使用性别选择的精细胞提高猪的品系或品种的遗传进展的方法

使用性别选择的精细胞提高猪的品系或品种的遗传进展的方法
【专利摘要】本发明涉及在人工授精技术中通过使用性别选择的精细胞提高猪的品系、品种或种群的遗传进展的方法。本发明还涵盖通过深子宫内导管或腹腔镜手术对猪人工授精的方法，这使得性别选择的精细胞的使用量降低。
【专利说明】使用性别选择的精细胞提高猪的品系或品种的遗传进展的 方法
[0001] 本申请要求2013年3月15日提交的美国申请号13/840,598和2012年6月6日 提交的美国申请号61/656, 446的权益。 发明领域
[0002] 本发明涉及在人工授精技术中通过使用性别选择的精细胞提高猪的品系、品种或 种群的遗传进展的方法。本发明还涵盖通过深子宫内导管或腹腔镜手术（laparoscopic procedure)对猪人工授精的方法，这使得性别选择的精细胞的使用剂量降低。
[0003] 背景
[0004] 在养猪业中有必要提高品系和品种中的需要的遗传变化的速率以及降低育种和 商业化养猪场中的经营成本。本文中公开的本发明通过以下方式来实现这些目标：允许育 种或商业农场的经营者使用性别选择的精细胞样品选择后代猪的性别和/或允许使用少 得多的遗传优良的公猪，后者是通过借助于深子宫内导管或腹腔镜使用减少的用于人工授 精操作的精细胞剂量实现的。
[0005] 发明概述
[0006] 本发明的一个实施方案包括一种提高猪的品系或品种的遗传进展的方法，所述方 法包括从来自所述品系或品种的公猪采集精液样品；将所述精液样品分选到至少两个精细 胞亚群中，其中第一亚群的至少80%具有X染色体或Y染色体；用来自所述第一亚群的精 细胞对来自所述品系或品种的母猪授精；由所述母猪生产一个或多个后代；对一个或多个 所述后代计算选择指数；和选择一个或多个具有与所述品系或品种的平均选择指数相比更 高的选择指数的所述后代与来自所述品系或品种的猪育种以便提高所述品系或品种的遗 传进展。
[0007] 本发明的另一个实施方案包括一种提高猪的品系或品种的遗传进展的方法，所述 方法包括从来自所述品系或品种的公猪采集精液样品；将所述精液样品分选到至少两个精 细胞亚群中，其中第一亚群的至少80%具有X染色体或Y染色体；用来自所述第一亚群的 精细胞对来自所述品系或品种的母猪授精；由所述母猪生产一个或多个后代；在一个或多 个所述后代中获得性状的数值；和选择一个或多个所述后代与来自所述品系或品种的猪育 种以便提高所述品系或品种的遗传进展，所述后代具有的所述性状的数值比所述品系或品 种中的所述性状的平均值更大或更小。
[0008] 在本发明的一些实施方案中，要与本发明一起使用的精液样品被分选到至少两 个精细胞亚群中，其中至少 60 %、60-65 %、65 %、65-70 %、70 %、70-75 %、75 %、75-80 %、 80%、80-85%、85%、85-90%、90%、90-95%、95%、95-99%或约99%的第一亚群具有父染 色体和/或Y染色体。
[0009] 另一种用于提高猪的品系或品种的遗传进展的方法包括使用从所述品系或品种 的公猪获得的性别选择的精细胞样品制备一个或多个胚胎或受精卵（在体内或体外），并 且随后通过本领域已知的任何方法将所述一个或多个胚胎或受精卵转移到母猪中妊娠。在 本发明的某些方面中，卵供体是来自某种品系或品种的母猪。在本发明的一些具体实施方 案中，使用深子宫内导管或腹腔镜将所述胚胎或受精卵转移到母猪中或转移出母猪。这种 方法还可以进一步包括以下步骤：计算由所述胚胎或受精卵产生的一个或多个后代的选择 指数；根据与所述品系或品种的平均选择指数相比具有更高的选择指数的所述一个或多个 后代选择一个或多个所述后代；使用与所述品系或品种的平均选择指数相比具有更高的选 择指数的所述一个或多个后代与来自相同品系或品种的猪育种以便提高那种品系或品种 的选择强度。本发明的另一个实施方案包括使用这些胚胎或受精卵重组（repopulate)品 系、品种和/或种群。
[0010] 本发明的另一个方面包括根据在所述胚胎或受精卵中存在或不存在遗传标记选 择用于本发明的胚胎或受精卵。在某些实施方案中，这种遗传标记可以通过从所述胚胎或 受精卵中移除一个或多个卵裂球并且检测所述一个或多个卵裂球存在或不存在所述遗传 标记来筛选。所述遗传标记可以是，例如，本文中公开的任何猪性状的标记或与本文中公开 的任何猪性状有关的标记。在某些实施方案中，在4-16细胞期、4-10细胞期或4-8细胞期 从所述胚胎或受精卵移除一个或多个卵裂球。可以使用本领域已知的任何技术从胚胎或受 精卵移除卵裂球，包括但不限于在美国专利号7, 893, 315中公开的那些，所述专利的公开 内容在此以引用方式全部并入本文。简单地说，其中描述的一种方法包括固定胚胎并且轻 敲所述固定的胚胎直到卵裂球被分离（所述胚胎可以使用微量吸管固定并且轻敲所述微 量吸管的支架以分离所述卵裂球）。在某些实施方案中，筛选所述胚胎或受精卵的遗传标记 包括将从所述胚胎或受精卵获得的卵裂球或细胞基因分型。筛选胚胎或受精卵的遗传标记 的技术在美国专利号8, 338, 098中公开，所述专利的公开内容在此以引用方式全部并入本 文。简单地说，可以使用汇集DNA测序手段确定单核苷酸多态性（SNP)，并且随后可以通过 基于PCR-限制性片断长度多态性（PCR-RFLP)的方法实现确定的SNP的基因分型。
