码能够引发免疫应答抗原的构建体，这些抗原是突变型(编码与相应野生型序列长度或者内容不同的蛋白)并且因此当在患者体内表达时较少能实现它们正常的生物学功能。如上所述，可以使用分子生物学和免疫学的标准技术来评价它们的表达，免疫原性和活性。
已经构建了一些质粒并用于表达抗原(例如，pGA2/JS2构建体已经在猕猴中进行免疫原性研究)。制备和使用的质粒包括pGA1及其衍生物pGA1.1和pGA1.2；以及pGA2，及其衍生物pGA2.1和pGA2.2(见实施例1-8)。我们构造的疫苗构建体通常指的是用反斜线符号分开的“骨架”载体和“插入片段”。这些构建体表达HIV-1抗原，而且这些构建体可以如此处所述施用给患者。虽然在下面详细讨论到抗原(野生型和包含突变使它们可更安全给药的那些抗原)，我们这里注意，基于我们给出的证据，包含JS7类插入片段的质粒看起来显示出更好的免疫原性并且比包含JS2类插入片段的质粒对激活免疫应答更有效(通过抗Env抗体证明)。pGA2/JS7以及pGA2/JS7.1在各个方面不同于pGA2/JS2，其中之一是它们相应抗原的来源。在pGA2/JS7和pGA2/JS7.1中，Gag和Pol基因获自HIV-1 HXB2，而在pGA2/JS2中那些基因获自密切相关的HIV-1，HIV-1 BH10分离物。因此，本发明特征在于包括获自HIV-1 HXB2的Gag和Pol基因的插入片段(以及包含它们的载体和组合物)。此外，这些插入片段可以包含抑制Gag-Pol执行的一种或多种生物学活性的突变。命名为JS7和JS2的疫苗插入片段也不同因为JS7在蛋白酶基因中具有失活点突变。我们认为，这些突变通过阻止pr55 Gag蛋白早熟的细胞内裂解促进病毒类粒子(VLPs)的形成，pGA2/JS7和pGA2/JS7.1都包含蛋白酶突变并且两个构建体都产生大量的VLPs。因此，本发明特征在于包括突变型gag和/或pol序列的插入片段(例如，抑制蛋白酶基因的突变(例如，一种或多种缺失或者点突变))。pGA2/JS7.1中vpu基因的其它点突变导致Vpu表达的缺失和Env表达的增加(在pGA2/JS7.1中，Vpu起始位点和下游的ATG被突变以解除Vpu的翻译)。Env表达的增加并不损害Gag表达。
在包括gag，pol的任何疫苗插入片段中；任何编码病毒蛋白酶的疫苗插入片段中；或者任何包括vpu基因(不管它获自的分化体或者分离物)的疫苗插入片段可以产生相同或者类似的改变。此外，可以在置入任何质粒或者活载体疫苗(例如MVA)的疫苗插入片段中进行这些改变(即任何具有pGA载体一种或多种特征或者特性的质粒，pGA载体自身，或者可被单独或者结合用作(例如增强)DNA激活患者的疫苗载体)。
本发明范围内的任何质粒可以通过转染细胞诸如293T细胞(人胚肾细胞系)来测试表达和(通过例如抗原俘获ELISA或者Western印迹)来评价抗原表达水平。与此处测试质粒相比表达免疫原的水平接近或者较高的质粒是较好的治疗候选物并且在本发明的范围之内(当然，任何引发有效免疫应答(例如，任何理想的防护感染程度或者其它治疗的益处)的构建体也在本发明范围之内，不管它产生抗原的表达水平)。可以类似评价候选载体产生VLPs的能力；类似VLPs的载体产物越多，它们越有可能引发强烈的抗体反应(而这是理想的特征，没能形成VLPs的载体仍然是有用的并且在本发明范围之内)。除了评价细胞培养中表达和VLP形成之外，可以评价体内候选物载体。例如，可以评价动物模型中(以及最后人类患者中)的免疫原性。那些具有和此处叙述的pGA载体基本上相同序列的质粒和此处叙述的表达一种或多种抗原的质粒在本发明范围之内，只要它们的免疫原性足以在患者中诱导或者增强治疗上有利的应答(质粒可以具有与pGA载体基本上相同序列，甚至是诸如标志基因或者抗生素抗性基因等质粒的一种或多种构成部分已经被删除)。在免疫原性的动物试验中，可以对响应于抗原性肽刺激的IFN-γ产生进行细胞内细胞因子试验或者ELISPOT试验以评价T细胞应答那些肽的频率。还可以进行增殖试验。可以用瞬时转染产生的抗原进行刺激，并且可以用模拟转染培养物的上清液作为对照。如果需要，该数据可以作为刺激指数(在病原体(例如病毒)抗原存在情况下培养物的生长除以在模拟抗原存在情况下培养物的生长)。
本发明的核酸载体，包括pGA1和pGA2和它们的衍生物可以编码至少获自或者来源于任何HIV分化体或者分离物(即任何亚型或者重组体形式的HIV)的一种抗原(也可以称为免疫原)。抗原(或免疫原)可以是HIV病毒的结构成分；糖基化的，肉豆蔻酰基化的，或者磷酸化的；胞内，细胞表面，或者分泌表达的(通常分泌的抗原可以是与控制分泌的信号序列连接)。更具体地说，抗原可以是Gag，gp120，Pol，Env(例如使用CCR5的Env；例见附图19)，Tat，Rev，Vpu，Nef，Vif，Vpr，或者VLP(例如来源于VLP能够形成VLP的多肽，包括缺失Env的HIV VLP)的全部或者抗原性部分。
