本发明属于生物技术应用领域，具体地，涉及一种mda-mb-231乳腺癌细胞的复苏方法。
背景技术：
乳腺癌是女性最常见的癌症，主要包括导管癌和小叶癌。2016年美国ca（acancerjournalforclinicians）公布的最新统计数据显示，美国2016年预计将有420840例女性患乳腺癌，占女性新发恶性肿瘤的38%，居女性恶性肿瘤发病率第一位，并且死亡人数将达52930例。更为严重的是全球的乳腺癌发病率正在逐年增长。
细胞培养是生物与健康相关研究领域的一项重要技术。随着生命科学的迅速发展，目前细胞培养已成为细胞生物学、分子生物学、遗传学和免疫学等学科研究的重要基础。为了深入探讨细胞的生长活动规律、有关疾病的病理和药物的药理（毒理）机制，开发具有不同针对性的细胞培养方法具有重要意义。
其中，mda-mb-231乳腺癌细胞作为人源性高转移乳腺癌细胞，常用于乳腺癌的体内外研究。细胞复苏是培养细胞的一种，是生命及再生医学领域中广泛应用的关键技术，在研究中往往需要对冻存的细胞进行复苏，从而进行乳腺癌转移的相关研究。
本发明所述的mda-mb-231乳腺癌细胞的复苏方法稳定性高，能够去除冻存剂对复苏后细胞生长的影响，复苏后的mda-mb-231乳腺癌细胞存活率高，细胞生长速度快，细胞状态好，边界清晰，可以有利于乳腺癌转移的相关研究。
技术实现要素：
发明目的：本发明提供了一种mda-mb-231乳腺癌细胞的复苏方法。
技术方案：本发明提供了一种mda-mb-231乳腺癌细胞的复苏方法，包括以下步骤：将冻存的mda-mb-231乳腺癌细胞冻存管从液氮或者-80℃冰箱中取出，在取出后1min内于37℃摇晃至含有mda-mb-231乳腺癌细胞专用冻存液的mda-mb-231乳腺癌细胞液完全融化，将mda-mb-231乳腺癌细胞液加入到盛有2-3ml新鲜mda-mb-231乳腺癌细胞专用培养基的离心管中，用移液枪上下吹打20-30次，于1000-1500g/min的转速下离心3-10min；移去上清液，加入1-2ml的新鲜mda-mb-231乳腺癌细胞专用培养基，用移液枪上下吹打40-50次，然后均匀的加入到盛有7-9ml的新鲜mda-mb-231乳腺癌细胞专用培养基的细胞培养皿中，于37℃，5%co2培养箱中培养；所述mda-mb-231乳腺癌细胞专用冻存液以重量组分计，包括以下组分：二甲基亚砜5-15份、羟甲基淀粉2-5份、海藻糖3-12份、维生素e0.5-3份、25%山梨醇1-5份、丙二醇0.8-1.6份、(s)-(-)-1-(4-氟异喹啉-5-基)磺酰基-2-甲基-1,4-二氮环庚烷0.5-2份和基础培养基80-90份。本发明所述的mda-mb-231乳腺癌细胞的复苏方法稳定性高，能够去除冻存剂对复苏后细胞生长的影响，复苏后的mda-mb-231乳腺癌细胞存活率高，细胞生长速度快，细胞状态好，边界清晰，可以有利于乳腺癌转移的相关研究。同时，mda-mb-231乳腺癌细胞专用冻存液对细胞损伤上，25%山梨醇为渗透性保护液，而(s)-(-)-1-(4-氟异喹啉-5-基)磺酰基-2-甲基-1,4-二氮环庚烷则抑制细胞活动和基因表达，维生素e的抗氧化性好，在保证休眠细胞的营养的同时还可以显著减少对细胞的损伤，提高冻存细胞的存活率，并且在增殖方面也保持很好的状态。