[0011] 与本发明一起使用的分选的精细胞构成"性别选择的"精细胞样品。性别选择的 精细胞样品可以通过本领域已知的任何技术获得。在本发明的一个实施方案中，所述性别 选择的精细胞样品可以使用流式细胞仪制备。在本发明的任何实施方案中使用的性别选择 的精细胞可以使用任何已知的方法低温保存并且随后在使用之前解冻，或者此外可以使用 新鲜的（即，从未冷冻）性别选择的精细胞。
[0012] 术语"品系"和"品种"表示具有共同来源和相似的识别特性的一组动物。本发明 还适用于猪的"纯品系"和"纯品种"，正如本领域中使用的那些术语。
[0013] 术语"选择指数"是指根据育种者选择的某些性状的猪的表达对于个别猪品种产 生的数值评分。通常育种者将会对每个猪的品系或品种指定给定数目的性状（常称为选择 对象），并且可以进一步区别地衡量每个性状在产生选择指数中的重要性。对于猪来说更高 的选择指数表示猪表达或携带那些性状的程度更高。
[0014] 在本发明的某些实施方案中，可以使用任何想要的基因型或表现型性状为猪的品 系或品种构建选择指数。可以在选择指数中使用的表现型性状包括但不限于饲料转化率、 平均日增重、胴体瘦肉、胴体品质、生育力、每窝产仔数和产奶量。
[0015] 在本发明的一些实施方案中，可以使用仅仅从那个特定的猪获得的数据（即，个 体数据）来计算特定的猪的选择指数，或者此外，可以使用来源于包括那个特定的猪或是 那个特定的猪的代表的数据（即，群体数据）来计算特定的猪的选择指数。例如，可以在个 体的公猪中测量饲料转化率一因此，在这个实例中的公猪的选择指数将会基于个体数据。 此外，可以测量与所讨论的公猪一起饲养的公猪群体的饲料转化率一在这个实例中的公猪 的选择指数基于群体数据。
[0016] 本发明的其它方面涵盖使用深子宫内导管或插入所述母猪的膜的针头用性别选 择的精细胞对来自所述品系或品种的母猪授精。这些实施方案中的一些涵盖可用于将精细 胞放入母猪的生殖道中的已知的手术和非手术技术，包括剖腹手术（涉及穿过腹壁的大切 口以进入腹腔的手术操作）。这种实施方案涵盖使用IxlO 9或更少个总精细胞对母猪授精。
[0017] 在其它实施方案中，可以使用深子宫内导管将精细胞样品施用到母猪的生殖道的 远端部分中，如一个或多个子宫角或一个或多个子宫-输卵管接合处。在本发明的另一个 方面中，所述深子宫内导管由外管或外鞘和内柔性探针组成。在本发明的又一个方面中，所 述柔性的内探针包括液体或细胞可以通过的柔性内管道。在本发明的某些实施方案中，所 述外管和内柔性探针可以由塑料制成，在其它实施方案中，它们可以由被构造成诸如盘管 或弹簧构造等的柔性金属制成。在又一个实施方案中，所述深子宫内导管包括用于观察母 猪的生殖道内的深子宫内导管远端部分的位置的摄像机或显示器。在替代实施方案中，可 以使用放射显影或荧光透视法观察所述所述母猪的生殖道内的深子宫内导管。在本发明的 另一个实施方案中，可以使用深子宫内导管从诸如来自一个或多个子宫角或来自一个或多 个子宫-输卵管接合处的母猪的生殖道远端部分插入或取出胚胎或受精卵等。
[0018] 相对于用深子宫内导管授精，涵盖对母猪施用IxlO9个精细胞或更少的剂量。这些 精细胞可以是性别选择的精细胞。在本发明的一个实施方案中，通过深子宫内导管将一定 剂量的性别选择的精细胞（例如600xl0 6个，但是可以更多，或在发情期最佳时机放入最佳 位置就低至IOxlO6个）施用到母猪的一个或两个子宫角（例如，每个子宫角中300xl0 6个精 细胞）中。在其它实施方案中，剂量可以在约300xl06、约150xl06、约140xl0 6、约ΙΟΟχΙΟ6、 约70xl06、约50xl06或约5x10 6个性别选择的精细胞或更少的范围内变化或在这个范围之 间的任何剂量，并且可以施用到母猪的一个或两个子宫角中。
[0019] 上述剂量可以在多种体积中施用，包括但不限于每150xl06个精细胞5ml，或 相同数目的细胞在以下范围的体积中施用：5ml、10ml、15ml、20ml、25ml、30ml或100ml， 或 5-10ml、10-20ml、20-30ml、30-40ml、40-50ml、50-60ml、60-70ml、70-80ml、80-90ml 或 90-100ml之间的某个体积。
[0020] 在本发明的任何实施方案中使用的性别选择的精细胞可以低温保存并且随后解 冻，或此外可以使用新鲜（即，从未冷冻）性别选择的精细胞。上述剂量也可以施用到母猪 的一个或多个子宫-输卵管接合处中。