特定的插入片段和带有插入片段的组合物包括下列那些组合物。其中该组合物包括带有插入片段的载体或者插入片段自身的载体，而且插入片段编码单一抗原，该抗原可以是野生型或者突变型gag序列(例如在一种或多种编码锌指结构的序列中具有突变的gag序列(例如在SEQ ID NO7或者8的1279-1281，1288-1290，1342-1344，或者1351-1353位置或者在另一分化体HIV gag序列类似位置))。因为突变是用来改变编码的蛋白，它不会是沉默突变(例如在密码子第三碱基摇摆位置(包括于本发明插入片段中的gap或者任一其它HIV序列))。刚刚列举位置的一种或者更多突变可能将392，395，413，或者416位置的半胱氨酸残基改变为另一个残基(例如丝氨酸)。另外地，另外突变可以在SEQ ID NO10-13的1271-1273，1280-1282，1334-1336，或者1343-1345的任何位置或者在另一分化体HIV gag序列的类似位置。这些突变可能将390，393，411，或者414位置的一个或多个半胱氨酸残基改变为其它残基(例如丝氨酸)。另外，突变可以在SEQ ID NOs14或者15的1260-1262，1269-1271，1323-1325，或者1332-1334的任何位置或者在另一分化体HIV gag序列的类似位置。这些突变可能将390，393，411，或者414位置的一个或者多个半胱氨酸残基改变为其它残基(例如丝氨酸)。
当组合物包括带有插入片段的载体或者单独的插入片段时，而且插入片段编码多种蛋白抗原，一种抗原可以是野生型或者突变型gag序列，包括如上所述的那些。同样地，当一种组合物包括多于一种插入片段或多于一种载体时，至少一种载体或者插入片段(编码单一抗原或者多种抗原)可以包括野生型或者突变型gag序列，包括如上所述的那些或者来自其它HIV分化体的类似序列。例如，当组合物包括第一种和第二种载体时，二者之一或者两个载体的插入片段(插入片段编码单个的或者多种抗原)可以编码Gag；当两个载体都编码Gag时，第一种载体的Gag序列可以来自一种HIV分化体(例如，分化体B)而第二种载体的Gag序列可以来自另外的HIV分化体(分化体C)。
当组合物包括带有插入片段的载体或者单独的插入片段，而插入片段编码单一的抗原，该抗原可以是野生型或者突变型Pol。可以通过删除或者替换一种或多种核酸突变该序列，而缺失或者替换可以导致Pol基因产物与野生型对应物相比较具有较少酶活性(例如较少整合酶活性，较少逆转录酶(RT)活性，或者较少蛋白酶活性)。例如可以通过向SEQ ID NO7的2454-2456或者2697-2699位置或者其它亚型或者重组体形式序列的类似位置的一个或者更多位点引入突变从而抑制RT活性。虽然本发明不局限于对酶活性具有特定影响的突变，我们认为在2454-2456位置的突变通过失活聚合酶活性部位抑制RT和在2697-2699位置的突变通过除去链转移活性抑制RT。因此，这些突变以及其它对基因产物活性具有类似影响的突变在本发明范围之内。更具体地说，所述突变可以将SEQ ID NO7的2454-2456位置的核苷酸编码的氨基酸(天冬氨酸(D))改变为任意另外的氨基酸(例如天门冬酰胺(N))。另外，或者此外，可以通过例如在SEQ ID NO7的3333-3335位核苷酸引入突变来抑制聚合酶的RNase H活性(例如突变将谷氨酸残基(E)改变为色氨酸残基(W))。或者，可以通过例如在SEQ ID NO8或者9(其它分化体B插入片段)的2418-2420，2661-2663，或者3297-3299位核苷酸引入突变。另外，可以在SEQ ID NOs10-13中任意的2410-2412，2653-2655，或者3289-3291位核苷酸引入突变(例如在这些位置的天冬氨酸(W)，酪氨酸(W)和谷氨酸(W)残基可以分别被改变为天冬酰氨(N)，苏氨酸(T)，和/或谷氨酰氨(Q))。另外，可以在SEQID NOs14或者15中任意的2387-2389，2630-2632，或者3266-3268位核苷酸引入突变。本领域的普通技术人员可以辨认出其它分化体中编码类似残基的核酸，即使那些残基并不和在这里测试的分化体中出现在准确相同的位置。
当组合物包括带有插入片段的载体或者单独的插入片段，而且插入片段编码多种蛋白抗原，其中一种抗原可以是野生型或者突变型pol序列，包括如上所述的那些(这些编码多种蛋白的插入片段还可以编码如上所述的野生型或者突变型gag序列)。同样地，当组合物包括多于一种插入片段或多于一种载体时，至少一种载体或者插入片段(编码单一抗原或者多种抗原)可以包括野生型或者突变型pol序列，包括如上所述的那些(以及选择性地，野生型或者突变型gag序列，包括如上所述的那些(即插入片段可以编码Gag-Pol))。例如，当组合物包括第一种和第二种载体时，二者之一或者两个载体的疫苗插入片段(插入片段编码单个的或者多种抗原)可以编码Pol；当两个载体编码Pol时，第一种载体的Pol序列可以来自一种HIV分化体(例如分化体B)而第二种载体的Pol序列可以来自另外的HIV分化体(分化体C)。