进一步的，上述的mda-mb-231乳腺癌细胞的复苏方法，所述mda-mb-231乳腺癌细胞专用培养基包括70-90%的基础培养基以及10-30%的胎牛血清。mda-mb-231乳腺癌细胞专用培养基，组分合理，可以进一步为复苏的细胞的提供营养物质。
进一步的，上述的mda-mb-231乳腺癌细胞的复苏方法，所述基础培养基以重量组分计，包括以下组分：葡萄糖82-88份、碳酸氢钠12-25份、丙酮酸钠10-16份、脂肪酸白蛋白6-12份、氯化钾35-45份、无水硫酸镁6-10份、氯化钠70-78份、无水磷酸二氢钠10-14份、叶酸0.3-0.5份、肌醇0.8-1.2份、烟酰胺0.3-0.6份、无水氯化钙25-35份、硝酸铁0.2-0.4份、丁二酸6-8份、丁二酸钠12-16份、d-泛酸钙0.3-0.6份、n-异丙基甲基丙烯酰胺0.4-0.6份、酒石酸胆碱0.6-0.8份、核黄素0.1-0.3份、盐酸硫胺0.2-0.4份、盐酸吡哆辛0.3-0.5份、l-丙酰胺-l-谷氨二肽0.4-0.8份、乙酸酯1.5-2份、生物素0.6-0.8份、硫辛酸0.4-0.7份、酚红钠1-1.3份和去离子水100份。
进一步的，上述的mda-mb-231乳腺癌细胞的复苏方法，所述基础培养基还包括3-8份氨基酸，所述氨基酸以重量组分计，由以下组分组成：l-盐酸精氨酸5-10份、l-盐酸胱氨酸3-8份、l-丝氨酸3-6份、甘氨酸1-5份、l-盐酸组氨酸4-6份、l-异亮氨酸8-20份、l-亮氨酸7-18份、l-盐酸赖氨酸10-20份、l-甲硫氨酸1-6份、l-苯丙氨酸2-8份、l-苏氨酸5-15份、l-色氨酸1-3份、l-酪氨酸5-9份和l-缬氨酸8-12份。
进一步的，上述的mda-mb-231乳腺癌细胞的复苏方法，所述基础培养基还包括2-5份辅助因子，所述辅助因子以重量组分计，由以下组分组成：胰岛素生长因子3-8份、白介素62-5份、白介素101-4份、白介素123-6份、tnf-β2-10份、gm-csf1-5份。基础培养基组分合理，营养丰富，可以提高mda-mb-231乳腺癌细胞复苏后生长的营养物质，mda-mb-231细胞生长速度快，细胞状态好，边界清晰，镜下观察透亮、分裂相更多、形态及分散度佳，可以有利于乳腺癌转移的相关研究。
进一步的，上述的mda-mb-231乳腺癌细胞的复苏方法，所述基础培养基以重量组分计，还包括0.006份青霉素和0.01份的链霉素。可以有效防止复苏的细胞被污染。
进一步的，上述的mda-mb-231乳腺癌细胞的复苏方法，所述青霉素选自10000u/ml，所述链霉素选自10000μg/ml。青霉素和链霉素活性好，效果佳。
有益效果：本发明所述的mda-mb-231乳腺癌细胞的复苏方法稳定性高，能够去除冻存剂对复苏后细胞生长的影响，复苏后的mda-mb-231乳腺癌细胞存活率高，细胞生长速度快，细胞状态好，边界清晰，可以有利于乳腺癌转移的相关研究。
具体实施方式
下面将通过几个具体实施例，进一步阐明本发明，这些实施例只是为了说明问题，并不是一种限制。
实施例1
