具有CpG基序的核酸在制备抗纤维化药物中的应用的制作方法

专利名称：：具有CpG基序的核酸在制备抗纤维化药物中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于药物应用领域，具体涉及具有CpG基序的核酸在制备抗纤维化药物中的应用。
背景技术：
：组织纤维化累及人体几乎所有器官和系统，是许多疾病致残、致死的主要原因，严重烕胁人类健康。据美国有关统计资料证明，该国因各种疾病而致死的病人中，接近45%可以归于各种组织纤维增生疾病。目前，组织纤维增生性疾病仍然没有针对性有效的治疗方案。纤维增生性疾病属于典型的多基因、多表型复杂疾病。由于年龄、性别、遗传因素及环境因素等影响，各种内外致病原引起的反复组织损伤可导致组织微环境改变。组织微环境改变引起组织修复失调，导致组织实质细胞丢失、间质细胞反复破坏、重建并过度沉积、正常肺组织结构改变并丧失功能。正是这种修复失调引起了纤维化疾病的发生。对多种纤维化疾病模型的研究发现，纤维化疾病是一类Th2免疫反应占优势的疾病。Th2细胞因子如IL-5(白介素-5)、IL-13能促进和加重器官纤维化；相反，Thl细胞因子如IFN-Y则具有抗纤维化的作用。TLRs在抗原呈递细胞如DCs调节获得性免疫反应过程中发挥中心作用，激活不同TLRs可诱导T细胞向Thl、Th2或调节型T细胞(Treg)等不同方向极化。如果产生促炎症Thl反应，则有利于组织损伤的修复和再生；反之，如果局部组织免疫微环境朝向Th2/Treg方向发展，则促进组织纤维化和组织重构的发生。最近的研究发现，TLRs介导的ToU/Th平衡失调，在各种组织纤维增生疾病如哮喘、急性呼吸窘迫综合症、特发性肺纤维化、动脉粥样硬化、牛皮癣、结肠炎、风湿性关节炎、肿瘤、结核、AIDS、和系统性硬化等许多感染性和非感染性疾病的发生和发展过程中均发挥了关键作用。因此，通过改变组织局部免疫微环境，特别是改变Thl/Th2/Trcg免疫极化方向是治疗纤维化的新途径。Toll样受体(Tolilikereceptors,TLRs)是新近发现的天然免疫受体。它是模式识别受体中一个大家族，是沟通先天免疫与获得性免疫反应的重要桥梁，作为各种致病微生物的模式识别受体启动宿主防卫反应。TLRs分布广泛，在多种来源的细胞如肥大细胞、树突状细胞、T细胞、B细胞、内皮细胞、成纤维细胞以及血管平滑肌细胞均有表达。TLR9是TLRs家族中的重要成员。它在机体炎症反应中发挥关键作用，并依赖MyD88进行信号传递，最终调节NF-kb等核因子活性的受体。在组成宿主与外环境之间第一道屏障的肺泡上皮细胞也表达TLR9及TLRl-6。具有CpG基序的核酸，可以被Toll样受体9(TLR9)所识别，并且最终激活宿主细胞的先天免疫系统，是TLR9的激动剂。CpG基序(CpGmotife)是以非甲基化CpG二核苷酸(胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸)为核心的寡聚脱氧核苷酸。CpG基序在细菌和病毒基因中很常见，其中CpG二核苷酸以正常的速率表达并且不被甲基化。然而，脊椎动物能够抑制其基因组DNA序列中CpG二核苷酸的表达，或使表达的CpG二核苷酸的胞嘧啶残基甲基化。人工合成具有CpG基序的寡聚脱氧核苷酸(CpGODN)，可以模拟细菌DNA，激活免疫细胞和其它细胞内的TLR9，引起强烈的免疫反应，因而是TLR9.的激动剂。CpGODN可以刺激单核细胞、CD4+T细胞分泌IFN-tx、IFN-y，也能诱导B细胞向浆细胞分化。CpGODN与TLR9作用，激活抗原提呈细胞如巨噬细胞，促使NF-kB发生核转位，上调TNF-tx等炎性因子的表达，同时诱导共刺激分子CD40、MHCII类分子表达。CpGODN也可以促进髓样DCs成熟，促进IL-12、IFN，等Thl细胞因子的生成，激活Thl免疫反应，推动Th2占主导的免疫反应向趋于TM/Th2平衡方向发展。许多研究表明，CpGODN是否具有免疫活性关键取决于其是否含有非甲基化或低甲基化的CpG基序。非甲基化的CpGODN可激活B淋巴细胞，使机体产生多种免疫效应；并可通过间接途径激活T淋巴细胞，诱生的IL-2和TNF-2可活化CD+细胞，促其分泌IFN-y等；同时可增强NK细胞的杀伤活性，研究表明细菌DNA或活性ODN可直接活化巨噬细胞产生IFN-y。合成的CpGODN诱导的细胞因子主要为Thl类，提示CpGODN可通过诱导Thl型应答或调节免疫应答向Thl型转换，显示出CpGODN作为未来人类疫苗佐剂的可行性。到目前为止，已有三种人工合成、含有CpG基序的寡聚脱氧核苷酸片段(CpGODN)，分别为A型、B型和C型，它们可以引起不同类型的免疫反应。目前应用于科研的商业化CpGODN序列见表1。在体外，三种不同类型的CpGODN序列对人类和小鼠免疫细胞的激活作用也不同。A型CpGODN，其特征为一到两个磷酸二酯键相连接的CpG基序以磷酸二酯键相连并形成回文序列，在序列的3'端有硫代磷酸酰化的poly-G尾(硫代磷酸酰化磷酸二酯键中与磷原子结合的一个氧原子被硫原子代替)。此修饰使CpGODN能够抵抗DNA酶的作用，在体内半衰期延长。因A型CpGODN若全部硫代修饰则影响其免疫刺激活性，故仅将其3'和5'末端的碱基进行硫代修饰。强烈诱导pDC分泌IFN-a并激活NK细胞，中等程度诱导DC成熟，诱导B细胞分化能力及活化TLR9依赖的NF-kB信号能力较弱。如ODN2261。B型CpGODN，其特征为全硫代磷酸酰化骨架构成的线性分子，一个或多个CpG基序。强烈诱导DC成熟和B细胞分化，诱导pDC分泌IFN-a能力较弱。如ODN1826。C型CpGODN，其特征为全硫代磷酸酰化骨架构成，含有多个CpG基序，3'末端回文序列，在体内形成二聚体。即拥有A型促TW型免疫反应能力，又具有B型诱导B细胞分化功能。如ODN2395。表1.目前应用于科研的商业化CpGODN序列<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>大写字母表示磷酸二酯键，小写字母表示其中的磷酸二酯键由硫代磷酸酯键代替，下划线代表其属回文序列。下划线的序列中，""前为5'—3'的序列，""后为其相对应的3'—5'的回文序列。用不同的CpGODN分别刺激转染小鼠TLR9和人TLR9的HEK293细胞系，通过检测NF-kB报告基因的表达发现，A型CpGODN2336中等强度激活人TLR9，而仅低度激活小鼠TLR9;B型CpGODN2006高度激活人TLR9，对小鼠TLR9产生中等强度激活反应；B型CpGODN16680DN1826高度激活小鼠TLR9，而仅低度激活人TLR9;C型CpGODN2395高度激活小鼠TLR9，同时较高程度激活人TLR9。目前CpGODN已被开发成治疗Th2免疫反应占优势的过敏性哮喘的疫苗，在动物模型上被证实作用持久、效力高、安全可靠，已进入三期临床。在一些免疫抑制性疾病如肿瘤，CpGODN作为肿瘤疫苗佐剂也已逬入二期临床。研究表明TLR9的配基不仅能够激活Thl免疫反应，以疫苗形式给予时，还具有对抗慢性炎症的作用。此外，已有报道CpGODN可用于治疗皮肤病、抗流感病毒、丙型肝炎病毒和狂犬病病毒感染。