当插入片段包括一些或者所有pol序列，可以改变的pol序列的另外一部分是编码蛋白酶活性的序列(无论影响Pol其它酶活性的序列是否被改变)。例如，可以在SEQ ID NO8的1641-1643位置引入突变(例如将正常时由这个密码子编码的谷氨酸残基改变为其它氨基酸残基，例如丙氨酸(A)的突变)。如同此处叙述的其它突变体(例如gag突变体)，可以在获自其它HIV分化体的序列中制造类似的突变。例如，可以在SEQ ID NO10的1633-1635位置引入突变(将精氨酸(R)改变为另一种的氨基酸，诸如天冬酰氨(N))，在SEQ ID NO12的1703-1705位置引入突变(将甘氨酸(G)改变为另一种的氨基酸，诸如缬氨酸(V))，或者在SEQ ID NO13的1828-1830位置引入突变(将亮氨酸(L)改变为另一种残基，诸如甲硫氨酸(M))(SEQ IDNO10，12和13都代表AG序列)。在来自分化体C的插入片段中，可以在SEQ ID NO14的1610-1612位置引入突变(将天冬氨酸(D)改变为另一种氨基酸，诸如天冬酰氨(N))。
当组合物包括带有插入片段的载体或者单独的插入片段，而该插入片段编码单一抗原，该抗原可以是野生型或者突变型Env，Tat，Rev，Nef，Vif，Vpr，或者Vpu。当组合物包括带有插入片段的载体或者单独的插入片段，而插入片段编码多种蛋白抗原，该抗原的一种可以是野生型或者突变型Env。例如，多种蛋白插入片段可以编码野生型或者突变型Gag-Pol和Env；他们还可以编码野生型或者突变型Gag-Pol和Env和一个或多个Tat，Rev，Nef，Vif，Vpr，或者Vpu(每个可以是野生型或者突变型)。如同其它抗原一样，Env，Tat，Rev，Nef，Vif，Vpr，或者Vpu可以是由于一个或者更多氨基酸残基缺失，添加或者替换(例如任何抗原可以包括点突变)而产生的突变型。至于Env，一个或多个突变可以在附图19的任何结构域中。例如，可以从gp 120表面和/或gp41跨膜裂解产物上删除一个或多个氨基酸。至于Gag，可以从基质蛋白(pu7)，衣壳蛋白(p24)，核壳蛋白(p7)和C-末端肽(p6)上删除一个或多个氨基酸。例如，可以删除这些区域的一个或多个氨基酸(特别要求该载体是病毒载体，诸如MVA)。至于Pol，可以从蛋白酶蛋白(p10)，逆转录酶蛋白(p66/p51)，或者整合酶蛋白(p32)上删除一个或多个氨基酸。
更具体地说，本发明的组合物可以包括载体(例如质粒或者病毒载体)它们编码(a)其中一个或多个锌指结构已经失活以限制病毒RNA包装的Gag蛋白；(b)Pol蛋白，其中(i)整合酶活性已经通过一些或者所有pol序列的缺失而受到抑制以及(ii)聚合酶，链转移和/或逆转录酶的RNase H活性已经通过pol序列内的一个或多个点突变受到抑制；以及(c)具有或者没有突变的Env，Tat，Rev，和Vpu。在这个以及其它实施方案中，编码的蛋白可以获自或者衍生自亚型A，B或者C HIV(例如HIV-1)或者它的重组体形式。其中该组合物包括不相同的载体，在各种载体中的序列可以来自不同HIV分化体(或者它的亚型或者重组体形式)。例如，本发明特征在于包括编码刚刚叙述抗原(Gag-Pol，Env等等)的质粒载体，其中一些质粒包括获自或者衍生自一个分化体的抗原而其它质粒包括获自(或者衍生自)另外分化体的抗原。具有2种，3种，4种，5种，6种或更多分化体(包括所有分化体)的混合物在本发明范围之内。
当第一种和第二种载体被包含在组合物中时，载体可以是pGA1/JS2，pGA1/JS7，pGA1/JS7.1，pGA2/JS2，pGA2/JS7，pGA2/JS7.1(pGA1.1或者pGA1.2可被用于替换pGA1而pGA2.1或者pGA2.2可被用于替换pGA2)。同样地，载体可以是pGA1/IC25，pGA1/IC2，pGA1/IC48，pGA1/IC90，pGA2/IC25，pGA2/IC2，pGA2/IC48，或者pGA2/IC90(同样，pGA1.1或者pGA1.2可被用于替换pGA1而pGA2.1或者pGA2.2可被用于替换pGA2)。在替代的实施方案中，编码的蛋白可以是，或者衍生自C亚型HIV(例如HIV-1)的那些或者它的重组体形式。例如，该载体可以是pGA1/IN2，pGA1.1/IN2，pGA1.2/IN2，pGA1/IN3，pGA1.1/IN3，pGA1.2/IN3，pGA2/IN2，pGA2.1/IN2，pGA2.2/IN2，pGA2/IN3，pGA2.1/IN3，或者pGA2.2/IN3。