一种mda-mb-231乳腺癌细胞的复苏方法，包括以下步骤：将冻存的mda-mb-231乳腺癌细胞冻存管从液氮或者-80℃冰箱中取出，在取出后1min内于37℃摇晃至含有mda-mb-231乳腺癌细胞专用冻存液的mda-mb-231乳腺癌细胞液完全融化，将mda-mb-231乳腺癌细胞液加入到盛有2ml新鲜mda-mb-231乳腺癌细胞专用培养基的离心管中，用移液枪上下吹打20次，于1000g/min的转速下离心10min；移去上清液，加入1ml的新鲜mda-mb-231乳腺癌细胞专用培养基，用移液枪上下吹打40次，然后均匀的加入到盛有7ml的新鲜mda-mb-231乳腺癌细胞专用培养基的细胞培养皿中，于37℃，5%co2培养箱中培养。
其中，所述mda-mb-231乳腺癌细胞专用培养基包括70%的基础培养基以及30%的胎牛血清。此外，所述mda-mb-231乳腺癌细胞专用冻存液以重量组分计，包括以下组分：二甲基亚砜5份、羟甲基淀粉2份、海藻糖3份、维生素e0.5份、25%山梨醇1份、丙二醇0.8份、(s)-(-)-1-(4-氟异喹啉-5-基)磺酰基-2-甲基-1,4-二氮环庚烷0.5份和基础培养基80份。
其中，所述基础培养基以重量组分计，包括以下组分：葡萄糖82份、碳酸氢钠12份、丙酮酸钠10份、脂肪酸白蛋白6份、氯化钾35份、无水硫酸镁6份、氯化钠70份、无水磷酸二氢钠10份、叶酸0.3份、肌醇0.8份、烟酰胺0.3份、无水氯化钙25份、硝酸铁0.2份、丁二酸6份、丁二酸钠12份、d-泛酸钙0.3份、n-异丙基甲基丙烯酰胺0.4份、酒石酸胆碱0.6份、核黄素0.1份、盐酸硫胺0.2份、盐酸吡哆辛0.3份、l-丙酰胺-l-谷氨二肽0.4份、乙酸酯1.5份、生物素0.6份、硫辛酸0.4份、酚红钠1份和去离子水100份。
另，所述基础培养基还包括3份氨基酸，所述氨基酸以重量组分计，由以下组分组成：l-盐酸精氨酸5份、l-盐酸胱氨酸3份、l-丝氨酸3份、甘氨酸1份、l-盐酸组氨酸4份、l-异亮氨酸8份、l-亮氨酸7份、l-盐酸赖氨酸10份、l-甲硫氨酸1份、l-苯丙氨酸2份、l-苏氨酸5份、l-色氨酸1份、l-酪氨酸5份和l-缬氨酸8份。
再，所述基础培养基还包括2份辅助因子，所述辅助因子以重量组分计，由以下组分组成：胰岛素生长因子3份、白介素62份、白介素101份、白介素123份、tnf-β2份、gm-csf1份。
此外，所述基础培养基以重量组分计，还包括0.006份青霉素和0.01份的链霉素。并且，所述青霉素选自10000u/ml，所述链霉素选自10000μg/ml。
实施例2
一种mda-mb-231乳腺癌细胞的复苏方法，包括以下步骤：将冻存的mda-mb-231乳腺癌细胞冻存管从液氮或者-80℃冰箱中取出，在取出后1min内于37℃摇晃至含有mda-mb-231乳腺癌细胞专用冻存液的mda-mb-231乳腺癌细胞液完全融化，将mda-mb-231乳腺癌细胞液加入到盛有3ml新鲜mda-mb-231乳腺癌细胞专用培养基的离心管中，用移液枪上下吹打30次，于1500g/min的转速下离心3min；移去上清液，加入2ml的新鲜mda-mb-231乳腺癌细胞专用培养基，用移液枪上下吹打50次，然后均匀的加入到盛有9ml的新鲜mda-mb-231乳腺癌细胞专用培养基的细胞培养皿中，于37℃，5%co2培养箱中培养。
其中，所述mda-mb-231乳腺癌细胞专用培养基包括90%的基础培养基以及10%的胎牛血清。此外，所述mda-mb-231乳腺癌细胞专用冻存液以重量组分计，包括以下组分：二甲基亚砜15份、羟甲基淀粉5份、海藻糖12份、维生素e3份、25%山梨醇5份、丙二醇1.6份、(s)-(-)-1-(4-氟异喹啉-5-基)磺酰基-2-甲基-1,4-二氮环庚烷2份和基础培养基90份。
