专利名称：焦磷酸测序法检测gstp1基因多态性的试剂盒及方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，具体涉及焦磷酸测序法检测GSTPl基因多态性的试剂盒及方法。
背景技术：
人类谷胱甘肽S转移酶Pl (GSTPl)是体内最重要的II相解毒酶，主要催化GSH与多种外源性化学物在体内的活性代谢产物结合，在很多癌症化疗药物的解毒代谢中起重要作用。钼类抗癌药是临床上的一线化疗药物，用于多种肿瘤的化疗。常见的有顺钼、卡钼、奥沙利钼、奈达钼、乐钼等。GSTPl rsl695 (Ilel05Val)突变导致酶活性显著降低，降低 了钼类化疗药物的代谢清除率，延长了钼类化疗药物对肿瘤的作用，因此患者化疗后生存率显著增加，但应关注药物毒副作用。有研究报道奥沙利钼治疗的患者中，发生3级神经毒性23%为Ilel05Ile野生型纯合子，77%为105Val突变携带者。经正规治疗的Vall05Val突变纯合子患者晚期结直肠癌患者的相同时间生存率约为75% ； Vall05Val杂合子患者晚期结肠直肠癌患者的相同时间生存率约为40% ；Ilel05Ile野生型纯合子相同时间生存率仅为5%。蒽环类(Anthracyclines)化疗药物是临床常用的抗肿瘤抗生素药物，主要包括阿霉素、表阿霉素等，是一类细胞周期非特异性化疗药。其主要药理作用是通过嵌入DNA碱基对之间，抑制拓扑异构酶II的催化活性，导致DNA断裂。GSTPl参与蒽环类的代谢过程，是影响蒽环类药物需经肝脏代谢活化后起效的重要酶。GSTPl遗传多态性对蒽环类化疗药物的疗效或毒性反应有重要影响。其rsl695位点发生A>G将引起Ilel05Val，从而降低酶的活性，导致蒽环类药物的活化效率降低。携带A/A (70. 5%)基因型疗效较差。反之，携带G/G (2. 6%)等位基因患者对化疗更为敏感，疗效较好。有研究表明、接受蒽环类抗生素化疗的结直肠癌患者中携带G/G等位基因较携带A/A基因型对化疗更为敏感，疗效更好。综上所述，GSTPl基因多态性可作为钼类化疗药物、蒽环类抗生素等药物疗效预测的有效指标，开发快速、高效、准确、便捷、经济的检测GSTPl基因多态性的试剂盒将为GSTPl底物药(如钼类、蒽环类抗生素等)的临床个体化治疗起到积极的推动作用。焦磷酸测序(Pyro sequencing)技术是新一代DNA序列分析技术,该技术无须进行电泳，DNA片段也无须荧光标记，是一种通用型技术平台。该技术具有操作简便、检测成本低、所需样品量小、快捷、准确、高通量等特点，符合临床大样本检测要求。
发明内容
本发明旨在提供一种焦磷酸测序法检测GSTPl基因(SEQ ID NO. I)多态性的试剂盒及方法，以实现快速、简便、准确、高效、实用、经济的检测GSTPl基因多态性，利于临床个体化使用GSTPl的底物药(如钼类、蒽环类抗生素等)。为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为所述焦磷酸测序发检测GSTPl基因多态性的试剂盒，包括如下引物
(1)扩增引物
上游引物5’ -CTG GTG GAC ATG GTG AAT-3’ (SEQ ID NO. 2)；
下游引物5’ -CCC AGT GCC CAA CCC TGG-3，(SEQ ID NO. 3)；
其中，下游引物的5 进行生物素标记；
(2)测序引物:5，-CCTCCG CTG CAA ATA-3，(SEQ ID NO. 4)；
在实际应用中，可以对上述引物作适当改变，只要保证设计的引物与上述引物同源性达95%以上即可；试剂盒中其他试剂及溶液为PCR和DNA焦磷酸测序的常规试剂。所述应用上述试剂盒检测GSTPl基因多态性的方法，包括如下步骤
(1)DNA 提取；
(2)聚合酶链反应
配制 50 ill PCR 扩增体系，包含10 X PCR buffer 5. Oy I，dNTP I. 5 y I，GSTPl-上游引物 0. 5iil，GSTPl 下游引物 0. 5iil，rTaqO. 5iil，水 40iil，模板 2iil ;循环程序为95V 5min预变性；依次在95°C 30S,55°C 30S,72°C 15S，进行35个循环；72°C保持5min，最终保持在4°C，得扩增产物；
(3)焦磷酸测序单链样本纯化；
(4)焦磷酸测序及结果分析。本发明的试剂盒对GSTPl rsl695 (A>G)目标序列，该目标序列包括野生型AATACATCTCC (SEQ ID NO. 5)和突变型 AATACGTCTCC (SEQ ID NO. 6);扩增出的片段长为104bp。由于设计了特异性高的引物，并且选择了合适的方法，本发明的试剂盒能够对GSTPl基因多态性进行快速检测，可广泛应用于临床上钼类、蒽环类抗生素等个体化用药方案制定的基因检测。与现有技术相比，其应用焦磷酸测序技术可以快速、准确地进行短DNA序列分析，便于构建标准化操作流程；具有高通量、低成本等特点；PCR产物即可直接用于测序，不需进行产物纯化等二次处理，操作极为简便，所需样品量小。
图I为本发明GSTPl rsl695 (AA)焦磷酸测序结果；
图2为本发明GSTPl rsl695 (AG)焦磷酸测序结果；
图3为本发明GSTPl rsl695 (GG)焦磷酸测序结果。