[0021] 本发明的这种实施方案也涵盖使用腹腔镜观察用于施用性别选择的精细胞样品 的插入母猪的膜的针头。用于注射精细胞样品的针头和腹腔镜（以及诸如镊子等操纵仪 器）都可以通过腹腔镜手术典型的小切口插入母猪的腹部。本发明还涵盖在雌性生殖道内 的一个或多个位置中注射精细胞样品。仅通过举例的方式，可以将精细胞样品注射到母猪 子宫内的一个或多个位置中，包括一个或多个子宫角、输卵管、壶腹、峡部或子宫-输卵管 接合处。在本发明的另一个实施方案中，可以借助于腹腔镜从母猪的生殖道插入或取出胚 胎或受精卵。
[0022] 相对于借助于腹腔镜授精，涵盖对母猪施用IxlO9个精细胞或更少的剂量。这些精 细胞可以是性别选择的精细胞。在本发明的一个实施方案中，可以通过腹腔镜将约500xl06 个性别选择的精细胞或更少的剂量注射到一个或两个输卵管中（例如，每个输卵管中 25(^106个精细胞）；在其它实施方案中，可以将在约1(^10 6、约51106、约31106、约2.(^106、 约I. 2xl06、约IxlO6或0. 6x10 6个性别选择的精细胞或更少范围内的剂量或在这个范围之 间的任何剂量注射到母猪的一个或两个输卵管中。
[0023] 在又一个实施方案中，可以将性别选择的精细胞注射到输卵管的特定区域中，包 括但不限于峡部、壶腹和/或子宫-输卵管接合处。在某些实施方案中，可以将在约5xl0 6、 约2xl06、约lxlO6、约600xl03、约500xl0 3、约300xl03或约150x10 3个性别选择的精细胞或 更少范围内的剂量或在这个范围之间的任何剂量注射到输卵管的一个或多个区域，无论是 单侧或双侧。
[0024] 在又一个实施方案中，就借助于腹腔镜授精而论，可以使用在每个壶腹中注射约 500xl0 3个性别选择的精细胞每个子宫-输卵管接合处注射约1x10 6个性别选择的精细胞 范围内的剂量；或每个壶腹注射约IxlO6个性别选择的精细胞每个子宫-输卵管接合处注 射约2xl0 6个性别选择的精细胞的剂量；或每个壶腹注射约5x105个性别选择的精细胞每个 子宫-输卵管接合处注射约2xl0 6个性别选择的精细胞的剂量；或每个壶腹注射约5x10 5个 性别选择的精细胞每个子宫-输卵管接合处注射约IxlO6个性别选择的精细胞的剂量或在 这些范围之间的任何剂量在输卵管中的多个部位多次注射。上述剂量可以包含在多种体积 中，举例来说，每IxlO 12个精细胞1〇〇μ 1，或相同数目的精细胞在以下体积之一中或在以下 任何体积之间的体积中：50μ 1、100μ 1、200μ 1、300μ 1、400μ 1 或 500μ 1。
[0025] 本发明的另一个方面包括通过对母猪施用一种或多种激素或激素类似物使要使 用本文中公开的实施方案授精的母猪发情期同步和/或诱导定时排卵。在一个实施方案 中，所述一种或多种激素或激素类似物包括PG600 (包含怀孕母马血清促性腺激素、"PMSG" 和人绒毛膜促性腺激素、"hCG" ；InterVet)、OvuGel (借助于阴道内输送系统的醋酸曲普瑞 林缓释配方；Gel Med Sciences, Inc.)、马绒毛膜促性腺激素、"eCG"、hCG或孕激素。
[0026] 在本发明的又一个实施方案中，所述一种或多种激素或激素类似物是通过放入所 述母猪的生殖道的可编程装置施用的。本文中涵盖的可编程装置能够以定时释放的方式释 放所述一种或多种激素或激素类似物，所述方式不需要育种者必须监测所述装置或提供除 了编制释放所述一种或多种激素或激素类似物的初始参数的程序之外的任何输入。在本发 明的另一个实施方案中，可以通过施用1250至1500IU的eCG以及随后施用750IU的hCG 72至80小时后诱导母猪的同步发情/定时排卵。在另一个实施方案中，可以通过施用400 至2000IU的PMSG以及随后施用500至1000IU的hCG72至83小时后诱导母猪发情。
[0027] 其它实施方案进一步涵盖通过研究所述母猪的卵泡检测母猪的排卵。在本发明的 一个特定实施方案中，使用超声研究所述母猪的卵泡。在又一个实施方案中，是在hCG注射 之后25-35小时开始通过每3-5小时经直肠超声来研究所述母猪的卵巢是否存在预排卵卵 泡的。在本发明的又一个实施方案中，选择超声2-3小时之后显示有多个预排卵卵泡的母 猪进行授精。
[0028] 本发明此外涵盖一种提高猪种群或养猪场中的遗传优良的公猪后代数目的方法， 它包括从种群或养殖场中的公猪群体建立一个或多个遗传优良的公猪的亚群；从所述一个 或多个遗传优良的公猪中获得精细胞样品；从每个所述精细胞样品中制备多个精细胞剂 量；对所述种群或所述养殖场中的多个母猪施用一种或多种激素或激素类似物以便确定每 只母猪的已知排卵时间；和使用深子宫内导管或腹腔镜手术用一个或多个精细胞剂量对所 述母猪授精，其中对每个母猪一起施用的一个或多个精细胞剂量包含总共小于IxlO 9个的 精细胞。这些步骤还可以用于减少猪种群或养猪场中育种所需的公猪数目。在某些实施方 案中，遗传优良的公猪包括相对于所述种群或所述养殖场内的其它公猪具有更高的选择指 数的公猪。