发明内容因此，本发明要解决的技术问题就是针对现有的抗纤维化药物疗效针对性不强的缺陷，提供具有CpG基序的核酸的一种新应用。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是具有CpG基序的核酸在制备抗纤维化药物中的应用。本发明中，所述的具有CpG基序的核酸可以是现有的任何具有CpG基序的核酸，较佳的包括细菌DNA和人工合成的具有CpG基序的寡聚脱氧核苷酸(CpGODN)。CpGODN较佳的是经过化学修饰的寡聚脱氧核苷酸。化学修饰较佳的是硫代磷酸酰化修饰，即在人工合成DNA时，将DNA分子骨架的磷酸二酯键部分或全部改变为硫代磷酸酯键，磷酸基团中不参与成键的氧原子被硫原子所取代。将DNA分子骨架的磷酸二酯键改变为硫代磷酸酯键，其免疫活性极大增加。所述的CpGODN较佳的选自A型、B型、C型三种不同类型的CpGODN。本发明中，所述的具有CpG基序的核酸用于制备抗纤维化药物。其中，所述的纤维化较佳的包括肾纤维化，肺纤维化，心血管组织纤维化、肝纤维化和胰腺纤维化。这些脏器的纤维化既可以是原发性(特异性)的，即原因不明的纤维化；也可以是继发性的，即继发于原先疾病的纤维化。因此，该药物可预防或治疗具有纤维增生性特征的疾病。该疾病包括肾纤维化疾病包括终末期肾病，各种原因引起的急、慢性肾衰，特别是各种慢性肾脏疾病导致的慢性肾衰，包括原发性肾脏病如肾小球肾炎、慢性肾盂肾炎、小管间质性肾病、遗传学肾炎、多囊肾等，继发性肾病如糖尿病肾病、腹膜后纤维化、系统性红斑狼疮、高血压性肾病、高尿酸血症肾病等，以及尿路梗阻性肾病；肺纤维化疾病包括慢性阻塞性肺病(COPD)、特发性肺纤维化、间质性肺炎等；心血管组织纤维化疾病包括高血压、高血压心脏病、冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病)、扩张性心肌病、肥厚性心肌病、心律失常(特别是心房纤颤、室性心动过速)、慢性心衰等；肝纤维化疾病包括病毒性肝炎(如甲肝、乙肝、丙肝等)，酒精性肝炎，脂肪肝，以及上述肝病及其它原因导致的肝硬化等。本发明中的具有CpG基序的核酸可以单独或作为主要成分形成各种药物组合物或剂型后应用于个体。个体可以是人或动物。可经腹腔注射、皮下注射、静脉注射、肌肉注射、淋巴结内注射、粘膜用药等途径应用。本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。相比于现有技术，本发明的有益效果如下本发明为现有的具有CpG基序的核酸提供了一种新用途，用于制备抗纤维化药物。该药物可以预防和逆转组织纤维化，特别是肾纤维化，肺纤维化，心血管组织纤维化和肝纤维化。纤维化疾病一直没有有效的药物和治疗方法，长期困扰着诸如慢性肾脏病、高血压、冠心病、慢性阻塞性肺病、肝硬化等病人及其家属和医生。具有CpG基序的核酸作用疫苗或治疗性小分子物质用于预防和逆转组织纤维化，将切实有效的解除这些病人痛苦，为人类健康带来福音，具有广阔的治疗前景以及重要的临床意义和社会价值。以下结合本发明的特征和有益效果。图l，CpGODN抑制体外培养的巨噬细胞分泌M2细胞因子及IL-17。其中，图A和C为不同浓度CpGODN无显著性增加Ml型巨噬细胞分泌的IL-12;图B和D为不同浓度CpGODN显著减少M2型巨噬细胞分泌的IL-10;图E，不同浓度CpGODN明显增加Ml/M2巨噬细胞(IL-12/IL-10)的比值；图F，CpGODN显著降低巨噬细胞分泌的IL-17。图2，CpGODN预防UUO诱导的肾纤维化。其中，图A，CpGODN降低UUO诱导的肾纤维化(HE染色-100倍、Masson染色-200倍、免疫组织化学染色-200倍)；图B，CpGODN明显降低动物肾组织胶原面积比例；图C，CpGODN明显减少肾组织羟脯氨酸的含量；图D，CpGODN明显降低ct-SMA(a-平滑肌肌动蛋白)的表达。其中a-SMA为a-平滑肌肌动蛋白；IOD为积分光密度值。图3，CpGODN降低纤维化前胶原的mRNA表达并调节MMPs/TIMPs(金属基质蛋白酶/金属基质蛋白酶组织抑制剂)平衡。其中，图A，CpGODN调节相关基因mRNA表达的典型图；图B，CpGODN显著降低前胶原I的表达；图C，CpGODN明显抑制a-SMA的表达；图D,CpGODN明显抑制MMP2的表达；图E，CpGODN显著抑制TIMPl的表达；图F，CpGODN上调MMP2/TMPl的比值，但无统计学显著性。图4，CpGODN对MCP-l(单核细胞趋化蛋白-l)、趋化因子RANTE的mRNA表达和免疫效应细胞分布的调节作用。其中，图A，CpGODN明显减少肾间质巨噬细胞的浸润；图B，CpGODN显著降低MCP-1的表达；图C，CpGODN显著降低RANTE的表达。其中，IOD为积分光密度值；AU为相对单位。图5,CpGODN对TLRs(Toll样受体)及细胞因子mRNA表达的影响。其中，图A，CpGODN无显著性降低脾脏中TGF-p(转化生长因子-P)表达；图B，CpGODN明显增加脾脏中IL-12表达；图C，CpGODN显著增加脾脏中IL-12/TGF-f3的比值；图D，CpGODN显著降低肾脏中TGF-p表达；图E，CpGODN明显增加肾脏中IFN-Y(干扰素-Y)表达；图F,CpGODN明显增加肾脏中IFN-Y/TGF-p的比值；图G，CpGODN对肾脏中TLR2表达无明显作用；图H,CpGODN对肾脏中TLR4表达无明显作用；图I,CpGODN显著增加肾脏中TLR9表达；图6，CpGODN对Thl、Th2细胞因子表达的调节作用。其中，图A，CpGODN对Thl、Th2、Treg(调节性T细胞)及Thl7细胞因子表达水平的调节作用；图B，CpGODN对Thl细胞因子IL-12的表达无明显作用；图C，CpGODN对Thl细胞因子IFN-Y的表达无明显作用；图D，CpGODN显著降低Th2细胞因子PAI-l(纤溶酶原激活物抑制因子l)的表达；图E，CpGODN明显降低Th2细胞因子IL-13的表达；图F，CpGODN显著降低Treg细胞因子TGF-(31的表达；图G，CpGODN明显降低Thl7细胞因子IL-17的表达。其中，IOD为积分光密度值。图7,CpGODN减轻因UUO诱导14天形成的肾纤维化。其中，图A,CpGODN具有抗肾纤维化的作用(Masson染色，IO倍)；图B，CpGODN具有抗肾纤维化的作用(Masson染色，40倍)；图C，CpGODN具有抗肾纤维化的作用(免疫荧光染色，ot-SMA表达)；图D，CpGODN具有抗肾纤维化的作用(免疫荧光染色，E-钙粘素表达)；图E，CpGODN显著降低肾间质绝对胶原面积及胶原面积比例；图F，CpGODN明显降低ct-SMA的表达、增加E-钙粘素的表达。图8，CpGODN逆转UUO诱导21天所形成的肾纤维化。其中，图A，CpGODN具有抗肾纤维化的作用(Masson染色，IO倍)；图B，CpGODN具有抗肾纤维化的作用(Masson染色，20倍)；图C,CpGODN显著降低肾间质绝对胶原面积及胶原面积比例；图D，CpGODN明显降低(x-SMA的表达、增加E-钙粘素的表达。图9，CpGODN给药后对纤维化肾功能的改善。其中，图A、B，CpGODN明显降低UUO术后14天的血清肌肝和尿素氮水平；图C、D，CpGODN明显降低UUO术后21天的血清肌肝和尿素氮水平。图10，CpGODN给药后能逆转因肾纤维化引起的免疫耐受性。其中，图A，CpGODN显著降低UUO术后4天脾脏中M2巨噬细胞F4/80+CD206+细胞比例；图B，CpGODN对UUO术后14天肾脏中M2巨噬细胞F4/80+CD206+细胞比例无明显作用；图C，CpGODN明显降低UUO术后21天脾脏中M2巨噬细胞F4/80+CD206+细胞比例；图D，CpGODN无显著性降低UUO术后21天肾脏中M2巨噬细胞F4/80+CD206+细胞比例；图e，CpGODN对肾组织细胞因子TGF-pi、IFN-y、IL-13表达的调节作用；图F，CpGODN显著降低TGF-(31的表达；图G，CpGODN无显著性增加IFN-Y的表达；图H，CpGODN显著降低IL-13的表达。其中IOD为积分光密度值。图ll，CpGODN对信号转导介质Smad3，Stat3(转录激活因子3)，MAPKs(丝裂原活化蛋白激酶)信号表达和活性的调节作用。其中，图A，CpGODN显著抑制Smad3的活性；图B，CpGODN明显抑制Stat3的表达；图C，CpGODN显著降低ERK(细胞外信号调控蛋白激酶)的活性；图D,CpGODN具有活化p38的作用；图E，CpGODN明显上调p-p38/p-ERK(磷酸化p38/磷酸化ERK)的比值。