其中，所述基础培养基以重量组分计，包括以下组分：葡萄糖88份、碳酸氢钠25份、丙酮酸钠16份、脂肪酸白蛋白12份、氯化钾45份、无水硫酸镁10份、氯化钠78份、无水磷酸二氢钠14份、叶酸0.5份、肌醇1.2份、烟酰胺0.6份、无水氯化钙35份、硝酸铁0.4份、丁二酸8份、丁二酸钠16份、d-泛酸钙0.6份、n-异丙基甲基丙烯酰胺0.6份、酒石酸胆碱0.8份、核黄素0.3份、盐酸硫胺0.4份、盐酸吡哆辛0.5份、l-丙酰胺-l-谷氨二肽0.8份、乙酸酯2份、生物素0.8份、硫辛酸0.7份、酚红钠1.3份和去离子水100份。
另，所述基础培养基还包括8份氨基酸，所述氨基酸以重量组分计，由以下组分组成：l-盐酸精氨酸10份、l-盐酸胱氨酸8份、l-丝氨酸6份、甘氨酸5份、l-盐酸组氨酸6份、l-异亮氨酸20份、l-亮氨酸18份、l-盐酸赖氨酸20份、l-甲硫氨酸6份、l-苯丙氨酸8份、l-苏氨酸15份、l-色氨酸3份、l-酪氨酸9份和l-缬氨酸12份。
再，所述基础培养基还包括5份辅助因子，所述辅助因子以重量组分计，由以下组分组成：胰岛素生长因子8份、白介素65份、白介素104份、白介素126份、tnf-β10份、gm-csf5份。
此外，所述基础培养基以重量组分计，还包括0.006份青霉素和0.01份的链霉素。并且，所述青霉素选自10000u/ml，所述链霉素选自10000μg/ml。
实施例3
一种mda-mb-231乳腺癌细胞的复苏方法，包括以下步骤：将冻存的mda-mb-231乳腺癌细胞冻存管从液氮或者-80℃冰箱中取出，在取出后1min内于37℃摇晃至含有mda-mb-231乳腺癌细胞专用冻存液的mda-mb-231乳腺癌细胞液完全融化，将mda-mb-231乳腺癌细胞液加入到盛有2ml新鲜mda-mb-231乳腺癌细胞专用培养基的离心管中，用移液枪上下吹打20次，于1200g/min的转速下离心5min；移去上清液，加入1ml的新鲜mda-mb-231乳腺癌细胞专用培养基，用移液枪上下吹打45次，然后均匀的加入到盛有8ml的新鲜mda-mb-231乳腺癌细胞专用培养基的细胞培养皿中，于37℃，5%co2培养箱中培养。
其中，所述mda-mb-231乳腺癌细胞专用培养基包括80%的基础培养基以及20%的胎牛血清。此外，所述mda-mb-231乳腺癌细胞专用冻存液以重量组分计，包括以下组分：二甲基亚砜12份、羟甲基淀粉3份、海藻糖8份、维生素e2份、25%山梨醇3份、丙二醇1份、(s)-(-)-1-(4-氟异喹啉-5-基)磺酰基-2-甲基-1,4-二氮环庚烷1份和基础培养基85份。
其中，所述基础培养基以重量组分计，包括以下组分：葡萄糖86份、碳酸氢钠18份、丙酮酸钠12份、脂肪酸白蛋白9份、氯化钾40份、无水硫酸镁8份、氯化钠75份、无水磷酸二氢钠12份、叶酸0.4份、肌醇1份、烟酰胺0.5份、无水氯化钙30份、硝酸铁0.3份、丁二酸7份、丁二酸钠14份、d-泛酸钙0.5份、n-异丙基甲基丙烯酰胺0.5份、酒石酸胆碱0.7份、核黄素0.2份、盐酸硫胺0.3份、盐酸吡哆辛0.4份、l-丙酰胺-l-谷氨二肽0.6份、乙酸酯1.8份、生物素0.7份、硫辛酸0.6份、酚红钠1.2份和去离子水100份。