[0029] 本发明还涵盖一种提高猪种群或养殖场的利益率的新方法，它包括根据所述种群 或养殖场从属的市场条件计算雄猪和雌猪的单猪净收入；确定是雄猪还是雌猪产生更高的 单猪净收入；从公猪中采集精液样品；将所述精液样品分选到至少两个精细胞亚群中，其 中（i)如果雌猪产生更高的单猪净收入那么第一亚群中的至少80%具有X染色体，或（ii) 如果雄猪产生更高的单猪净收入那么第一亚群中的至少80%具有Y染色体；用来自所述第 一亚群的精细胞对母猪授精；和由所述母猪生产后代。
[0030] 本文中使用的术语"母猪"涵盖小母猪（还没有产仔的幼年雌猪）以及任何生殖 成熟的雌猪。
[0031] 本发明的任何实施方案都可以使用是遗传核心或繁殖种群成员的母猪。类似地， 本发明的任何实施方案都可以使用是遗传核心或繁殖种群成员的公猪。
[0032] 附图简述
[0033] 图1示意性地说明可以用于将精细胞样品分选到具有X或Y染色体的一个或多个 亚群中的流式细胞仪。
[0034] 发明详述
[0035] 本发明的实施方案针对通过使用性别选择的精液样品授精提高猪种群或品系中 的想要的遗传变化或进展的速率的方法。使用性别选择的精细胞产生具有全部是雄性或全 部是雌性的高概率的后代，这取决于使用的单独的亚群。如下面所示，这种能力为猪育种业 提供显著的优势，因为该产业非常重视每年的遗传进展。使用性别选择的精细胞的额外的 好处是降低与维持两种性别的基础设施和物资有关的经营成本一例如，对雄猪和雌猪分开 饲养的需求消失或大大降低，对雄性和雌性维持两种不同饲料提供链的需求也是这样（雄 性通常饲喂蛋白更高的饲料）。只销售公猪或小母猪的养殖场基本上可以使用性别选择的 精细胞授精使其生产力加倍。此外，他们可以使其成年种群库存降低50%并且因此降低需 要的流动资本投资。如果所述性状在一个性别中相比其它性别中表达或表达更强，实现在 猪中使用性别选择的精细胞还允许育种者提高或降低给定猪同窝仔畜（litter)或种群中 的性状。例如，为了降低肉的"公猪气味（boartaint)"在商业农场中往往将雄性阉割一因 此，只产生雌性的能力会消除对阉割的需求并且完全消除"公猪气味"的问题。
[0036] 然而，产生性别选择的精细胞样品的过程是既费时又费钱的，通常需要使用专业 化流式细胞术设备、训练有素的技术人员和复杂的过程。遗憾的是，使用诸如子宫颈内授精 等传统的人工授精技术成功授精需要的公猪精细胞的一般剂量是IxlO 9个精细胞至3x10 9 个精细胞，而一般的公猪精液包含大约6χ101(ι个精细胞。因此，一般的公猪精液包含大约20 至60个人工授精剂量，大大限制性别选择的精细胞样品在育种猪中的商业应用。此外，每 个发情周期对雌猪最少授精两次。因此，如果可以降低成功授精需要的精细胞的总量，给定 的公猪就可以在一定的时间内产生更高数目的人工授精剂量，使性别选择的精细胞样品的 使用在商业观点上更合乎需要。为了优化性别选择的精细胞样品在猪中的商业应用，本发 明还涵盖降低有效的人工授精剂量需要的样品中的精细胞总数的方法，它包括借助于深子 宫内导管和腹腔镜授精。成功授精需要的精细胞数量降低产生了减少育种需要的公猪数目 以及其相关成本的额外好处。
[0037] A.提高遗传变化速率
[0038] 通过使用本发明来选择某种品系中的后代的性别，可以提高种群或品系的想要的 遗传变化的速率。在这里，遗传变化或遗传进展表示对于给定的性状，连续世代中的个体会 使所述想要的性状比上代表达更强。就不想要的性状而论，遗传进展表示连续世代中的个 体会使所述性状比上代表达更弱。
[0039] 从一代到下一代的遗传进展（AG)可以根据选择的亲代的平均遗传水平与选择 的候选者（可用于选择的动物）的平均遗传水平之间的差异来衡量。在理想条件下，这取 决于所述性状的遗传率（h 2)和选择的亲代的平均表现（P)和选择的候选者的平均表现（A) 之间的差异。选择的亲代的平均表现（P)和所有选择的候选者的平均表现（A)之间的差异 (其中选择的亲代是子集）也称为选择差（SD)。
[0040] Δ G = h2 (P-A)
[0041] 选择差前面的符号表明选择的方向-正值表示较大表现型数值的选择，而负的选 择差表示较小表现型数值的选择。因此，如果目标是选择较大的表现型数值，就将所述品 系、品种和/或种群内的相对于其它个体具有大的正选择差的个体视为优良个体并且可以 在那个基础上被选为亲代。类似地，如果目标是选择较小表现型数值，就将所述品系、品种 和/或种群内的相对于其它个体具有大的负选择差的个体视为优良个体并且可以在那个 基础上被选为亲代。
[0042] 在消除非遗传影响时（例如通过比较每个表现记录与同群的平均值）以及在除了 所述动物本身的信息之外还使用来自亲属的信息时，选择是更有效的。这是通过计算估计 的育种值（EBV)实现的。在选择基于EBV时，预期的遗传进展等于选择的动物的平均EBV 和选择的候选者的平均EBV之间的差异。
