一种鉴别大黄鱼遗传性别的分子标记及其应用的制作方法

本发明涉及水产生物技术领域中的鱼类遗传性别鉴定和性别控制技术，具体涉及一种鉴别大黄鱼遗传性别的分子标记及其应用。

背景技术：

在生命科学研究领域，性别研究一直是一个热点命题，吸引着众多研究者的关注。鱼类在动物进化中处于承前启后的地位，且物种数量丰富。同大多数脊椎动物类似，不少鱼类也是雌雄异体，具有性别二态性，即在形态和生理上表现出显著的雌雄两性差异。而且，一些鱼类物种的个体生长等重要经济性状及经济价值与性别密切相关。因此，开发这些鱼类的单性育种与养殖技术在鱼类养殖产业上具有重大的意义。许多鱼类尽管在生长上存在性别二态性，但在外部形态上雌雄鱼却没有显著差异，尤其是在性腺尚未发育成熟时，其性别往往难以从外部形态上区分；甚至有一些鱼类存在天然的性反转现象，在不同的环境或者通过人工诱导可以改变其生理性别，但性别改变前后没有形态上的差异，无法通过外部形态识别其遗传性别。这些问题的存在给单性育种、养殖及相关的遗传学基础研究带来很大的困扰，尤其是性别决定分子机制研究。因此，针对这些鱼类物种开发可以准确鉴定其遗传性别的分子标记，不仅对这些鱼类遗传学相关的研究，而且对开展单性育种与养殖从而提高鱼产量、增加水产养殖收益都有着非常重要的意义。

大黄鱼(larimichthyscrocea)隶属脊索动物门、脊椎动物亚门、硬骨鱼纲、鲈形目、石首鱼科、黄鱼属，分布于东亚沿海，兼具食用和药用价值。大黄鱼具有显著的雌雄生长二态性，同时期的大黄鱼雌鱼生长速度显著快于雄鱼，且达到成熟时的雌鱼个体较雄鱼个体大，开发大黄鱼单性育种及单性养殖技术具有重要的产业意义。但在性腺发育成熟之前，很难从外部形态上加以区分雌鱼和雄鱼，胚胎和幼体阶段雌雄鱼形态上几乎没有区别；据已有的研究表明，大黄鱼不存在异形性染色体，也无法从细胞学角度鉴定其遗传性别；这给其单性育种技术的开发带来了很大困难。因此，开发一种可以准确鉴别其遗传性别的分子标记用于大黄鱼性别控制育种具有极大的生产应用价值。

随着分子生物学技术的发展，目前已有多种类型的dna分子标记技术，其中主要包括：(1)限制性片段长度多态性(restrictionfragmentlengthpolymorphism，rflp)；(2)随机扩增多态性dna(randomamplificationpolymorphismdna，rapd)；(3)扩增片段长度多态性(amplifiedfragmentlengthpolymorphism，aflp)；(4)微卫星标记(microsatellite)，又称为短串联重复序列(shorttandemrepeats，strs)或简单重复序列(simplesequencerepeat，ssr)；(5)单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，snp)。利用上述dna分子标记技术，已经有许多物种的性别特异的分子标记被开发出来，但不同物种其基因组dna序列结构不同，没有一个物种的性别特异分子标记可以被用于对其他物种的遗传性别进行鉴定，只能针对不同物种分别进行开发。可以识别与鉴定(鉴别)大黄鱼遗传性别的分子标记迄今为止国内外都还没有见到报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种鉴别大黄鱼遗传性别的分子标记。

为实现上述目的，本发明提供一种大黄鱼遗传性别相关的分子标记，其特征在于，所述分子标记表现为seeidno:1所示核苷酸序列的插入/缺失长度多态性。

进一步，具有seeidno:1所示核苷酸序列的个体，表现为雌性大黄鱼；缺失seqidno:1所示核苷酸序列的个体，表现为雄性大黄鱼。

进一步，所述引物对具有seqidno:2-3或seqidno:4-5所示的核苷酸序列。

进一步，利用所述引物对seqidno:2-3对待检测大黄鱼基因组dna进行pcr扩增，并检测扩增片段的长度，当所述扩增片段为112bp时，所述待测大黄鱼具有seqidno:1所示核苷酸序列的插入，表现为雄性大黄鱼；当没有出现所述扩增片段时，所述待测大黄鱼具有seqidno:1所示核苷酸序列的缺失，表现为雌性大黄鱼；或