编码的蛋白还可以是或者衍生自HIV分化体(或者亚型)E，F，G，H，I，J，K或者L或者它们的重组体形式。HIV-1分类系统已经由LosAlamos国家实验室出版(HIV序列概略-2001，kuiken等，理论生物学和生物物理学组T-10出版，Los Alamos，NM，(2001)；http//hiv-web.lanl.gov)。
本发明的组合物还可以包括载体(例如质粒载体)，它们编码(a)其中一个或者两个锌指结构已经失活的Gag蛋白；(b)Pol蛋白，其中(i)整合酶活性已经通过一些或者pol序列的缺失受到抑制，(ii)聚合酶，链转移和/或逆转录酶的RNase H活性已经通过在pol序列之内的一个或多个点突变受到抑制，以及(iii)蛋白酶的蛋白分解活性已经通过一个或多个点突变受到抑制；以及(c)有或者没有突变的Env，Tat，Rev和Vpu。如上所述，可以通过向SEQ ID NO8的1641-1643位置或者另外的HIV分化体序列的类似位置引入突变以抑制蛋白分解活性。例如，质粒可以包含此处叙述的插入片段JS7，IC25，和IN3。编码其它抗原的质粒，编码刚刚叙述抗原的质粒可以与编码获自，或者衍生自不同HIV分化体(或者亚型或者它的重组体形式)的其它质粒结合(例如，混合)。(没有载体)的插入片段本身也在本发明范围内。
本发明的其它载体包括的质粒编码Gag蛋白(例如其中一个或者两个锌指结构已经失活的Gag蛋白)；Pol蛋白(例如其中整合酶，RT，和/或蛋白酶活性已被抑制的Pol；Vpu蛋白(可以是通过具有突变型起始密码子的序列编码)；和Env，Tat，和/或Rev蛋白(野生型或者突变体形式)。同样编码其它抗原的质粒，编码刚刚叙述抗原的质粒可以与编码获自，或者衍生自不同HIV分化体(或者亚型或者它的重组体形式)的其它质粒结合(例如，混合)。(没有载体)的插入片段本身也在本发明范围内。
如上所述的质粒，包括表达JS2或者JS7系列分化体B HIV-1序列的那些，可以施用于任何受试者，但是多数受益性给予已经或者可能接触HIV分化体B的受试者(除了质粒载体的载体同样如此)。同样地，表达IN系列分化体C HIV-1序列的质粒或者其它载体可以施用给已经或者可能接触分化体C HIV的受试者。因为表达不同分化体抗原的载体可以结合引发抗多于一个分化体的免疫应答(无论表达来自不同分化体多重抗原的一种载体或者表达来自不同分化体单个抗原的多重载体)，可以制作疫苗制剂以更好地保护给定的受试者。例如，如果受试者可能接触世界上分化体B以外的分化体占优势的地区，可以配制和施用表达抗原(或者多种抗原)的载体或者(多种)载体以使对主要的分化体或者(多种)分化体的免疫应答最佳化。
载体表达的抗原不是可以变化的质粒载体的唯一部分。有用的质粒可以或者可以不必包含基本上抑制转录的终止子序列(通过加工在DNA模板上通过互补碱基配对形成RNA分子)。有用的终止子序列包括λT0终止子和它的有功能的片段或者变异体。终止子序列以和原核生物内表达的可读框C末端相同取向处于载体上(即终止子序列和可读框连接在同一操纵子上)。当质粒在原核细胞中复制时通过阻止从选择性标记通读到疫苗插入片段，终止子可以在细菌生长和质粒复制时稳定插入的片段。
本领域已知的选择性标记基因包括例如，编码赋予标记表达细胞对抗生素抗性蛋白的基因(例如对卡那霉素，氨苄青霉素，或者青霉素抗性)。选择性标记如此称谓，因为它容许根据在缺乏标记可能杀死它们的条件选择细胞。选择性标记，终止子序列，或者两个(各自或者二者的一部分)可以是，但是不必是在施用给患者前从质粒切除。同样地，在通过限制性核酸内切酶消化而线性化之后，或者在一些载体“骨架”已经改变或者删除之后，可以以环状形式施用质粒载体。
核酸载体还可以包括复制起点(例如原核的ori)和转录盒，转录盒除包含一个或多个限制性内切酶位点之外，编码抗原的插入片段可以被克隆插入其中，并选择性地包括启动子序列和聚腺苷酸化信号。可以使用并且优选已知的强启动子。这些启动子之一是细胞巨化病毒(CMV)中间早期启动子，尽管可以使用其它(包括较弱的)启动子而不背离本发明的范围。同样地，可以挑选强聚腺苷酸化信号(例如衍生自牛生长激素(BGH)编码基因的信号，或者兔β球蛋白聚腺苷酸化信号(Bohm等，J.Immunol.Methods 19329-40，1996；Chapman等，Nucl.Acids Res.193979-3986，1991；Hartikka等，Hum.Gene Therapy71205-1217，1996；Manthorpe等，Hum.Gene Therapy 4419-431，1993；Montgomery等，DNA Cell Biol.12777-783，1993))。