[0043] AG = Pebv-Aebv
[0044] 那么遗传进展的年率就是：AG/t = (Pebv-Aebv)/t，其中t是代间隔。换句话说，遗 传进展的年率取决于代间隔以及亲代EBV相对于选择候选者的优越性。在本发明的某些实 施方案中，可以使用诸如最优线性无偏预测（BLUP)等统计模型来确定EBV，不过本领域已 知的任何统计模型都可以与本发明一起使用。
[0045] 通常，在对猪育种时，选择一种以上的性状。然而，在有多种性状要选择时，选择必 须根据其经济价值、它们对选择的响应如何（遗传率）和它们怎样影响彼此（遗传相关） 来权衡每个性状。实现这种平衡的一种方式是建立选择指数，这取决于以上数值和每个动 物的每个性状的EBV。对于选择指数的遗传进展的预测与个体EBV的相同，S卩，所述指数中 的改变的年率是代间隔和选择的亲代的指数和选择的候选者的指数之间的差异的函数。
[0046] 在大的群体中，选择差取决于检测多少动物以及选择多少动物-选择的比例越 低，选择差越高。因此，为了使遗传进展最大化，人们应该根据选择指数为所有测试动物分 级并且随后选择维持所述品系、品种和/或种群规模需要的顶端公猪和母猪的最小数量。 这保证选择的动物的平均指数基本上高于检测的所有动物的平均指数。
[0047] 如上所示，遗传进展取决于识别作为下一代的亲代的优良个体。有两种方法用于 衡量选择的个体的表现型优越性：选择差（如上讨论的）和选择强度。这两种尺度对于性 状来说密切相关，数值分布正如预期的的那样是正态分布。选择差等于选择强度和表型标 准偏差的乘积。因为选择强度与标准偏差的单位相同，所以比较不同性状的选择压力而不 考虑用于衡量表现的单位类型是可能的。
[0048] 此外，人们可以把选择作为亲代的候选者的比例转化成选择强度，因为在群体的 比例和正态分布中的平均值之间的标准偏差的数目之间有直接的关系。因此，选择的群体 的比例越小，选择强度越大并且遗传进展越大，其它一切相等。
[0049] 此外，为了实现更高的遗传进展速率，人们也想保持代间隔较小一代间隔是其子 代出生时种群中的亲代的平均年龄并且可以通过加快所述品系、品种和/或种群中的公猪 和母猪的替换来降低。为了使猪的代间隔保持较低，应该在公猪达到一岁大之前淘汰，母猪 在一次或两次产仔之后淘汰。最后，为了提高遗传进展，选择的一个或多个性状应该具有高 水平的遗传率。性状的遗传率是与环境相比，由于遗传差异，在群体内的个体之间的性状的 看得见的差异的比例。
[0050] 养猪业中的重要性状的实例是饲料转化率，即，衡量动物将饲料质量转化成身体 质量增加的效率的尺度（也称为饲料转化率或饲料增重比），和平均日增重，即，动物每天 的平均增重。性状是用不同单位衡量的（例如，猪的数量、每日的磅数、英寸等），性状在所 有全球市场中的经济重要性不相等，并且遗传影响的程度不相同（即，不同遗传率）。一般 来讲，诸如饲料转化率和平均日增重等产量性状具有高遗传率。相比之下，诸如生育力和每 窝产仔数等繁殖性状一般来讲具有低遗传率。
[0051] 在本发明的某些实施方案中，能够将公猪精细胞分离成具有X和具有Y的亚群的 效率是可以在品系、品种或种群中选择的性状。提高这种性状的表现允许以较高速率分选 具有X和具有Y的亚群和/或与所述品系、品种和/或种群中的个体平均值相比具有更高 的纯度水平，其它一切相等。可以测定公猪精液样品的某些性状来评价能够分选其精液的 效率，包括未处理精液中的死亡精子数量，以及精细胞摄取DNA选择性染料（如Hoechst 33342)的好坏，从而建立在用流式细胞仪分选时使用的染色方法的饱和。举例来说，精液样 品中的死亡精细胞的数量或百分比可以使用优先结合损坏或死细胞的有色或荧光染料来 评价。优良的染料饱和与在流式细胞仪上观察到的具有X和具有Y染色体的优良的分离和 /或由流式细胞仪为具有X和具有Y染色体的亚群产生的直方图的优良的"峰谷"比有关。
[0052] 猪产量可以由多水平金字塔表示，在下一个更低的水平中使用处于每个水平的某 些后代进行育种。金字塔的顶部水平就是核心种群。自上而下的下一个水平分别是子代核 心种群，繁殖种群，最后是商业养殖场。
[0053] 核心种群通常由12至15个品系组成，不过可以提供任何数目的品系，每个品系都 包括若干需要的性状。
[0054] 每个品系也可以根据育种者为那个品系选择的性状选定其自己的选择指数，针对 每个品系内的后代进行评价一具有更高选择指数评分的后代是更想要的。如上所述，特定 的猪的选择指数可以使用个体数据或群体数据来计算。选择指数的目的是为各种性状的每 一个选定适当的重点以提供在比较不同动物中使用的单个值。只有具有最高的测定的选择 指数的后代才可保留在核心种群中。每个品系内的母猪是公猪品系母猪，即，用于繁殖雄 性，或小母猪品系母猪，即，用于繁殖雌性。公猪品系母猪的雌性后代被舍弃。同样地，小母 猪品系母猪的雄性后代也被舍弃。