图12，CpGODN对压力过负荷引起的高血压大鼠血流动力学的影响。其中，图a，CpGODN对大鼠心率无明显影响；图b，CpGODN未明显降低大鼠血压；图c，CpGODN明显降低LVEDP(左室舒张末压)；图d，CpGODN明显降低dp/dtmax(左室收缩压最大上升速率)；图e，CpGODN未明显改变dp/dtmin(左室舒张压最大下降速率)绝对值。图13，CpGODN减轻压力过负荷引起的心血管肥厚。其中，图a，CpGODN抑制心脏肥大；图b，CpGODN明显降低ANP(心钠素)的表达；图c，CpGODN显著降低心肌细胞直径(Masson染色，200倍)；图d，CpGODN降低主动脉血管直径(Masson染色，400倍)；图e，CpGODN显著降低心肌细胞的直径；图f，CpGODN显著降低主动脉血管直径。图14,造模手术后28天，CpGODN减轻压力过负荷引起的心脏纤维化。其中，图a，CpGODN对心脏纤维化的抑制作用(Masson染色，200倍)；图b，CpGODN显著降低心脏纤维化；图c，CpG0DN显著增加MMP9/TIMP1(金属基质蛋白酶9/金属基质蛋白酶组织抑制剂l)表达的比值；图d，CpGODN显著降低胶原I的表达。图15，CpGODN促进Thl细胞反应，降低Smad2和Smad3表达，增强浸润到心脏免疫细胞上的TLR4表达。其中，图a,CpGODN对TGF-(31(转化生长因子-Pl)表达的影响(Masson染色，标尺为100微米)；图b，CpGODN对IFN-Y(干扰素-y)表达的影响(Masson染色，标尺为100微米)；图c，CpGODN显著降低TGF-(31的表达；图d,CpGODN明显增力口IFN-Y的表达；图e，CpGODN显著增力口IFN-Y/TGF-卩l比值；图f，CpGODN显著抑制Smad2的活性；图g，CpGODN明显降低Smad3的表达；图h，CpGODN增强浸润到心脏免疫细胞上的TLR4表达(激光共聚焦扫描显微镜分析)。图16，CpGODN对压力过负荷所致心脏肥大信号通道的表达和活性的调节作用。其中，图a，CpGODN无显著性降低蛋白激酶Akt的表达；图b，CpGODN显著降低p-AKT〔磷酸化AKT)的表达；图c，CpGODN显著增强GSK-3p(糖原合成酶激酶-3p)的活性。图17，CPGODN调节心脏组织TLR活性。其中，图a，CpGODN显著降低TAK1(激活性激酶l)的表达；图b，CpGODN显著降低IRF3(干扰素调节因子3)的表达；图c，CpGODN无显著性增加p-p38(磷酸化p38)的表达；图d，CpGODN明显降低ERK(细胞外信号调控蛋白激酶)的表达；图e，CpGODN显著降低p-ERK(磷酸化ERK)的表达；图f，CpGODN显著降低NF-KB(核转录因子-KB)的表达；图g，CpGODN明显降低i-KB(抑制蛋白kB)的表达；图h,CpGODN明显降低pi-KB(磷酸化i-KB)的表达。图18，CpGODN降低博莱霉素引起肺纤维化,的病理学检查(HE染色，IOO倍)。其中，图A:假手术组；图B:模型组；图C:干扰素组；图D:阴性对照组(GpC组)；图E:CpG组。图19，CpGODN降低博莱霉素引起肺纤维化的病理学检査(Masson染色，200倍)。其中，图A:假手术组；图B:模型组；图C:千扰素组；图D:GpC组；图E:CpG组。图20，CpGODN降低博莱霉素引起肺纤维化的病理影像学分析。其中，图A，CpGODN显著降低胶原绝对面积百分比；图B，CpGODN显著降低胶原相对面积百分比。图21，CpGODN对小鼠肺组织羟脯氨酸及胶原含量的影响。其中，图A，CpGODN显著降低小鼠肺组织羟脯氨酸的含量；图B，CpGODN显著降低小鼠肺组织胶原的含量。图22，CpGODN对小鼠肺组织MMPs(金属基质蛋白酶)、TIMPs(金属基质蛋白酶组织抑制剂)及ProColI(前胶原I)表达水平的影响。其中，图A，CpGODN明显增加MMP2的表达；图B，CpGODN明显增加MMP9的表达；图C，CpGODN明显降低TIMP1的表达；图D，CpGODN明显降低TIMP2的表达；图E，CpGODN显著降低前胶原I的表达。图23，CpGODN对小鼠肺脏MMPs/TIMPs表达平衡的影响。其中，图A，CpGODN对MMP2/TIMP1的表达无明显差异性影响；图B,CpGODN明显增加MMP2/TIMP2的表达；图C，CpGODN显著增加MMP9/TIMP1的表达；图D，CpGODN明显增加MMP9/TIMP2的表达。具体实施例方式下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。下面实施例中所述的"室温"是指进行试验的操作间的温度，一般为20-25"C。实施例1CpGODN在预防和逆转单侧输尿管结扎(UUO)诱导的肾纤维化方面的新用途材料和方法主要试剂及实验动物-实验所用的CpGODN(ODN1826:5'-tccatgacgttcctgacgtt-3'全程硫代)(本发明中，全程硫代是指DNA分子骨架中的全部的磷酸二酯键都改变为硫代磷酸酯键)及阴性对照GpCODN(ODN1826c:5'-tccatgagcttcctgagctt-3'全程硫代)，均由北京赛百盛生物工程公司合成并纯化。使用时溶解于PBS(磷酸盐缓冲生理盐水)。实验所用的SPF级SD大鼠(雄性，180200g)及C57BL/6小鼠(雄性，6~8周龄，16~18g)，均购自北京维通利华实验动物技术有限公司。单侧输尿管结扎(Unilateralureteralobstruction,UUO)诱导肾纤维化动物模型制备动物禁食过夜，戊巴比妥钠(45mg/kg，i.p.)(i.p.表示腹腔注射)麻醉。仰卧位固定，腹部局部剃毛，消毒手术部位，腹正中线切口，依次切开皮肤、肌肉暴露腹腔。在左后腹壁辨认左侧肾脏及输尿管，将左侧输尿管在上l/3部位用4-0丝线两点结扎，两点间距离约5mm，剪断输尿管，关闭腹腔，依次缝合肌肉皮肤，青霉素皮下注射抗感染。上述手术是除假手术组以外的其它组的动物进行的手术，假手术组手术步骤同上，但仅分离输尿管不做结扎。实验分组设计如下-实验l:SD大鼠按体重随机分为五组，每组10只。各组给药成分如下表2所示，表中溶剂PBS指磷酸盐缓冲生理盐水。于造模前3天经腹腔注射给药，造模后第4天、第8天给药，共3次。但是干扰素组为造模当天开始给药，每日一次。各组分别于术后14天处死动物，取材。表2.CpGODN对肾纤维化作用实验设计<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>实验2:C57BL/6小鼠按体重随机分为三组，各组给药成分如下表3所示，表中溶剂PBS指磷酸盐缓冲生理盐水。于造模手术后第4天开始经腹腔注射给药，每隔3天给药1次。各组分别于造模手术后第14及21天处死动物(每个时间点每组15只动物)，取材。表3.CpGODN对肾纤维化作用实验设计<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>肾纤维化病理评价及免疫组化l.UUO所致肾纤维化实验病理形态学分析取动物左侧肾皮质组织，4%(w/v)多聚甲醛固定后石蜡包埋。HE染色观察基本病理改变，Masson染色观察纤维化状况，并根据Masson特殊染色的结果，应用彩色病理图文分析系统SpotAdvanced3.0获得高清晰的免疫组化染色的病理图片(200倍)。使用Image-ProPlus软件测量出每个视野染色后的着色面积。每组分析4-6个标本，每个标本随机取20个视野，取均值代表一个动物肾组织胶原染色面积，并用非参数方差分析进行统计学分析。2.免疫组织化学免疫组织化学染色检测肾皮质a-SMA、CD68、IL-17、TGF-(31、PAI-1、IL-12、IFN-7和IL-13的表达，SP试剂盒(SP9001，SP9003)和显色剂3,3-二氨基联苯胺(DAB，ZLI-9032)由北京中杉金桥生物技术有限公司提供。