载体可以进一步包括前导序列(转录盒任选的前导序列是组织纤溶酶原激活物基因(tPA)前导序列合成的同系物)和/或诸如巨细胞病毒(CMV)内含子A或者SV40内含子等内含子序列。内含子A的存在增加许多来自RNA病毒，细菌，和寄生虫抗原的表达，大概通过提供给表达的RNA支持加工的序列以及作为真核生物mRNA起作用。本领域中已知的用于增强表达的其它方法包括但不限于用于真核细胞的原核生物mRNAs密码子选择的优化(Andre等，J.Virol.721497-1503，1998；Uchijima等，J.Immunol.1615594-5599，1998)。多顺反子载体可被用来表达多于一种免疫原或者免疫原和刺激免疫蛋白(Iwasaki等，J.Immunol.1584591-4601，1997a；Wild等，Vaccine 16353-360，1998)。因此(以及同样载体构造的其它任选组分)，编码来自一个或多个HIV分化体或者分离物的一种或多种抗原的载体可以，但是未必，包括前导序列和内含子(例如CMV内含子A)。
本发明的载体区别在于能被用于接受编码抗原序列的位点，和是否转录盒在CMVIE启动子中包括内含子A序列。因此，本领域的普通技术人员可以修饰质粒内的(多个)插入位点或者(多个)克隆位点只要不背离本发明的范围。内含子A和tPA前导序列在特定的实例中显示出能够增强抗原表达(Chapman等，Nucleic Acids Research 193979-3986，1991)。
如下所述，本发明的载体可以与佐剂，包括遗传学佐剂一起施用。因此，核酸载体，不管它们表达的抗原，可以选择性地包括诸如GM-CSF，IL-15，IL-2，干扰素响应因子，分泌形式的flt-3，和突变的半胱氨酸蛋白酶基因等遗传学佐剂。还可以以融合蛋白的形式供给遗传学佐剂，例如通过融合一个或多个C3d基因序列(1-3个(或更多)C3d基因序列)来表达抗原。
如果施用的载体是pGA载体，它可以包括例如pGA1(SEQ ID NO1)及其衍生物(例如SEQ ID NOs2和3)或者pGA2(SEQ ID NO4)及其衍生物(例如SEQ ID NOs5和6)序列。此处更详细地叙述了pGA载体(参见实施例1-8)。pGA1是3897bp的质粒，包括启动子(bp 1-690)，CMV内含子A(bp 691-1638)，tPA前导序列合成的模仿物(bp 1659-1721)，牛生长素加Poly(A)序列(bp 1761-1983)，λT0终止子(bp 1984-2018)，卡那霉素抗性基因(bp 2037-2830)和ColEI复制子(bp 2831-3890)。pGA1构建体(SEQ ID NO1)的DNA序列显示于附图2。在附图1中，显示的限制酶切位点用于克隆编码抗原的序列。将疫苗插入片段的5′端克隆在tPA前导序列的上游时使用Cla I或者BspD I位点。Nhe I位点用于克隆与tPA前导序列相同读码框的序列。列举的在Sma I和Bln I之间的位点被用来克隆抗原编码序列的3′末端。
pGA2是2947bp的质粒，缺乏存在于pGA1中的947bp的内含子A序列。除了缺失内含子A序列外，pGA2同pGA1一样。pGA2的价值在于克隆不需要用于有效表达的上游内含子序列，或者当其中上游内含子可能干扰良好表达需要的拼接模式时用于克隆序列。附图5显示了具有用于克隆疫苗插入片段的限制性酶切位点的pGA2的示意图。附图6a显示了pGA2的DNA序列(SEQ ID NO2)。将疫苗克隆入pGA2的限制性酶切位点的用途与用来将片段克隆入pGA1的限制性酶切位点相同。pGA2.1和pGA2.2是pGA2的多克隆位点衍生物。附图7a和8a分别显示了pGA2.1(SEQ ID NO5)和pGA2.2(SEQ ID NO6)的DNA序列。
具有不同于此处公开的“骨架”序列的pGA质粒也在本发明范围内，只要质粒基本上保持所有有效治疗所必需的特性(例如可以替换核苷酸，增加核苷酸，或者删除核苷酸，只要给予患者的质粒能够诱导或者增强抗给定或者目的病原体的免疫应答)。例如可以删除或者取代1-10，11-20，21-30，31-40，41-50，51-60，61-70，71-80，81-90，91-100或者100以上个核苷酸。