[0055] 因此，使用本发明的性别选择的精细胞授精，与使用传统的、未分选的精液相比， 公猪品系母猪的后代是雄性的可能性更高，而小母猪品系母猪的后代是雌性的可能性更 高，从而显著地提高相应的品系的选择强度，因为有正确性别的更大后代群体要测定并且 随后从其中选择亲代。例如，可以使用本文中公开的技术分离取自公猪品系公猪的精细胞 样品，从而建立其中至少80%的精细胞具有Y染色体的亚群（在小母猪品系上使用本发明 时，可以使用其中至少80 %的精细胞具有X染色体的亚群）。随后可以使用那个亚群或那 个亚群的一部分对公猪品系母猪授精。因为来自那个母猪的后代至少有80%的可能性是雄 性，所以所述公猪品系的选择强度将被提高，因为将会有更多可供选择的雄性。
[0056] 在子代核心水平或"品系繁殖"水平，用来源于所述核心种群的公猪精液对来自某 一品系的母猪授精。在繁殖场种群水平，得到的母猪通常与不同品系的公猪杂交。繁殖场 种群通常是小母猪繁殖场或公猪繁殖场。小母猪繁殖场产生亲代小母猪而公猪繁殖场产生 亲代公猪。亲代小母猪被送到商业化养殖场以替换年长或死亡的小母猪和母猪，而亲代公 猪被送到公猪场以产生在人工授精中使用的精细胞。
[0057] B.改变跨窝或种群性状的表现
[0058] 如上所述，在猪育种中使用性别选择的精液允许人们提高（或降低）给定同窝或 种群中的某些性状的表现，如果那些性状在一种性别中比另一种性别中表达或表达更强 烈。
[0059] 例如，小母猪具有比阉公猪更高的饲料转化率（在性成熟之前已经被阉割的雄 猪）。因为饲料费占猪生产成本的相当大的比例，同窝仔全部或基本上全部由雌性组成可 以为育种者或养殖场提高利益率，这取决于当地市场条件。此外，与阉公猪（年幼的阉割 雄性）相比，小母猪（年幼的雌性）通常具有更低的体重、更低的平均日增重、更低的平均 每日采食量并且瘦肉更多（更小的背脂厚度、更大的腰肌厚度、更高的无脂瘦肉指数）。因 此，虽然小母猪可能长得比阉公猪慢，但是它们将是更瘦并且更有效率的，因此在正确的市 场条件下对于养殖场来说可能是更有利可图的。
[0060] 因此，在市场条件下，在猪中使用性别选择的精液可以通过选择具有最想要的性 状的性别允许人们提1?养殖场的利益率。
[0061] 实施例1-性别选择的公猪精细胞样品的制备
[0062] 用于制备性别选择的公猪精细胞样品的以下过程只是通过非限制性实施例的方 式提供的。制备性别选择的公猪精细胞样品的第一步是从合适的公猪获得精液。一旦采集 到精液，就可以将它在可能包含抗氧化剂的合适的稀释剂中稀释。随后可以稀释所述精液 的富含精液组分。如果所述样品需要在性别选择之前运输，那么在从采集点运输到性别分 选处理的流式细胞仪的同时可以将所述样品保持在〇_39°C (通常16-17°C)的温度下约12 小时至约18小时。
[0063] 一旦所述精细胞样品在实验室中，就可以对所述精细胞样品进行各种质量检查， 包括检查运动力（motility)(例如，借助于CASA系统）、生存力（例如，借助于流式细胞 仪）、形态（例如，借助于显微镜）和浓度（例如，借助于NucleoCounter)。将通过这些质 量检查的精细胞样品准备用于分选。
[0064] 在使所述样品通过流式细胞仪之前，用DNA选择性染料将样品染色，暴露于淬灭 染料以形成染色的精细胞样品，随后将其放入流式细胞仪的精细胞源。具体地讲，在一些 实施方案中，所述精细胞样品首先可以用诸如BTS等缓冲液或稀释剂（参见表1)稀释至 最终浓度，在一些情况下可以是IOOxlO 6个细胞/ml，随后添加 DNA选择性染料Hoechst 33342(可以是在MiliQ水中5mg/ml ;Ref:B-2261)，良好的工作浓度可以是约5μ 1/1亿个 细胞/ml，但是DNA染料可以在在0. 5至20ul/l亿个细胞/ml范围内的更低和更高浓度使 用。随后通常将所述样品放入30和42°C (通常接近35°C )之间的覆盖的浴水中10分钟 到12小时，特别好的染色为约50分钟，随后在分选之前将其放在室温（21-22°C )的黑暗区 域。在分选样品之前，将样品过滤以除去大碎片和细胞（例如用〇. 30μπι的CellTricks) 并且在过滤之后可以添加红色食用染料（添加时，通常是在Mi IiQ水中的0. 5-5μ 1或1μ 1 的25mg/ml储备溶液），或可以向所述样品中添加另一种淬灭染料。随后可以流式细胞仪分 选所述样品，所述流式细胞仪使用在一些情况下可以包含表2中列出的成分的鞘液，但是 也可以使用其它鞘液。
[0065] 图1以示意图的形式说明用于分选精细胞样品以形成一个或多个亚群的流式细 胞仪的一部分，所述流式细胞仪通常引用为10。在这种特定的实施方案中，进行性别分选以 便所述亚群是具有X染色体的精细胞和具有Y染色体的精细胞。图1提供用于分选精液的 单一技术，但是本领域已知的分选细胞的任何已知技术都可以与本发明的某些实施方案一 起使用。