采用SABC(链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物法)方法，主要步骤包括石蜡切片常规脱蜡、水化；胰酶抗原修复；3%(w/v)过氧化氢去除内源性过氧化物酶；0.5%(w/v)Triton透膜；正常血清封闭；加一抗4。C过夜；加入生物素化二抗，ABC复合物，DAB显色；透明、封片。阳性染色为胞菜或胞核棕色颗粒，阴性对照以PBS或正常山羊血清代替一抗。应用彩色病理图文分析系统SpotAdvanced3.0获得高清晰的免疫组化染色的病理图片(200倍)。使用Image-ProPlus5.1测量出每个视野染色后的着色强度。每组分析4-6个标本，每个标本随机取20个视野，取均值代表一个动物肾组织特定蛋白的染色强度，并用非参数方差分析进行统计学分析。3.免疫荧光免疫荧光检测肾皮质a-SMA、E-cadherin表达。主要步骤包括肾脏组织取出用OCT(Sakurafmetech,USA)包裹，迅速用液氮冷冻。切10pM冰冻切片，丙酮固定；0.5%(w/v)Triton透膜；正常血清封闭；加一抗(1:100)4。C过夜；a-SMA加AlexaFlora594标记抗小鼠二抗(购自Invitrogen，1:100)，E-cadherin(E-钙粘素)加异硫氰酸荧光素(FITC)标记抗大鼠二抗(1:100)37"C孵育1小时，DAPI封片。以红(或绿)和蓝双色荧光通道扫描观察。激光共聚焦扫描显微镜(E2000U)检须!la-SMA、E-cadherin的荧光表达强度。细胞因子表达的PCR检测弓I物的设计使用专业的引物设计软件"Primerprimer5.0"进行，通过Blast进行同源比较确保其特异性；取存放于RNA保存液中的组织，Trizol法提取总RNA，定量后以5pg量完成mRNA的逆转录。WesternBlot:取适量组织，加入裂解缓冲液(O.lmMEDTA，O.lmMEGTA，10mMKCI，10mMHEPEs，50mMNaF，0.1MNa3VO4，0.1MNa3PO4，1limol/L的抑肽酶(Aprotinin)，1)imol/L胰蛋白酶抑制剂(Trypsininhibitor),lpmol/LPMSF(苯甲基磺酰氟)，1lamol/L亮抑肽酶(Leupeptins)和lpmol/LDTT(二硫苏糖醇))匀浆后，冰上放置15min，间或振荡；迅速加入10%(w/v)NP-40混匀，4°C、12000rpm，离心5min。取上清，考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，调节蛋白浓度至相同用于WestemBlot分析。WesternBlot实验中使用Amersham显色液(华美公司NBT/BCIP染色试剂盒IK5030)显色，经Westem-blot分析软件(gelPro32)测出各条带的光密度值分析。流式细胞术测定小鼠脾脏、肾脏M2细胞小鼠放血处死，迅速取脾脏，冰PBS洗，滤纸吸干，研磨并过150目筛网，收集过筛组织碎片，离心(4。C，800g，6分钟)。弹散沉淀，力n500pl红细胞裂解液(购自eBioscience公司)37'C破红7分钟；过150目筛网，收集过筛细胞，PBS洗两次后，加入3%(w/v)BSA封闭30min;加入F4/80-FITC和CD206-TRITC抗体孵育，流式细胞仪检测，获得？4/80+CD206+M2细胞。肾脏组织剪碎后于含胶原酶的溶液中消化l小时，终止消化后，离心(4'C，800g，6分钟)。弹散沉淀，力B50(^1红细胞裂解液37'C破红7分钟；后同脾脏处理步骤。肾组织羟脯氨酸含量、丙二醛(MDA)及超氧化物歧化酶SOD检测肾纤维化动物实验中，通过检测肾组织羟脯氨酸含量评价组织胶原沉积量；通过检测MDA和SOD的活性，评价肾组织清除氧自由基的能力。新鲜肾组织匀桨，离心取上清，考马斯亮蓝法蛋白定量。采用MDA和SOD试剂盒(购自江苏南京建成生物有限公司)，按其测定方法分别测定肾组织羟脯氨酸含量、丙二醛(MDA)及超氧化物歧化酶SOD的含血清肌肝、尿素氮测定小鼠去眼球取血，静置，3500rpm离心10分钟，取血清，用于血清肌肝、尿素氮测定。分别采用血清肌肝、尿素氮试剂盒(购自中生北控生物技术股份有限公司)，按其测定方法分别测定。流式细胞术测定体外培养巨噬细胞细胞因子表达RAW264.7细胞(购自ATCC)接种于六孔板，每孔接种5X105个细胞，分别加CpGODN0.75,1.5,3吗/ml和GpCODN3路/ml室温孵育24小吋进行刺激，收细胞。冷PBS洗细胞三次，用3%(w/v)BSA室温封闭半小时，分别用IL-17、IL-10、IL-12抗体(Ce11signalingTech公司)窒温孵育半小时，冷PBS洗，后加荧光标记二抗孵育。对照实验选用同型对照(抗体类型均为IgG型)的单克隆抗体。标记的细胞经FACSCalibur流式细胞仪检测，使用CellQuest软件(BectonDickinson)分析。统计分析实验结果用均值i标准误(X士SE)表示，使用SPSS专业统计软件，经参数或者非参数方差检验，pO.05认为有统计学差异。实验结果CpGODN抑制体外培养的巨噬细胞分泌M2细胞因子及IL-17-现有技术显示，肾脏实质细胞不表达TLR9，肾脏的TLR9是由免疫细胞表达的。因此可以推断CpGODN作为TLR9的激动剂，其对于肾脏的免疫调节作用主要是通过免疫细胞实现的。而巨噬细胞是肾纤维化发生发展中作用最为重要的一种免疫细胞，且巨噬细胞也有相应于Thl和Th2极化特点的二种表型，即Ml和M2型。Ml型巨噬细胞以分泌IL-12等细胞因子为特征；M2型巨噬细胞主要分泌IL-10等细胞因子。本发明发现，不同浓度CpGODN(0.75,1.5,3jig/ml)刺激细胞24小时后，分泌IL-12的Ml型巨噬细胞比例有所增加，但与对照组相比无显著差异(图1A，C)，而分泌IL-10的M2型巨噬细胞显著减少(图1B，D)，即M2型巨噬细胞活化较少，Ml/M2巨噬细胞比值增力n(图1E)。GpC对上述细胞因子无明显作用。此外我们还检测了巨噬细胞所分泌的IL-17。我们发现CpGODN降低巨噬细胞分泌IL-17(图1F)。CpGODN预防UUO诱导的肾纤维化动物行UUO后14天，肾皮质明显变薄，多数肾小管扩张、萎縮，间质浸润的细胞数增多(图2A:HE);肾组织有大面积胶原沉积，沉积的胶原集中于肾小囊、肾小管周围的间质区域(图2A:Masson)。与未治疗的UUO动物比较，CpGODN治疗显著降低肾组织间质胶原沉积，IFN-Y治疗的动物其肾间质胶原沉积量也明显少于未治疗的动物。结果表明，CpGODN和IFNY治疗的动物肾组织胶原面积比例明显小于未治疗的模型组动物(图2B)。组织中羟脯氨酸含量是衡量组织胶原沉积量，即肾纤维化的另一指标。动物行UUO后14天肾组织匀浆中羟脯氨酸含量较假手术组升高l倍；与病理结果一致，CpGODN及IFN-y均明显减少肾组织羟脯氨酸含量(图2C)。肌成纤维细胞是成纤维细胞的一个亚群，特异性的表达a-SMA;此外纤维化时上皮细胞可转化为间充质细胞表型即EMT，也会特异性的表达a-SMA。二者是细胞外胶原的主要来源，在很大程度上可反映组织纤维化的程度。本发明免疫组织化学结果显示，uuo显著诱导了a-SMA的表达，a-SMA阳性染色集中于肾小管上皮细胞周边及肾间质细胞，肾小球几乎没有(x-SMA的表达。CpGODN及IFN-Y组大鼠肾组织oc-SMA表达呈现较低的表达水平，阳性染色面积明显少于模型组(图2A，D)。对纤维化标志蛋白-前胶原I(proColI)及cx-SMA的mRNA表达情况检测结果显示在正常肾脏，前胶原I的水平较低，纤维化时则大幅升高，行UUO14天时前胶原I在肾组织的表达较假手术组上升了2.5倍(p0.001)。CpGODN和IFN-Y则显著降低前胶原I的表达(图3A，B)。