在一个实施方案中，本发明的方法(例如，引发患者免疫应答的方法)可以通过给患者施用治疗有效量的生理学容许的组合物来进行，该组合物包括可以包含编码引发抗HIV免疫应答的一种或多种抗原的疫苗插入片段的载体。载体可以是具有如上所述pGA构建物的一个或多个特性的质粒载体(例如选择性标记基因，原核生物来源的复制起点，终止序列(例如，λT0终止子)和与选择性基因标记在同一操纵子上的连接，和含有启动子序列的真核生物转录盒，编码至少一种衍生自免疫缺陷病毒抗原的核酸插入片段，和聚腺苷酸化信号序列)。当然，本发明的疫苗插入片段可以通过不具有pGA构建物特性的质粒载体递送(例如pGA1或者pGA2外的载体)。另外，该组合物可以包括任何此处叙述的包含插入片段的病毒或者细菌载体。因此本发明包括单一类型载体(即包含相同疫苗插入片段的质粒或者病毒载体(即编码相同抗原的插入片段))的给药。如同在别处已经说明清楚的，患者可以接受2种载体，载体中的每一个可以引发抗不同HIV分化体的免疫应答。例如，本发明特征在于患者接受组合物的方法，其中包括(a)第一种载体，含有编码一种或多种抗原的疫苗插入片段，可以引发抗人类免疫缺陷性病毒(HIV)第一种亚型或者重组体形式的免疫应答以及(b)第二种载体，含有编码一种或多种抗原的疫苗插入片段，可以引发抗HIV第二种亚型或者重组体形式的免疫应答。第一种和第二种载体可以是任何此处叙述的那些。同样地，第一种和第二种载体中的插入片段可以是任何此处叙述的那些。
可以通过肌内注射或者皮内的途径施用治疗上有效量的载体(可以考虑第一个，第二个，第三种载体等等)，连同生理学容许的载体，稀释剂，或者赋形剂，以及选择性地，佐剂。可以随后通过肌内注射或者皮内的途径施用治疗上有效量的同样或者不同的载体(可以考虑第一个，第二个，第三种载体等等)，连同生理学容许的填料，稀释剂，或者赋形剂，以及选择性地，佐剂来增强免疫应答。本领域的普通技术人员可以很容易地选择这些组分，而不考虑疫苗引入的抗原或者递送载体的准确特征。
引发免疫应答的方法可以通过如下途径进行单独施用本发明质粒载体来，通过单独施用本发明病毒载体或者重组病毒，或者通过给予二者(例如可以给予质粒载体(或者质粒载体的混合物或者组合))来″激活″免疫应答并且通过给予病毒载体或者重组病毒(例如可以给予质粒载体(或者质粒载体的混合物或者组合))来“加强”免疫应答。当施用质粒和病毒载体或者重组病毒时，它们的插入片段可以是“相匹配”的。为了“相匹配”，质粒内的一种或者多种序列(例如编码Gag的序列，或者编码Env的序列等等)和重组病毒内的病毒载体可以是一样的，但是该名词不限于此。“相匹配”的序列相互间可以不同。例如，当DNA载体内使用的序列被突变或者进一步突变以允许(或者优化)病毒载体转染的细胞中编码这些序列的病毒载体的复制和编码抗原(例如Gag，Gag-Pol，或者Env)的表达，病毒载体表达的插入片段和DNA载体表达的那些是“相匹配”的。
至少本发明的一些免疫缺陷病毒疫苗插入片段被设计用于产生来自单个DNA的非感染性VLPs(该名词可以包括真正的VLPs和病毒蛋白的聚集物)。使用正常被免疫缺陷病毒使用的亚基因组剪切元件获得疫苗插入片段来表达来自单个病毒RNA的多重基因产物。亚基因组剪切模式受到(i)全长病毒RNA中存在的剪切位点和受体，(ii)Rev反应元件(RRE)，和(iii)Rev蛋白的影响。反转录病毒RNA剪切位点使用真核生物RNAs剪切位点的规范序列。RRE是大约200bp的RNA结构，它与Rev蛋白相互作用以容许病毒RNA从细胞核转运到细胞质。当缺乏Rev时，大约10kb的免疫缺陷病毒RNA大部分剪切为调节基因Tat，Rev，和Nef的mRNAs。这些基因由RT和Env之间存在的外显子编码并且处在基因组的3’末端。当存在Rev时，除Tat，Rev，和Nef mRNAs外，表达单独剪切的Env mRNA和未剪切的Gag和Pol mRNA。
来自单个DNA的非感染性VLPs的表达提供给免疫缺陷病毒疫苗许多好处。来自单个DNA的大量蛋白的表达提供给疫苗宿主应答存在于这些蛋白中的大量T-和B-细胞抗原决定簇的机会。含有多个抗原决定簇的蛋白的表达可以提供具有不同组织相容性类型的抗原决定簇。通过使用全蛋白，可以给具有不同组织相容性类型的宿主提供增强广幅的T细胞应答的机会。这对于免疫缺陷病毒感染的有效抑制是必要的，这些病毒的高突变率使它们容易逃离免疫应答(Evans等，Nat.Med.51270-1276，1999；Poignard等，Immunity10431-438，1999，Evans et al.，1995)。在本疫苗接种方案的上下文，正如在药物疗法中，需要多重突变用于逃避的多抗原决定簇T细胞应答可以提供比单个抗原决定簇T细胞应答(需要仅仅单突变用于逃避)更好的保护。
还可以操作免疫原通过将表达的抗原靶定到特定的细胞间隔来使其或多或少有效地形成抗体或者Tc。例如，比起定位到细胞内部的抗原，通过将抗原显示在细胞的原生质膜上或者从那里分泌，可以更有效地引发抗体应答(Boyle等，Int.Immunol.21897-1906，1997；Inchauspe等，DNA Cell.Biol.16185-195，1997)。N-末端泛素蛋白化信号通过将DNA编码的蛋白定位到蛋白体，使细胞质迅速降解并且更有效地将肽负载到MHC I途径，可以增强Tc应答(Rodriguez等，J.Virol.718497-8503，1997；Tobery等，J.Exp.Med.185909-920，1997；Wu等，J.Immunol.1596037-6043，1997).。对DNA引发的免疫应答的机制基础的综述，见Robinson和Perter的，病毒研究进展(Advances in VirusResearch)，第53卷，Academic Press(2000)。