利用所述引物对seqidno:4-5对待检测大黄鱼基因组dna进行pcr扩增，并检测扩增片段的长度，当所述扩增片段有两条，分别为229bp和214bp时，所述待测大黄鱼具有seqidno:1所示核苷酸序列的插入，表现为雄性大黄鱼；当所述扩增片段为214bp时，所述待测大黄鱼具有seqidno:1所示核苷酸序列的缺失，表现为雌性大黄鱼。

本发明还提供一种用于检测所述分子标记的试剂盒，其特征在于，包括所述的引物对。

所述分子标记，所述引物对，或所述试剂盒，在大黄鱼育种中的用途。

本发明还提供一种鉴别大黄鱼性别的方法，其特征在于，对待测大黄鱼进行所述分子标记的检测，以便确定所述待测大黄鱼的性别。

进一步，所述方法包括：

利用所述引物对，所述试剂盒，对待测大黄鱼基因组dna进行pcr扩增；

检测扩增片段的长度，以及

基于所述扩展片段的长度，确定所述待测大黄鱼的性别，

其中，当所述扩增片段为112bp，或者229bp和214bp时，所述待测大黄鱼具有seqidno:1所示核苷酸序列的插入，表现为雄性大黄鱼；当没有出现所述扩增片段或扩增片段为214bp时，所述待测大黄鱼具有seqidno:1所示核苷酸序列的缺失，表现为雌性大黄鱼。

进一步，利用凝胶电泳,优选琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳，检测所述扩增片段的长度。

本发明还提供一种大黄鱼辅助育种方法，其特征在于，所述方法包括：通过所述方法，检测所述分子标记，以便确定待测大黄鱼的性别。

本发明的申请人比较了一处大黄鱼雌雄鱼基因组差异的序列(见图1)，经过分析发现:seqidno:1为与大黄鱼性别相关的分子标记。所述分子标记核苷酸序列为：

5'aatgagtttcactca3'(15bp)seqidno:1

本发明所述引物对序列如下所示：

a.lyc-ms引物

lyc-ms-f:5'ggctctgtgaggcgtctt3'seqidno:2

lyc-ms-r:5'cttacagttatctgcaatttgtatg3'seqidno:3

b.lyc-mfs引物

lyc-mfs-f:5'tggctctgtgaggcgtct3'seqidno:4

lyc-mfs-r:5'atacaatgatgacatcaatcctgat3'seqidno:5

采用本发明的分子标记进行黄鱼遗传性别的鉴别，与现有的鉴别大黄鱼遗传性别的方法相比，具有明显的优势：只需剪取大黄鱼的部分组织或提取部分血液用来提取基因组dna，进而从最小程度上减少对鱼体的伤害。然后用所提供的引物做pcr，结合电泳检测，即可快速、准确地鉴定不同生长阶段的大黄鱼不同个体的遗传性别。

本发明具有如下优点：

1、本发明提供的大黄鱼遗传性别相关的分子标记不受大黄鱼生长阶段的限制，可用于大黄鱼的早期选育，节省时间，同时可显著促进大黄鱼的育种进程。

2、检测大黄鱼如seqidno:1所示的大黄鱼性别相关的分子标记的方法准确可靠，操作方便，成本低廉。

3、大黄鱼如seqidno:1所示的大黄鱼性别相关的分子标记的检出，为大黄鱼性别的辅助选择提供了科学依据。

附图说明

图1为本发明公开的部分大黄鱼雌雄鱼全基因组重测序序列比对图。

图2为本发明用于验证一处大黄鱼雌雄鱼基因组差异序列设计的lyc-mfs引物序列图。

图3为本发明采用lyc-mfs引物验证一处大黄鱼雌雄鱼基因组差异序列得到的电泳图。

图4为本发明公开已经验证的一处大黄鱼雌雄鱼基因组差异的序列图。

图5为本发明根据公开的一处大黄鱼雌雄鱼基因组差异的序列设计的lyc-ms引物序列图。

图6为实施例采用lyc-ms引物进行pcr扩增，鉴定大黄鱼遗传性别的电泳图。

图7为实施例采用lyc-mfs引物进行pcr扩增，鉴定大黄鱼遗传性别的电泳图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：大黄鱼性别特异分子标记