UUO也诱导了a-SMA的mRNA表达(p0.05)，同样CpGODN和IFN-y对其表达有明显的抑制作用(图3A，C)。同时检测了组织中降解细胞外基质的主要酶类-基质金属蛋白酶(MMPs)，和它的抑制物(TIMPs)的表达。在假手术组大鼠肾组织，MMP2(明胶酶A)及TIMP1均表现出较低的表达水平。UUO大幅度地诱导了MMP2及TIMPl的mRNA表达，与假手术组比较，两者在UUO后14天分别增加了4.5倍(图3A，D)和5.5倍(图3A，E)，CpGODN对二者的表达均有显著的抑制作用，而IFN-7仅对TIMP-1有明显的抑制作用。从比值上看，CpGODN增加了MMP2/TIMP1的比值(p0.05)，但作用不及IFN-7显著(图3F)。CpGODN降低炎症反应，调节肾纤维时抑制性免疫微环境基于炎症在肾纤维化中的重要作用，我们捡测了肾组织局部化学趋化因子的表达及浸润到肾组织的巨噬细胞数。结果显示单核细胞趋化因子(MCP-l)mRNA表达在UUO后显著增加，CpGODN和IFN-Y治疗组肾组织MCP-l的表达明显低于模型组(图4B)。另一种化学趋因子-调节活化正常T细胞表达分泌因子(RANTE)基础表达及UUO诱导后无明显差异，但给予CpGODN和IFN-Y干预后仍明显减少了RANTE的表达。相应于化学趋化因子表达的降低，肾组织局部浸润的免疫细胞量也有所改变。我们发现行UUO后14天，肾组织局部CD68+巨噬细胞明显多于假手术组，CpGODN和IFNi的干预在不同程度上减少了间质巨噬细胞的浸润(图4A)。在检测脾脏及肾组织细胞因子的表达时，我们发现无论是在脾脏还是肾脏，UUO明显诱导了TGF-卩mRNA(图5A，D)的表达，对IFN-y(图5B，E)和IL-12(图5C)的表达没有显著的影响；CpGODN禾口IFN-Y均具有下调抑制性细胞因子TGF-卩和上调TW细胞因子IL-12或IFN-ymRNA表达的作用。对TLRsmRNA表达情况的结果表明，UUO不同程度地诱导了TLR2、TLR4和TLR9的表达；与模型组比较，CpGODN主要上调了肾组织局部TLR9的表达而对TLR2及TLR4作用不明显(图5G-I)。为进一步研究肾组织局部免疫微环境的变化，我们对细胞因子进行了蛋白表达水平的分析。主要检测了TM、Th2、Treg及Thl7细胞因子的表达。结果表明，UUO对Thl、Th2、Treg及Thl7免疫反应均有诱导作用，在肾组织局部形成一种比较复杂的炎症状态。CpGODN和IFN-Y对Thl细胞因子IL-12(图6A，B)、IFN-y(图6A,C)的表达没有明显作用，与模型组比较无差异；但比较明显地抑制了Th2型抑制性细胞因子PAI-l(图6A，D)、IL-13(图6A，F)和Treg细胞因子TGF-(3的表达(图6A，F)。这些结果进一步确证，CpGODN和IFN-Y都具有抑制Th2，Treg免疫反应，使Thl/Th2/Treg平衡向Thl方向极化的作用。IL-17是一种在慢性炎症疾病中发挥重要作用的细胞因子，而肾纤维化正是一种慢性炎症性疾病。IL-17的分泌受到TGF-(3的正性调节。在整体模型上，我们发现UUO诱导了肾组织局部IL-17的表达，而CpGODN禾niFN-Y则有效地抑制了IL-17的表达(图6A，G)。这可能与CpGODN及IFN-Y能够很好地抑制TGF-p的表达有关。在体内，IL-17主要由Thl7细胞分泌，这提示我们，肾纤维化可能也有Thl7的参与，而CpGODN对于T细胞向TM7细胞的分化具有调节作用。CpGODN逆转已形成的肾纤维化已有的研究显示，减少抑制性Th2型细胞因子分泌，增强Thl免疫反应具有抗纤维化作用。CpGODN能够通过活化TLR9，调整免疫反应向Thl方向极化，因此我们有理由相信，CpGODN可能具有逆转肾纤维化的作用。我们在前面的实验中己确定，行UU03天即可以诱导明确的肾纤维化改变。因此我们选择UUO第4天开始药物治疗，观察CpGODN是否具有抗纤维化作用。结果显示，CpGODN具有明显的抗肾纤维化作用，经CpGODN治疗后动物肾组织沉积的胶原面积仅为模型组的一半(pO.01)(图7A，B，E)。从免疫荧光切片可以看到，与模型组ct-SMA的强荧光着色相比，CpGODN治疗组的荧光染色明显较弱(图7C)。E-钙粘素是上皮细胞的特征性蛋白，当上皮细胞发生EMT时，这种蛋白的表达会降低，因此它也是肾小管上皮细胞发生EMT的标志性蛋白。UU014天后，与假手术组比较，模型组动物肾组织E-钙粘素荧光强度极弱，肾组织结构不完整。CpGODN治疗组有较亮的荧光染色，肾组织结构较模型组完整，一些肾小管尚保存有完整的基底膜结构(图7D)。为进一步确证此结果，我们用Westernblot法检测了二种蛋白的表达。得到的结果与组织病理学结果一致，经UUO诱导后二种蛋白在肾组织的表达呈现明显相反的变化趋势，UUO后(x-SMA显著增加，而E-钙粘素表达有明显的减少；药物治疗则逆转了上述改变，在降低a-SMA表达的同时，维持了E-钙粘素的基础表达(图7F)。在UUO21天，CpGODN也显示出较好疗效(图8)，对于上述指标均有较明显的改善作用。为了观察药物在改善纤维化的同时是否对肾功能有改善作用，我们检测了小鼠血清肌肝及尿素氮含量。UUO后小鼠血清肌肝及尿素氮水平均上升，14天时尿素氮水平与假手术组相比已有显著差异；UU021天，模型组小鼠血清肌肝和尿素氮水平均显著高于假手术组，提示肾脏的清除功能发生障碍。CpGODN在UUO14天及21天都能明显减少血清肌肝和尿素氮水平，使之趋于正常(图9)。这说明CpGODN在改善纤维化的同时，也改善了肾功能。这也验证了前人的结论，肾功能与纤维化程度成反比，逆转纤维化则有助于改善肾功能。CpGODN逆转肾纤维化是由于逆转组织免疫抑制微环境为了观察CpGODN对组织免疫反应的调节作用，我们检测了在肾纤维化中发挥重要作用的免疫细胞-巨噬细胞的活化状态。我们发现UUO14天及21天时，M2巨噬细胞即F4/80+CD206+细胞比例在脾脏中明显增多(图10A，C);CpGODN治疗后，M2细胞比例有大幅度减少(p0.05)。在肾脏，UU014天时，模型组M2型巨噬细胞比例尚无明显变化，UU021天时，则有显著增多(图10B，D)，CpGODN在21天时有减少M2型巨噬细胞的趋势，但没有统计学显著性差异。在检测肾组织细胞因子表达时发现，UUO诱导了抑制型细胞因子TGF-(3和IL-13的表达；CpGODN显著地减少了这两种细胞因子的表达，CpGODN对IFN-Y有上调作用，但效果不明显，因此也提高了IFN-y/TGF-P，ifn-y/IL-13比信，提示Thl/Th2/Treg平衡向Thl方向发展(图10E-H)。目前普遍认为，TGF-(3/Smads信号在纤维化过程中发挥重要作用。其中Smad3在促进胶原生成相关基因转录方面的作用受到肯定和关注，因此我们观察CpGODN对TGF/Smads信号的影响。结果，UUO诱导了Smad3的表达，CpGODN在降低TGF-p表达的同时，也抑制Smad3的活性(图llA)。Stat3是免疫调节机制中的抑制性转录分子，而且对于调节Thl/Th2免疫反应具有重要作用。蛋白测定结果显示，UUOM天时Stat3的表达显著上升(p0.001)，CpGODN对Stat3的表达具有抑制作用(图11B)。此外我们还发现CpGODN对于MAPK信号具有不同的调节作用，它显著降低ERK的活性(图11C)，但同时具有活化p^的作用(图llD)，上调p-p，p-ERK比銜图llE)。总结本实验发现TLR9配基-CpGODN可以作为一种免疫调节剂，通过调节组织局部免疫微环境，逆转UUO所诱导的肾纤维化。我们发现以疫苗形式给予TLR9激动剂，可通过抑制炎症，调节肾组织免疫微环境，预防UUO所致的肾纤维化；而对于已经形成的纤维化改变，CpGODN通过促进Thl免疫反应、抑制Th2、Treg免疫反应，调整二者的平衡状态，发挥抗纤维化作用。