另外的操作免疫应答的方法是将免疫原融合到免疫靶向或者免疫刺激分子。迄今为止，这些融合中最成功的是将分泌的免疫原定向到抗原呈递细胞(APCs)或者淋巴结(Boyle等，Nature392408-411，1998)。因此，本发明特征在于融合到诸如CTLA-4，L-选择蛋白，或者细胞因子(例如诸如IL-1，IL-2，IL-4，IL-7，IL-10，IL-15或者IL-21)等免疫定向或者免疫刺激分子的此处叙述的HIV抗原。编码这些融合的核酸和包含它们的组合物(例如载体和生理学容许的制剂)也在本发明范围内。
可以以任何可用于递送本发明质粒到受试者的各种方式递送DNA。例如，DNA可以以例如盐水(例如使用皮下注射针)或者以生物学方法(通过例如给涂敷DNA小珠加速的基因枪)递送。盐水注射将DNA递送到细胞间隙，而基因枪将轰击的DNA直接递送进细胞。盐水注射需要比基因枪更大量的DNA(一般100-1000倍)(Fynan等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA9011478-11482，1993)。这2种递送方式不同在于盐水注射偏嗜应答1型T细胞辅助细胞，而基因枪递送偏嗜应答2型T细胞辅助细胞(Feltquate等J.Immunol.1582278-2284，1997；Pertmer等J.Virol.706119-6125，1996)。在盐水中DNAs的注射快速地传遍躯体。通过基因枪递送更接近定位于目标附近。遵循这两种接种方法之一，胞外的质粒DNA具有大约10分钟的短半衰期(Kawabata等，Pharm.Res.12825-830，1995；Lew等，Hum.Gene Ther.6553，1995)。通过盐水注射的疫苗接种可以是肌内(i.m.)或者皮内(i.d.)注射；基因枪递送可以施用于皮肤或者诸如肌肉等外科接触的组织。
虽然通常较少关切其它递送途径，然而它们可以用来施用本发明的组合物。例如，DNA可以被施用于粘膜或者通过肠胃外的途径接种。盐水中DNA的鼻内给药具有两个好处(Asakura等Scand.J.Immunol.46326-330，1997；Sasaki等，Infect.Immun.66823-826，1998b)并且已经有有限的成功(Fynan等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA9011478-82，1993)。基因枪通过将DNA递送到粘液鞘成功地产生IgG(Livingston等，Ann.NewYork Acad.Sci.772265-267，1995)。通过使用脂质体(McCluskie等，Antisense Nucleic Acid Drug Dev.8401-414，1998)，微球体(Chen等，J.Virol.725757-5761，1998a；Jones等，Vaccine15814-817，1997)和重组体志贺氏菌载体(Sizemore等，Science270299-302，1995；Sizemore等，Vaccine15804-807，1997)已经实现了递送DNA到粘膜表面的某些成功。诸如这些试剂(脂质体，微球体和重组体志贺氏菌载体)可用于递送本发明的核酸。
产生应答需要的DNA剂量取决于递送方法，宿主，载体，和编码的抗原。递送方法可能是最有影响的参数。通常使用从10微克到5毫克DNA进行DNA盐水注射，而更通常使用从0.2微克到20微克DNA进行DNA基因枪递送。通常，较低剂量的DNA被用于小鼠(从10到100微克用于盐水注射而从0.2到2微克用于基因枪递送)，而较高剂量用于灵长类动物(从100微克到1毫克用于盐水注射而从2到20微克用于基因枪递送)。基因枪递送需要的低得多量的DNA反映出金颗粒直接递送DNA进入细胞。