另，所述基础培养基还包括4份氨基酸，所述氨基酸以重量组分计，由以下组分组成：l-盐酸精氨酸8份、l-盐酸胱氨酸6份、l-丝氨酸5份、甘氨酸3份、l-盐酸组氨酸5份、l-异亮氨酸12份、l-亮氨酸10份、l-盐酸赖氨酸15份、l-甲硫氨酸3份、l-苯丙氨酸4份、l-苏氨酸9份、l-色氨酸2份、l-酪氨酸6份和l-缬氨酸9份。
再，所述基础培养基还包括3份辅助因子，所述辅助因子以重量组分计，由以下组分组成：胰岛素生长因子5份、白介素63份、白介素102份、白介素125份、tnf-β8份、gm-csf2份。
此外，所述基础培养基以重量组分计，还包括0.006份青霉素和0.01份的链霉素。并且，所述青霉素选自10000u/ml，所述链霉素选自10000μg/ml。
实施例4
一种mda-mb-231乳腺癌细胞的复苏方法，包括以下步骤：将冻存的mda-mb-231乳腺癌细胞冻存管从液氮或者-80℃冰箱中取出，在取出后1min内于37℃摇晃至含有mda-mb-231乳腺癌细胞专用冻存液的mda-mb-231乳腺癌细胞液完全融化，将mda-mb-231乳腺癌细胞液加入到盛有3ml新鲜mda-mb-231乳腺癌细胞专用培养基的离心管中，用移液枪上下吹打20次，于1200g/min的转速下离心8min；移去上清液，加入1ml的新鲜mda-mb-231乳腺癌细胞专用培养基，用移液枪上下吹打50次，然后均匀的加入到盛有9ml的新鲜mda-mb-231乳腺癌细胞专用培养基的细胞培养皿中，于37℃，5%co2培养箱中培养。
其中，所述mda-mb-231乳腺癌细胞专用培养基包括70%的基础培养基以及30%的胎牛血清。此外，所述mda-mb-231乳腺癌细胞专用冻存液以重量组分计，包括以下组分：二甲基亚砜5份、羟甲基淀粉5份、海藻糖9份、维生素e3份、25%山梨醇1份、丙二醇1份、(s)-(-)-1-(4-氟异喹啉-5-基)磺酰基-2-甲基-1,4-二氮环庚烷1.5份和基础培养基85份。
其中，所述基础培养基以重量组分计，包括以下组分：葡萄糖82份、碳酸氢钠25份、丙酮酸钠10份、脂肪酸白蛋白8份、氯化钾38份、无水硫酸镁8份、氯化钠70份、无水磷酸二氢钠10份、叶酸0.5份、肌醇1.2份、烟酰胺0.5份、无水氯化钙30份、硝酸铁0.4份、丁二酸6份、丁二酸钠12份、d-泛酸钙0.6份、n-异丙基甲基丙烯酰胺0.5份、酒石酸胆碱0.7份、核黄素0.2份、盐酸硫胺0.4份、盐酸吡哆辛0.3份、l-丙酰胺-l-谷氨二肽0.8份、乙酸酯1.8份、生物素0.6份、硫辛酸0.7份、酚红钠1份和去离子水100份。
另，所述基础培养基还包括6份氨基酸，所述氨基酸以重量组分计，由以下组分组成：l-盐酸精氨酸5份、l-盐酸胱氨酸8份、l-丝氨酸6份、甘氨酸1份、l-盐酸组氨酸4份、l-异亮氨酸12份、l-亮氨酸12份、l-盐酸赖氨酸20份、l-甲硫氨酸1份、l-苯丙氨酸2份、l-苏氨酸5份、l-色氨酸2份、l-酪氨酸6份和l-缬氨酸10份。
再，所述基础培养基还包括2份辅助因子，所述辅助因子以重量组分计，由以下组分组成：胰岛素生长因子3份、白介素65份、白介素104份、白介素123份、tnf-β5份、gm-csf3份。
此外，所述基础培养基以重量组分计，还包括0.006份青霉素和0.01份的链霉素。并且，所述青霉素选自10000u/ml，所述链霉素选自10000μg/ml。