CpGODN激活的TLR9信号途径与经典的调节肾脏组织修复的信号途径间存在复杂联系。CpGODN能抑制ERK、pERK和转录因子Stat3的表达，却能上调pp38的表达。这些信号一方面与纤维化相关，另一方面参与TLR9调节Thl/Th2/Treg/Thl7免疫平衡。慢性肾脏病是继心脑血管病、肿瘤、糖尿病之后又一威胁人类健康的疾病。对病人而言，无疑是一场灾难，它意味着将终生接受透析或是进行肾移植。多数慢性肾脏病患者在发展为终末性肾功能衰竭前是可以得到正确诊断的，但遗憾的是目前还没有确实有效的治疗手段完全阻止慢性肾病的进程，所以我们的研究发现CpGODN作用疫苗或治疗性小分子物质用于预防和逆转肾纤维具有重要的临床意义和社会价值。实施例2CpGODN在预防和逆转心血管组织纤维化方面的新用途材料和方法主要试剂和实验动物实验所用的CpGODN(ODN1585:5'ggGGTCAACGTTGAgggggg3')及阴性对照GpCODN(ODN1585con:5'ggGGTCAAGCTTGAgggggg3'),均由北京赛百盛生物工程公司合成并纯化。其中，大写字母表示其中的磷酸二酯键没有经过修饰，小写字母表示其中的磷酸二酯键由硫代磷酸酯键代替。使用时溶解于磷酸盐缓冲生理盐水。实验所用的SPF级Wister大鼠(雄性，240280g)，均购自北京维通利华实验动物技术有限公司。心血管纤维化动物模型制备动物经腹腔戊巴比妥钠麻醉(4050mg/kg,i.p.)后，进行肾上腹主动脉缩窄术或假手术。大鼠仰位于鼠板固定，剪去手术处皮毛，消毒后腹正中切口，切开皮肤及肌层，切口约1.52cm;暴露内脏后，用手指伸入腹腔，腹腔主动脉的搏动，以判断其位置，然后用浸有生理盐水的消毒纱布将大鼠胃及肠系膜等推向右侧暴露肾脏及脊柱前腹主动脉，在肾动脉分支上方分离腹主动脉lcm长，用7号注射针头紧贴腹主动脉平行放置，并将二者一起结扎，然后抽出注射器针头，即可缩窄腹主动脉。术后每天用青霉素5万U/只腹腔注射一周，以免感染。上述手术是除假手术组以外的其它组的动物进行的手术，假手术组手术步骤同上，但仅分离腹主动脉不做结扎。实验分组设计如下Wister大鼠按体重随机分为五组，每组15只。各组给药成分如下表4所示，表中溶剂PBS指磷酸盐缓冲生理盐水。于造模前3天经腹腔注射给药，造模后第4天、第8天给药，共3次。但是干扰素组为造模当天开始给药，每日一次。于造模手术后28天处死动物，取材。表4.CpGODN对心血管纤维化作用实验设计组别给药剂量及给药方案溶剂假手术组(n=15)等量溶剂i.p.造模前3天及造模手术后第4、8天给予PBS模型组(n=15)等量溶剂i.p.PBSCpG组(n=15)CpGODN40昭/kgi.p.PBS阴性对照组(n=15)GpCODN40}ig/kgi.p.PBS干扰素组(n=15)IFN-YIO万IU/kgi.p.造模手术后当天开始给药，每日一次PBS血流动力学检测:术后28天，腹腔注射戊巴比妥钠(50mg/kg)麻醉动物，将其固定于手术台上。颈部正中切口，分离出右侧颈总动脉，PE50导管插管入左心室。MPA2000测定血流动力学改变，计算反映左室收缩功能的血流动力学指标左室最大收缩压(LVSP)、左室压力上升最大速度(+dp/dt,max)，及反映左室舒张功能的指标左室最大舒张压(LVDP)、左室舒张末内压(LVEDP)、左室压力下降最大速度(-dp/dt,min)。组织化学分析心脏和主动脉经4%(w/v)多聚甲醛固定后，石蜡包埋切片，HE或Masson's染色分析肥厚或纤维化程度。为检测心肌细胞肥大，选取至少200个有核且边界清楚的心肌细胞测量最短直径。Masson's染色确定心脏胶原沉积程度。应用高清晰彩色病理图文分析系统SpotAdvanced3.0获得高清晰Masson特殊染色的病理图片(心肌200倍放大；血管400倍放大)。使用Image-ProPlus5.1软件，测量出每个视野Masson染色后胶原着色面积、视野下心肌组织面积。以着色面积与视野心肌组织面积比表示该胶原相对含量。每组分析6-8个标本，每个标本随机取10个视野，取均值代表一个动物胶原组织在心肌组织内相对含量和表达强度。通过非参数方差分析，比较各组"胶原相对面积"。通过Image-ProPlus5.1，用类似方法测量动物主动脉的厚度。免疫组织化学检测心脏TGF-pi、IFN-y表达免疫组织化学染色检测心肌TGF-p、IFN-y(购自SantaCmz)表达变化。采用SABC方法，主要步骤包括常规脱蜡、水化；3%(W/V)过氧化氢去除内源性过氧化物酶；正常血清封闭；加一抗4'C过夜；加入生物素化二抗，ABC复合物孵育2h，DAB显色；苏木素复染、透明、封片。阳性染色为胞浆棕色颗粒。激光共聚焦扫描显微镜分析心肌组织石蜡切片常规脱蜡，水化，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗。0.4%(Wv)胃蛋白酶盐酸溶液37。C抗原修复30min，PBS冲洗5minX3次。10%(w/v)正常山羊血清封闭，室温孵育30min。分别滴加混合好的兔抗大鼠TLR4、小鼠抗大鼠OX62L和羊抗大鼠actin三种一抗(终浓度各10)ig/ml)，4"C过夜。PBS冲洗，5minX3次。滴加混合好的异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗兔二抗(终浓度100昭/ml)、Cy-5标记的抗羊二抗(终浓度20吗/ml)和TIRITC(罗丹明)标记的抗小鼠二抗(终浓度20pg/ml),室温反应2h，PBS冲洗5minX3次，90%(w/v)甘油封片。以红、黄和绿三双色荧光通道扫描观察。激光共聚焦扫描显微镜检测TLR4的荧光定量表达每张切片选取荧光表达最强的10个视野观察并计算单位面积下的荧光强度。断层扫描TLR4与DC或心肌共表达细胞(10-20层)，利用LeicaTCSSP2软件制作TLR4与DC/心肌细胞共表达的三维旋转图，以确定TLR4是表达于浸润到心肌的DC还是心肌细胞本身。PCR检测细胞因子表达通过Primerprimer5.0进行引物设计，经Blast进行同源比较确保其特异性。取适量存放于RNA保存液的心脏和血管组织各约100mg，Trizol法(使用购自Invi加gen的试剂盒)提取总RNA，溶于20-40pl去Emsol水，定量后完成mRNA逆转录。将获得的cDNA通过实时荧光定量PCR或普通PCR方法(EB染色)，分别检测心脏组织肥大相关因子-ANP以及纤维化相关因子(TIMP1、MMP9以及ProColI等)的表达。WesternBIot分析取心肌组织100mg，用眼科剪在L5mlEppendorf管中将组织剪碎后匀浆，加入裂解缓冲液(含有1%(w/v)NP-40、0.5(w/v)%脱氧胆酸钠、0.1(w/v)%SDS以及lnmol/L的抑肽酶、胰蛋白酶抑制剂、PMSF、亮抑肽酶和DTT)，振荡混匀，冰上放置SOmin，间或振荡；4°C、12000rpm，离心15min。取上清，Branford法测定蛋白浓度，调节蛋白浓度至相同，分装，一部分用于SDS电泳,一部分放置-8(TC保存；用增强的化学发光系统(化学发光试剂盒和胶片均购自AmershamBiosciences)曝光。Western-blot印迹分析软件(Gel-pro3.2)分析计算各条带的光密度值，从而分析多种蛋白质表达。统计方法实验结果用平均值(Mean)±SE表示，使用方差分析ANOVA，各组比较后有差异，选择适宜的检验方法进行多组样本均值的两两比较。统计学分析的结果，p<0.05认为有差异，pO.01认为有显著性差异。实验结果CpGODN改善心脏舒张功能造模手术后28天，检测大鼠血流动力学，结果显示在不影响心率的情况下，与假手术组相比，模型组动脉收缩压显著升高；药物治疗后，IFN-Y、CpG组均未明显降低血压(p>0.05，图12a-b)。LVEDP指标反映心脏舒张功能，模型组显著增加LVEDP;与模型组相比，IFN-Y和CPGODN治疗后明显降低LVEDP(pO.Ol，图12c)。