除如上所述DNA载体之外，许多不同痘病毒能被单独(即，没有核酸或者DNA激活剂)或者作为疫苗接种的加强组分使用。MVA在小鼠模型中尤其有效(Schneider等，Nat.Med.4397-402，1998)。MVA是牛痘病毒的高度减毒株，其被开发用于帮助根除天花，而它已经在多于100,000人中进行了安全性测试(Mahnel等，Berl.Munch TierarztlWochenschr107253-256，1994；Mayr等，Zentralbl.Bakteriol.167375-390，1978)。在鸡细胞中在超过500次传代期间，MVA丢失大约10％其基因组及其在灵长类动物细胞中有效复制的能力。尽管其有限的复制，MVA被证明是卓有成效的表达载体(Sutter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA8910847-10851，1992)，在灵长类动物中产生对副流感病毒(Durbin等，J.Infect.Dis.1791345-1351，1999)，麻疹(Stittelaar等，J.Virol.744236-4243，2000)，和免疫缺陷病毒(Barouch等，J.Virol.755151-5158，2001；Ourmanov等，J.Virol.742740-2751，2000；Amara等，J.Virol.767625-7631，2002)的保护性免疫应答。MVA比较高的免疫原性部分归因于一些病毒抗免疫防卫基因的损失(Blanchard等，J.Gen.Virol.791159-1167，1998)。
牛痘病毒被用于构建用于重组体基因表达和作为重组体活疫苗的病毒载体(Mackett等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA797415-7419；Smith等，Biotech.Genet.Engin.Rev.2383-407，1984)。可能编码此处叙述的任何HIV抗原的DNA序列，可以被引入牛痘病毒的基因组。如果基因整合在不是病毒生活周期必需的病毒DNA位点，它有可能用于重新产生感染性的(即，能感染其它细胞)的重组体牛痘病毒并且表达整合的DNA序列。优选地，病毒载体特征在于本发明的组合物和方法是高度减毒的。开发了一些减毒的牛痘病毒病毒株以避免天花疫苗接种法不期望的副作用。修饰的牛痘Ankara(MVA)病毒是牛痘病毒Ankara毒株通过在鸡胚胎成纤维细胞上长期的连续传代产生的(CVA；见Mayr等，Infection36-14，1975)。MVA病毒可以从美国模式培养物保藏所(ATCC；No.VR-1508；Manassas，VA)公开获得。MVA毒株在临床试验中显示出理想的特性(Mayr等，Zentralbl.Bakteriol.167375-390，1978；Stickl等，Dtsch.Med.Wschr.992386-2392，1974；Sutter和Moss，Proc.Natl.Acad.Sci.USA8910847-10851，1992)。在对超过120,000人，包括高危险患者的研究中，未发现与使用MVA疫苗有关的副作用。
MVA载体可以通过如下方法制备。在允许同源重组存在的条件下将DNA构建体引入用MVA感染的细胞，该DNA构建体包含例如此处叙述的插入片段序列，编码外来多肽(例如此处叙述的任何HIV抗原)的DNA序列，其侧翼连接的MVA DNA序列邻近于MVA基因组天然存在的缺失(例如，缺失III或者其它不需要的(多个)位点；已经鉴定出基因组DNA的6个主要缺失(命名为缺失I，II，III，IV，V，和VI)总共31,000对碱基对(Meyer等，J.Gen.Virol.721031-1038，1991))。一旦DNA构建体被引入真核细胞并且外源DNA与病毒DNA重组，可以通过本领域已知的方法分离重组体牛痘病毒(通过利用可检测的标记分离更为方便)。要插入的构建DNA可以是线性的或者环状的(例如质粒，线性化质粒，基因，基因片段，或者修饰的HIV基因组)。外源DNA序列插入在靠近天然存在缺失的序列之间。为了更好的表达DNA序列，该序列可以包括调节序列(例如启动子，诸如牛痘11kDa基因或者7.5kDa基因的启动子)。DNA构建体可以通过各种方法引入MVA感染的细胞，包括磷酸钙辅助的转染(Graham等，Virol.52456-467，1973和Wigler等，Cell 16777-785，1979)，电穿孔法(Neumann等，EMBO J.1841-845，1982)，显微注射(Graessmann等，Meth.Enzymol.101482-492，1983)，通过脂质体(Straubinger等，Meth.Enzymol.101512-527，1983)，通过原生质球(Schaffner，Proc.Natl.Acad.Sci.USA772163-2167，1980)，或者通过本领域已知的其它方法。重组体MVA病毒制剂在Moss等，PCT公开WO 02/07275 A2(国际
发明者哈里耶特·L·鲁宾逊, 詹姆斯·史密斯, 简华, 伯纳德·莫斯, 拉马·阿马拉, 泰德·M·罗斯, 里克·阿瑟·布赖特, 林达·怀亚特, 帕特里夏·厄尔, 丹尼斯·埃伦伯格, T·福克斯, S·布泰拉 申请人:爱莫里大学, 美国政府健康及人类服务部, 美国政府健康及人类服务部，疾病控制和预防中心