[0066] 图1的流式细胞仪10可以由操作者编程以产生两个带电液滴流，一个包含具有X 染色体的精细胞，带正电，12, 一个包含具有Y染色体的精细胞，带负电，13,而不带电的未 偏转死细胞流14直接进入废液。
[0067] 操作者还可以选择用这样的方式对所述流式细胞仪编程，即使用"高纯度分选"同 时收集具有X和Y染色体的精液（换句话说只收集活的具有X和Y染色体的精液），或对所 述流式细胞仪编程以使用"富集分选"同时收集具有X和Y染色体的精液（换句话说，这将 采集包含活的先前未分选的并且通过使用控制所述流式细胞仪的计算机可用的布尔逻辑 门再次排除所有最初死亡的液滴）。所述布尔逻辑门也可以用于只收集具有X或Y染色体 的精液中的任一种。
[0068] 开始，以精细胞流能够被在鞘液源16的压力下提供给喷嘴15的鞘液共轴环绕的 方式将在压力下的精细胞流从精细胞源11注到管口 15中。可以存在的振荡器17能够借 助于振荡器控制机构18被非常精确地控制，在喷嘴15内产生压力波并且在精细胞流离开 喷嘴口 19时将压力波传输到共轴环绕的精细胞流。结果，流出的共轴环绕的精细胞流20 能够最终并且有规则地形成液滴21。
[0069] 相应的液滴流带电是通过细胞传感系统22实现的，细胞传感系统22包括照射喷 嘴排出流20的激光23,并且通过传感器24检测荧光流的光发射。传感器24接收的信息被 传送到分选机识别系统25,分选机识别系统25非常迅速地决定是否为形成的液滴充电并 且如果充电为形成的滴剂提供什么电，于是随后为液滴21充电。
[0070] 具有X染色体的精液的特性是它们比具有Y染色体的精液吸收更多的荧光染料， 因为它们存在更多的DNA，因此，具有X染色体的精液中的激光激发的吸收的染料发射的光 的量与具有Y染色体的精液的不同，而这种差异向分选机识别系统25传达适用于理论上只 包含一个具有X或Y染色体的精细胞的单个液滴的电荷类型。死细胞（或将要死亡的细 胞）通常吸收向分选机识别系统25传达不对包含这些细胞的液滴施加电荷的淬灭染料。
[0071] 所述带电或不带电的液滴流随后在一对静电带电板26之间通过，静电带电板26 使它们偏离一种路线或另一种路线或根本不偏离，这取决于其电荷，进入相应的收集容器 28和29,分别形成具有X染色体的性别富集的群体和具有与其DNA有关的DNA选择性染料 的性别富集的具有Y染色体的精液细胞。包含死细胞（或将要死亡的细胞）的不带电非偏 离亚群流进入废液容器30。
[0072] 性别选择的精细胞样品是在具有2. 5ml捕获液体（catch fluid)的50ml管子中 收集的，对于每2千万细胞来说，所述捕获液体在某些实施方案中可以是具有2%蛋黄的 TesTris葡萄糖（TTG)(参见表3)。在这个实施方案中，所述性别选择的精细胞样品通常具 有大约24ml的最终体积，每ml约IxlO 6个细胞。随后将这个管子在室温下在暗室中储存 约2小时。
[0073] 表I-BTS稀释剂
[0074]
【权利要求】
1. 一种提高猪的品系或品种的遗传进展的方法，其包括以下步骤： 从来自所述品系或品种的公猪采集精液样品； 将所述精液样品分选到至少两个精细胞亚群中，其中第一亚群的至少80%具有X染色 体或Y染色体； 用来自所述第一亚群的精细胞对来自所述品系或品种的母猪授精； 由所述母猪生产后代； 对一个或多个所述后代计算选择指数；和 选择一个或多个具有与所述品系或品种的平均选择指数相比更高的选择指数的所述 后代与来自所述品系或品种的猪育种以便提高所述品系或品种的遗传进展。
2. 如权利要求1所述的方法，其中所述品系或品种是小母猪品系并且所述第一亚群具 有X染色体。
3. 如权利要求1所述的方法，其中所述品系或品种是公猪品系并且所述第一亚群具有 Y染色体。
4. 如权利要求1所述的方法，其中一个或多个所述后代的选择指数是根据来源于包括 所述后代的群组的数据计算的。
5. 如权利要求1所述的方法，其中一个或多个所述后代的所述选择指数包括测量生育 力、每窝产仔数和产奶量的性状。
6. 如权利要求1所述的方法，其中一个或多个所述后代的所述选择指数包括测量饲料 转化率、平均日增重和胴体瘦肉的性状。
7. 如权利要求1所述的方法，其中用来自所述第一亚群的精细胞对来自所述品系或品 种的母猪授精的步骤包括使用深子宫内导管或插入所述母猪的膜的针头对所述母猪的生 殖道施用所述精细胞。
8. 如权利要求7所述的方法，其中使用深子宫内导管对所述母猪的生殖道施用所述精 细胞包括将所述精细胞放在一个或多个子宫角中。
9. 如权利要求8所述的方法，其中所述深子宫内导管包括摄像机或显示器。
10. 如权利要求8所述的方法，其进一步包括在插入所述母猪的生殖道时通过放射显 影或荧光透视观察所述深子宫内导管的步骤。
11. 如权利要求8所述的方法，其中施用的所述精细胞的总数是1x10 9或更少个精细 胞。