dp/dtmax指标反映心脏收縮能力，模型组显著升高心脏收缩能力；与模型组相比，CpGODN治疗后明显降低心脏收缩能力(图12d)。另外，与假手术组相比，模型组明显升高dp/dtmhi绝对值；药物治疗无显著改变(图12e)。GpC治疗后对上述各指标均未有明显改变。CpGODN减轻压力过负荷所致心血管肥厚和心脏纤维化造模手术后28天，模型组心脏及左心室明显增大，心室壁增厚；心肌细胞直径与假手术组相比显著增大；药物干预后，与模型组相比，CpGODN和IFN-7明显抑制心脏肥大，并降低心肌细胞直径(图13a，c，d)。ANP是心肌肥厚的标志物之一，通过实时-PCR检测心脏组织ANPmRNA表达，结果显示造模手术后28天，模型组ANPmRNA表达较假手术组增加了将近3倍，而给予CpGODN或IFN-y治疗明显降低其表达(p<0.05，图13b)。腹主动脉缩窄术除导致心脏肥大外，也导致大血管肥厚，如主动脉(图13e，f)。术后28天，模型组血管直径较假手术组增加了46.5%;CpGODN或IFN-y治疗降低了血管直径约20%。上述结果表明，CpGODN或IFN-Y减轻心脏和血管肥厚。Masson染色结果显示，模型组心脏出现显著纤维化；CpGODN或IFN-治疗后显著降低心脏纤维化(图14a，b)。检测MMP9、TIMP1以及胶原ImRNA表达结果显示，模型组MMP9/TIMP1表达比率显著降低，胶原ImRNA表达明显升高；CpGODN治疗后显著逆转上述mRNA表达(图14c，d)。上述结果均表明CpGODN能够抑制压力过负荷所致心脏纤维化。CpGODN改变心脏组织Thl/Th2平衡以及相关信号分子表达-通过免疫组化方法检测心脏组织Thl型细胞因子-IFN-Y和Th2型细胞因子-TGF-pi表达。造模手术后28天，模型组明显增加TGF-(3表达，IFN-y表达不明显；CpGODN治疗后显著降低TGF-(31表达，增加IFN-Y表达(图15a-d)，从而增加IFN-Y/TGF-p表达比率(图15e)。模型组显著增强细胞内Smad2活性，上调Smad3表达；CpGODN治疗后明显抑制Smad2活性，降低Smad3表达(图15f-g)。结果显示，TGF-卩/Smad信号途径参与调节压力过负荷所致心脏纤维化。CpGODN增强浸润到心脏免疫细胞上TLR4表达因TLRs既可表达于心肌细胞又可表达于免疫细胞，所以确定哪一种细胞表达的TLR参与调节心血管肥厚和心脏纤维化具有重要意义。为明确TLR4在心脏的确切定位，我们采取激光扫描共聚焦技术分析术后28天左心室切片。结果发现，TLR4是与浸润到心脏的免疫细胞而不是心肌细胞发生共定位(图15h);而且，造模手术后28天，CpGODN治疗明显增强TLR4表达。CpGODN阻断心脏AKT激活，增强GSK-3Ji活性取术后28天心脏组织胞浆蛋白，进行Westernblot分析。结果显示，模型组腹主动脉缩窄明显增加p-Akt表达，抑制GSK-3P活性；与模型组相比，CpGODN治疗后降低p-Akt表达，增强GSK-邓活性(图16)。上述结果表明，CpGODN减轻心脏肥大与下调Akt表达、上调GSK-邓表达有关。CPGODN调节TLR信号途径收集手术后28天心脏组织，提取蛋白进行Westernblot分析TLRs信号途径几个关键分子表达，结果显示，模型组显著升高TAK1和IRF3表达；与模型组相比，CpGODN治疗后明显降低其表达(图17a-b)。NF-KB是TLR信号途径激活的主要核转录因子，结果显示，模型组显著升高NF-kB、pi-KB和i-KB表达，而CpGODN治疗后其表达显著降低(图17f-h)。ERK/p38比值反映Th2/Thl免疫平衡，结果显示，CpGODN显著降低ERK、p-ERK表达，增加p-p38表达，与模型组相比差异显著(图17c-e)。总结本实验发现CpGODN可以作为一种新型免疫调节剂，通过调节心脏免疫微环境，抑制压力过负荷所致心血管病理性重构，改善心功能。CpGODN能显著增加心脏组织IFN-Y表达，抑制TGF-卩表达。也就是说，CpGODN通过激活TLR9促进心脏组织Thl/Th2免疫平衡向Thl免疫反应方向漂移。CpGODN能显著增加心脏组织p38表达并增强其活性，降低ERK表达并抑制其活性，结果表明p38/ERK信号途径参与调节心脏组织Thl/Th2平衡向Thl免疫反应移动。同时TGF-P/Smad和TGF-(3/TAKl信号途径共同参与调节CpGODN逆转心血管重构的过程。CpGODN显著抑制Akt活性，增强GSK-3卩活性，并降低NF-kB、i-KB表达。由此说明，CpGODN逆转心脏重构不但与PI3K7Akt/GSK-邓途径有关，而且与NF-KB表达也密切相关。现在高血压及高心病的患病率越来越高，所以我们的研究发现具有重要的临床意义和社会意义，CpGODN作为一种免疫调节剂极有可能成为治疗高血压及高心病的有效药物。实施例3CpGODN在预防和逆转肺纤维化方面的新用途材料和方法主要试剂和实验动物实验中所用的CpGODN(ODN2395:5'tcgtcgt加cggcgc:gcgccg3'全程硫代，下划线代表其属回文序列)及阴性对照GpCODN(ODN2395con:5'tgctgc加ggggggcccccc3'全程硫代)，均由北京赛百盛生物工程公司合成并纯化；博莱霉素，购自日本化药株式会社。使用时溶解于磷酸盐缓冲生理盐水。实验中所用的SPF级C57BL/6小鼠(雄性，6~8周龄，16~18g)，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。肺纤维化动物模型制备雄性C57BL/6小鼠，隔夜禁食，戊巴比妥钠(45mg/kg，i.p.)麻醉，气管内注射博莱霉素(5U/kg)。具体方案如下以尽量小的创伤切开颈部皮肤，在弯头眼科镊的协助下，暴露气管，使用微量进样器穿刺气管，向气管内注入约50pl适量博莱霉素，迅速地旋转并直立5分钟，以便使博莱霉素均匀地进入左右肺叶。整个操作在约6(TC左右的手术操作台进行。上述手术是除假手术组以外的其它组的动物进行的手术，假手术组气管内注射等量的注射用生理盐水，其他手术步骤同上。实验分组设计如下雄性C57BL/6小鼠按体重随机分为五组。各组给药成分如下表5所示，表中溶剂PBS指磷酸盐缓冲生理盐水。于造模手术后32天处死动物，取材。表5.CpGODN对博莱霉素所致肺纤维化作用实验设计<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>肺功能测定:1.博莱霉素所致肺纤维化实验病理形态学分析取动物右侧下叶肺组织，4%(w/v)多聚甲醛固定后石蜡包埋。在包埋肺组织的蜡块最大横截面切片，HE染色观察基本病理改变，Masson染色观察纤维化状况，并根据Masson特殊染色的结果由第三方单位(中国疾病预防控制中心辐射安全所北京康宝科技服务部)进行病理分级观察，标准如下0级，无纤维化；l级，轻度(+),纤维化面积低于20%，肺胸膜以及间质胸膜下肺组织存在一定程度肺泡结构破坏；2级，中度(++)，纤维化面积在20%~50%之间，纤维化区域从胸膜向内局域性延伸；3级，重度(+++),纤维化面积超过50%。2.Masson特殊染色病理影像学分析应用高清晰素彩色病理图文分析系统SpotAdvanced3.0获得高清晰的Masson特殊染色的病理图片(200倍)。使用Image-ProPlus5.1测量出每个视野Masson染色后的胶原的着色面积、视野下肺组织面积。以着色面积、着色面积与视野肺组织面积比表示该胶原的相对含量。博莱霉素所致肺纤维化实验中每组分析10个标本，每个标本随机取6个视野，取均值代表一个动物胶原组织在肺组织内的相对含量和表达强度。通过非参数方差分析比较各组"视野下胶原绝对面积"以及"胶原相对面积"。3.羟脯氨酸测定羟脯氨酸在胶原蛋白中占13.4%,在弹性蛋白中占极少量，其他蛋白中均不存在，因此通过羟脯氨酸检测胶原蛋白的含量。