大黄鱼是二倍体生物且为xx/xy型性别决定系统，雌性为xx，雄性为xy。通过对6组雌雄大黄鱼全基因组重测序数据进行比对分析，结果显示来自雄鱼的序列中存在15bp的缺失，如图1。鉴于雄鱼x染色体的序列同于雌鱼两条x染色体的序列，且该片段只在雄鱼中缺失，雌鱼不缺失，推测该缺失片段可能存在于雄鱼y染色体上。进一步对6组数据中含有15bp片段的读长进行统计分析，统计结果见表1。

表1对大黄鱼雌雄鱼全基因组重测序序列中存在15bp缺失的读长的统计表

从表1可以看出，只有在雄性测序序列中存在着15bp的缺失。

为此，发明人根据其两端的序列设计了lyc-mfs引物(图2)，以大黄鱼的基因组dna进行pcr扩增，扩增结果如图3显示。从图3可以看出，在雄性个体中扩增出两个片段，而雌性个体中只有一个片段。

为进一步验证差异序列的准确性，将pcr产物送到华大基因进行sanger测序，并对测序的结果进行比对分析，部分序列比对结果如图4。图中呈现了雌性(♀)的x染色体序列(两条x染色体序列相同)和雄性(♂)的一条x染色体序列及一条y染色体序列的比对。从图4中可以看出，这15bp片段只在雄性个体中缺少，即在y染色体上缺失，由此说明该15bp的插入缺失片段是大黄鱼遗传性别的分子标记。

实施例2、大黄鱼遗传性别的识别与鉴定

剪取待测大黄鱼的部分鳍条，放入95％的酒精溶液中，-20℃保存，相对应的个体通过解剖及组织学观察确认其性别并进行记录。利用dna提取试剂盒提取基因组dna，所得的基因组dna稀释到30ng/μl左右作为模板备用；

申请人设计如下两对引物(其中lyc-mfs引物已经用于上述分子标记的验证)：

a.lyc-ms引物

lyc-ms-f:5'ggctctgtgaggcgtctt3'seqidno:2

lyc-ms-r:5'cttacagttatctgcaatttgtatg3'seqidno:3

b.lyc-mfs引物

lyc-mfs-f:5'tggctctgtgaggcgtct3'seqidno:4

lyc-mfs-r:5'atacaatgatgacatcaatcctgat3'seqidno:5

其中，lyc-ms的下游引物跨越该差异的序列，lyc-mfs的上下游引物分别在该差异的序列的两边。请参阅图2和图5。引物合成厂家为上海华大基因科技有限公司。

pcr反应体系：反应总体积为10μl，具体反应体系为：1μl10×pcrbuffer(含mg^2﹢)，0.8μl2.5mmdntps，1μl30ng/μldna(即模板)，10μm上下游引物各0.2～0.4μl，0.1μl5u/μltaqdna聚合酶，最后以ddh2o补齐。

pcr扩增条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；最后72℃延伸10min。

琼脂糖凝胶电泳检测及结果分析：

选用lyc-ms引物(yc-ms-f/r，即seqidno:2-3)进行扩增的pcr产物，电泳检测可采用1％的琼脂糖凝胶，电压120v，电流120a，电泳时间30min。结果图6所示。其中泳道m为marker，其他泳道标记♀的表示检测的是雌性大黄鱼的dna，标记♂的表示检测的是雄性大黄鱼的dna。从图6可以看出，该引物组合能够从所有雄性个体的基因组dna中扩增出一条长约112bp的特异片段，而在所有雌性个体的基因组dna中没有扩增片段。

选用lyc-mfs引物(lyc-mfs-f/r，即seqidno:4-5)进行扩增的pcr产物，电泳检测可采用3％的琼脂糖凝胶，电压120v，电流120a，电泳时间60min。结果图7所示。其中泳道m为marker，其他泳道标记雌的表示检测的是雌性大黄鱼的dna，标记雄的表示检测的是雄性大黄鱼的dna。从图7可以看出，该引物组合能够在所有雄性个体的基因组dna中扩增出两条特异条带，一条约229bp，一条约214bp，而在所有雌性个体的基因组dna中只可以扩增出一条约214bp的特异条带。

应用两对引物鉴别出的大黄鱼的遗传性别一致，且与解剖组织学观察确认的性别一致。因此，采用本发明的引物均能准确的鉴别出大黄鱼的性别。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

sequencelisting

<110>集美大学

<120>一种鉴别大黄鱼遗传性别的分子标记及其应用

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