具体实施例方式下面结合实施例对上述试剂盒及检测方法进行详细描述。实施例I :
GSTPl-pyroF (上游引物):5，- CTG GTG GAC ATG GTG AAT -3，(SEQ ID NO. 2)； GSTPl-pyroR (下游引物):5’ - CCC AGT GCC CAA CCC TGG -3’ (SEQ ID NO. 3)；
测序引物:5，- CCT CCG CTG CAA ATA -3，(SEQ ID NO. 4)；
I. DNA提取1.1实验前试剂材料准备与检查工作如下
(I)检查试剂盒保质期以及确保Wash Buffer I和2中已添加乙醇，并在瓶上相应标识处打勾V ; (2)异丙醇(如无，可用无水乙醇替代)和75%乙醇；(3)高压灭菌有效期内的I. 5mL Eppendorf管和各类移液枪头。I. 2从4°C冰箱中取出装有全血的EDTA抗凝管，上下颠倒数次混匀；
I. 3在I. 5mL Eppendorf管对应标本唯一性标识做好标记；
I. 4 分别移取 900uL Cell Lysis Solution 加至灭菌的 I. 5mL Eppendorf 管；
I. 5小心移取300uL全血转移至上述加有Cell Lysis Solution的I. 5mL EP管；
I. 6盖上Eppendorf管盖，室温孵育IOmin ；
I. 713, OOOrpm室温离心20秒；
I. 8取出Eppendorf管,观察白色沉淀；
I. 9开Eppendorf管盖，手持管底部，倾斜EP管口弃去部分红色上清，尽量将红色上清吸尽；
I. 10盖上Eppendorf管,用手指弹击EP管底部,使白色沉淀重悬；
1.11移取30011]^ Nuclei Lysis Solution入上述Eppendorf管中，盖上管，上下颠倒数次混匀；
I. 12 打开 Eppendorf 管，移取 IOOuL Protein Precipitation Solution 入上述Eppendorf管中，盖上管管,振荡器上剧烈振荡20秒；13，OOOrpm室温离心3min ；
I. 13移取上清转移到新的已灭菌I. 5mL Eppendorf管；
I. 14移取300uL异丙醇入EP管，盖上管盖，上下颠倒数次混匀，可见白色絮状gDNA析
出；
I. 15 13, OOOrpm 室温离心 Imin ；
I. 16打开Eppendorf管，手捏管底部，倾斜管口弃去上清；
I. 17移取300uL 75%乙醇加入Eppendorf管，盖上管盖，轻柔上下颠倒洗涤沉淀；
I. 18 13, OOOrpm 室温离心 Imin ；
I.19打开Eppendorf管，手持管底部，倾斜管口弃去上清；
I.20在实验台上放置新滤纸,倒扣Eppendorf管，吸干液体,将Eppendorf管开盖侧放风干；
I. 21目测沉淀大小，加入50 IOOul DNA Rehydration Solution至沉淀；
1.22过夜溶解后用Nano-Space紫外分光光度计进行核酸浓度测定，核酸浓度大于50ng/ul视为合格，如浓度不够，加入乙醇再次沉淀DNA，然后重新加适量的DNARehydration Solution 溶解 DNA。I. 23在管壁和管盖上再次标清样本唯一性编号，并用透明胶带缠绕保护；
1.24保存核酸标本至4°C冰箱；
2.聚合酶链反应
2.I在试剂准备区配制50 Ul PCR扩增体系(模板添加除外)，各组分及添加量如下表
权利要求
1.一种焦磷酸测序发检测GSTPl基因多态性的试剂盒，其特征在于，包括如下引物 (1)扩增引物上游引物:5，-CTG GTG GAC ATG GTG AAT-3’ ；下游引物5’ -CCC AGT GCC CAA CCC TGG-3，； 其中，下游引物的5’进行生物素标记； (2)测序引物:5，-CCTCCG CTG CAA ATA-3，。
2.一种应用权利要求I所述的试剂盒检测GSTPl基因多态性的方法，其特征在于，包括如下步骤 (1)DNA 提取； (2)聚合酶链反应 配制 50 ill PCR 扩增体系，包含10 X PCR buffer 5. Ou I, dNTP I. 5 y I，GSTPl-上游引物0. 5iU，GSTPl下游引物0. 5iU，rTaqO. 5iU，水40iU，模板2iil ;循环程序为95°C 5min 预变性；依次在 95°C 30S,55°C 30S,72°C 15S，进行 35 个循环；72°C 保持 5min，最终保持在4°C，得扩增产物； (3)焦磷酸测序单链样本纯化； (4)焦磷酸测序及结果分析。
全文摘要
本发明公开了一种焦磷酸测序法检测GSTP1基因多态性的试剂盒及方法。所述试剂盒GSTP1基因多态性进行检查，具体的是指rs1695(A>G)单核苷酸多态性。试剂盒包含如SEQIDNO.2—4引物。本发明的试剂盒，可以实现准确、快捷、高通量GSTP1基因多态性的检测，从而达到对其底物铂类化疗药物、蒽环类抗生素等实现安全合理有效的个体化给药。
文档编号C12Q1/68GK102776281SQ20121023135
公开日2012年11月14日 申请日期2012年7月5日 优先权日2012年7月5日
发明者周宏灏 申请人:周宏灏