检测动物左肺全叶羟脯氨酸的含量，评价肺纤维化的情况。具体方法如下取动物左侧全部肺叶，记录湿重，生理盐水超声匀浆制备成10%的组织匀浆，取约150^1的匀浆上清液，加500W碱水解液，涡旋混匀后，120度0.1Kpa条件下碱水解法处理40mhi(方法参照南京建成生物工程技术有限公司试剂盒说明书，略有改动)，调pH值后定容，活性炭处理后取上清。按照说明书(氯胺T法)进行羟脯氨酸测定。细胞因子表达的PCR检测取适量存放于RNA保存液中的组织约100mg，Trizol法(Invitrogen)提取总RNA,溶于2040pl去DEPC水，定量后完成mRNA的逆转录。将获得的cDNA通过聚合酶链式反应后，1.5(w/v)。/。琼脂糖电泳(EB染色)检测纤维化相关因子的表达。统计分析-实验结果用均值i标准误(^tSE)表示，经参数或者非参数方差检验，经比较p0.05认为有统计学差异，pO.Ol认为有明显的统计学差异。病理学分级资料的统计使用卡方检验，经比较pO.05认为有统计学差异，pO.Ol认为有明显的统计学差异。实验结果CpGODN抑制博莱霉素所致肺纤维化病理学检査肺脏病理学检查发现，假手术组肺组织未见异常改变；模型组中2例为重度纤维化，4例为中度，5例为轻度，l例未见明显纤维增生。在模型组除肺纤维组织增生外，肺泡腔有不等的巨噬细胞，间质有灶性炎性细胞浸润，与假手术组相比有显著差异(pO.01)。CpG组、干扰素组均能明显减轻肺纤维化，与模型组相比有非常显著性差异(PO.Ol)。而GpC组对减轻肺纤维化无明显差异。图18为HE染色病理学检查结果，图19为Masson染色病理学检查结果，结果显示CpGODN、干扰素都能够不同程度的降低博莱霉素所致小鼠肺纤维化。病理影像学分析肺组织经Massoii特殊染色后，胶原呈现特殊颜色。通过测定Masson特殊染色后视野下胶原绝对面积以及胶原相对面积反应药物治疗的效果。胶原绝对面积百分比是指视野下呈现特殊染色的胶原组织占总视野的百分比。分析结果表明，与假手术组相比，模型组能显著增加胶原绝对面积百分比(pO.Ol，图20A)。与模型组相比，CpGODN、干扰素均能显著降低胶原绝对面积百分比(pO.Ol，图20A);GpC无明显差异(p〉0.05，图20A)。胶原相对面积百分比是指胶原绝对面积百分比与实质组织面积百分比的比值，可准确地反映肺实质组织纤维化水平。分析结果表明，与假手术组相比，模型组能显著增加胶原相对面积百分比(pO.Ol，图20B)。与模型组相比，CpGODN、干扰素均能显著降低胶原相对面积百分比(pO.Ol，图20B);GpC无明显差异(pX).O5，图2013)。羟脯氨酸测定博莱霉素所致肺纤维化模型组引起肺组织羟脯氨酸含量的增加(图21)。CpGODN能显著降低肺组织羟脯氨酸和胶原的含量。与假手术组相比，模型组(博莱霉素)可显著增加小鼠肺组织羟脯氨酸和胶原的含量(p<0.01，图21)。药物干预后，与模型组相比，CpGODN、干扰素均能非常明显地降低博莱霉素所致肺纤维化小鼠肺组织羟脯氨酸和胶原的含量(图21)。肺组织MMPs、TIMPs以及ProColImRNA表达PCR检测MMP是细胞外基质降解过程中必不可少的酶，几乎能降解细胞外基质的所有成分。其中，在肺纤维化发生和发展过程中，明胶酶A(MMP2)和明胶酶B(MMP9)发挥着重要作用。TIMP是近年来发现的MMP的天然抑制物，是一组能抑制MMP活性的多功能因子家族，是体内细胞分泌的一类蛋白酶抑制剂，通过对MMPs的抑制，在正常细胞外基质改建和各种病理过程中发挥重要作用。TIMP1是一种糖蛋白，可与活化的MMP9形成1:1的复合物而抑制其活性，降低细胞外基质的降解。TIMP2是一种非糖蛋白，与MMP2有很强的亲和力，主要抑制MMP2活性，对MMPs家族其他成员的活性也有抑制作用，能阻断所有被激活的MMPs的水解酶活性。PCR检测博莱霉素所致肺纤维化小鼠肺脏组织mRNA发现，MMP2(图22A)、MMP9(图22B)表达水平降低，TIMP1(图22C)、TIMP2(图22D)表达增强，ProC01I表达水平亦增强(图22E)。药物干预后，CpGODN、干扰素均可增强小鼠肺脏MMP2(图22A)、MMP9(图22B)的表达水平，降低小鼠肺脏TIMP1(图22C)、TIMP2(图22D)、ProC01I(图22E)的表达水平。MMPs/TIMPs的失衡也是促使肺纤维化发生发展的一个重要因素，TIMPs在平衡中占优势，胶原降解能力下降。模型组(博莱霉素)所致肺纤维化小鼠与假手术组相比，肺组织MMP9/TIMPl(p<0.05，图23C)、MMP9/TIMP2(p<0.05，图23D)显著降低，MMP2/TIMP2无差异性降低(图23B)，MMP2/TIMP1表达没有明显差异。药物干预后，CpGODN、干扰素均可增强MMP9/TIMP1、MMP9/TIMP2以及MMP2/TIMP2之间的平衡(图23)，在纤维化期维持较强的胶原降解能力。总结本实验中，通过病理学检查和病理影像学分析结果发现，CpGODN能显著抑制博莱霉素引起的肺纤维化；降低肺纤维化小鼠肺组织羟脯氨酸、胶原的含量；并降低与肺纤维化相关的TIMPs、ProCo11表达，增强与肺纤维化相关的MMPs表达，改变MMPs/TIMPs的平衡。实验结果证明，CpGODN在肺纤维化疾病方面具有一定的治疗前景。权利要求1、具有CpG基序的核酸在制备抗纤维化药物中的应用。2、如权利要求l所述的应用，其特征在于，所述的具有CpG基序的核酸包括细菌DNA和人工合成的具有CpG基序的寡聚脱氧核苷酸。3、如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的人工合成的具有CpG基序的寡聚脱氧核苷酸是经过硫代磷酸酰化修饰的寡聚脱氧核苷酸。4、如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的人工合成的具有CpG基序的寡聚脱氧核苷酸选自A型、B型和C型。5、如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的纤维化包括肾纤维化，肺纤维化，心血管组织纤维化、肝纤维化和胰腺纤维化。6、如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的肾纤维化包括急性或慢性肾衰。7、如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的肺纤维化包括慢性阻塞性肺病、特发性肺纤维化和间质性肺炎。8、如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的心血管组织纤维化包括高血压、高血压性心脏病、冠状动脉粥样硬化性心脏病、扩张性心肌病、肥厚性心肌病和慢性心衰。9、如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的肝纤维化包括病毒性肝炎、脂肪肝、酒精性肝炎和肝硬化。全文摘要本发明公开了具有CpG基序的核酸在制备抗纤维化药物中的应用。本发明为现有的具有CpG基序的核酸提供了一种新用途，用于制备抗纤维化药物。该药物可以预防和逆转组织纤维化，特别是肾纤维化，肺纤维化，心血管组织纤维化和肝纤维化。纤维化疾病一直没有有效的药物和治疗方法，长期困扰着诸如慢性肾脏病、高血压、冠心病、慢性阻塞性肺病、肝硬化等病人及其家属和医生。具有CpG基序的核酸作用疫苗或治疗性小分子物质用于预防和逆转组织纤维化，将切实有效的解除这些病人痛苦，为人类健康带来福音，具有广阔的治疗前景以及重要的临床意义和社会价值。文档编号A61P9/00GK101524362SQ20091004567公开日2009年9月9日申请日期2009年1月21日优先权日2009年1月21日发明者吕晓希,杨红振,王晓星,胡卓伟,辛冰牧申请人:胡卓伟