12. 如权利要求7所述的方法，其中使用通过所述母猪的膜插入的针头对所述母猪的 生殖道施用所述精细胞包括将所述精细胞注射到所述母猪的子宫的一个或多个输卵管中。
13. 如权利要求12所述的方法，其进一步包括通过腹腔镜或摄像机观察插入所述一个 或多个输卵管中的所述针头的步骤。
14. 如权利要求12所述的方法，其中施用的所述精细胞的总数是1x10或更少个精细 胞。
15. 如权利要求1-14中任一项所述的方法，其进一步包括通过对所述母猪施用一种或 多种激素或激素类似物使发情期同步或诱导定时排卵的步骤。
16. 如权利要求15所述的方法，其中所述一种或多种激素或激素类似物包括PG600、 OvuGel、eCG、孕激素或 hCG。
17. 如权利要求15所述的方法，其中所述一种或多种激素或激素类似物是通过放入所 述母猪的生殖道的可编程装置施用的。
18. 如权利要求15所述的方法，其进一步包括通过研究所述雌性的卵泡来检测所述母 猪中的排卵的步骤。
19. 如权利要求18所述的方法，其中所述卵泡是使用超声波研究的。
20. 如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述母猪是遗传核心或繁殖场种群的 成员。
21. 如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述公猪是遗传核心或繁殖场种群的 成员。
22. -种提高猪的品系或品种的遗传进展的方法，其包括以下步骤： 从来自所述品系或品种的公猪采集精液样品； 将所述精液样品分选到至少两个精细胞亚群中，其中第一亚群的至少80%具有X染色 体或Y染色体； 用来自所述第一亚群的精细胞对来自所述品系或品种的母猪授精； 由所述母猪生产后代； 在一个或多个所述后代中获得性状的数值；和 选择一个或多个所述后代与来自所述品系或品种的猪育种以便提高所述品系或品种 的遗传进展，所述后代具有的所述性状的数值比所述品系或品种中的所述性状的平均值更 大或更小。
23. 如权利要求22所述的方法，其中所述品系或品种是小母猪品系并且所述第一亚群 具有X染色体。
24. 如权利要求22所述的方法，其中所述品系或品种是公猪品系并且所述第一亚群具 有Y染色体。
25. -种提高猪种群或养猪场中的遗传优良的公猪的后代数目的方法，其包括： 建立来自种群或养殖场中的公猪群体的一个或多个遗传优良的公猪的亚群； 从所述一个或多个遗传优良的公猪中获得精细胞样品； 从每个所述精细胞样品中制备多个精细胞剂量； 对所述种群或所述养殖场中的多个母猪施用一种或多种激素或激素类似物以便诱导 每个母猪的定时排卵；和 使用深子宫内导管或腹腔镜手术用一个或多个精细胞剂量对所述母猪授精，其中对每 个母猪一起施用的一个或多个精细胞剂量包含总共小于IxlO9个精细胞， 从而提高种群或养殖场中的遗传优良的公猪的后代数目。
26. -种降低猪种群或养猪场中的育种所需的公猪数目的方法，其包括： 建立来自种群或养殖场中的公猪群体的一个或多个遗传优良的公猪的亚群； 从所述一个或多个遗传优良的公猪中获得精细胞样品； 从每个所述精细胞样品中制备多个精细胞剂量； 对所述种群或所述养殖场中的多个母猪施用一种或多种激素或激素类似物以便诱导 每个母猪的定时排卵；和 使用深子宫内导管或腹腔镜手术用一个或多个精细胞剂量对所述母猪授精，其中对每 个母猪一起施用的一个或多个精细胞剂量包含总共小于IxlO9个精细胞， 从而降低所述种群或所述养殖场中的育种所需的公猪数目。
27. 如权利要求25或权利要求26所述的方法，其中遗传优良的公猪包括具有相对于所 述种群或所述养殖场中的其它公猪更高的选择指数的公猪。
28. -种提高猪种群或养殖场的利益率的方法，其包括： 根据所述种群或养殖场从属的市场条件确定是雄猪还是雌猪产生更高的单猪净收 入； 从公猪中米集精液样品； 将所述精液样品分选到至少两个精细胞亚群中，其中如果所述雌猪产生更高的单猪净 收入，那么第一亚群中的至少80%具有X染色体，或者如果所述雄猪产生更高的单猪净收 入，那么第一亚群中的至少80%具有Y染色体； 用来自所述第一亚群的精细胞对母猪授精；和 由所述母猪生产后代。
29. 如权利要求28所述的方法，其中所述雄猪是阉公猪。
30. 如权利要求28所述的方法，其中所述雌猪是小母猪。
31. 如权利要求28所述的方法，其中根据所述种群或养殖场从属的市场条件确定是 雄猪还是雌猪产生更高的单猪净收入的步骤包括比较雄猪和雌猪之间的性状，其中所述性 状选自以下任一种：饲料转化率、体重、平均日增重、胴体瘦肉、腰肌厚度、背膘厚度、腹膘厚 度、无脂瘦肉指数、每日瘦肉增重、单猪饲料费和脸颊脂肪碘值。
【文档编号】A61D19/02GK104519828SQ201380029461
【公开日】2015年4月15日 申请日期:2013年6月6日 优先权日:2012年6月6日
【发明者】J·莫雷诺, G·贝维, J·多布林斯基 申请人:英格朗公司