专利名称：一种酶法合成海藻糖的工艺方法
技术领域：
本发明涉及一种海藻糖的制备方法，尤其涉及一种应用基因工程、酶工程和发酵工程合成海藻糖的工艺方法。
背景技术：
海藻糖(trehalose)是一种稳定的非还原性双糖，它由两个吡喃环葡萄糖分子与1，1糖苷键连结而成(杉本利行，1994)。海藻糖可以几种固体形式存在，最常见的是二水化合物，熔点达97℃，将其加热至130℃，使其失去结晶水而成为无水结晶体时，熔点可达214～216℃。其水溶液性质稳定，无色无嗅，口感略带甜味，不会焦糖化。海藻糖的理化性质十分稳定，不能使斐林试剂还原，也不能被α-糖苷酶水解，但在强酸条件下能被水解为两个葡萄糖分子。
现有的生产海藻糖的工艺方法有以下几种一、从酵母中抽提海藻糖这是最早生产海藻糖的方法，主要是从面包酵母、酿酒酵母中抽提。目前，从酵母中提取海藻糖的工艺已相当成熟，但由于制造成本高，其价格仍然偏高。
二、微生物发酵生产海藻糖通过培养能产生海藻糖的微生物进行发酵生产海藻糖也取得了一定的进展。据文献报道真菌有20几个属33个种，均是开发海藻糖的菌种资源。特别值得注意的是某些蘑菇菌，所含海藻糖占其干重的10％～15％。近年来国内外已把目光放在灰树花的开发，其价值不仅在于灰树花含有多糖、双糖、多种维生素、微量元素及其他有效活性成分，而且海藻糖的含量比香菇、金针菇都要高。采用诱变育种、细胞融合或基因工程方法选育产海藻糖高的菌株，然后采用高浓度的培养基及高渗发酵，并在发酵结束前让酵母菌“饥饿”2～3h，可以得到含海藻糖较高的培养物。(罗明典等，1996)三、利用基因工程方法生产海藻糖一是利用海藻糖基因构建具有抗逆性的转基因植物，二是利用工程微生物和酶工程改进海藻糖生产。荷兰的Mogen与Vanderhave公司1992年开始设法提高甜菜和马钟薯等农作物中海藻糖的含量，现已获得生产专利(杨琳等，1999)。美国Calgene公司研究人员将葡萄糖转化为海藻糖的基因通过一种细菌导入植物，构建的重组植物具有生产海藻糖能力，并认为葡萄糖转化为海藻糖时完全受有关酶基因的控制(罗明典等，1996)。
目前生产海藻糖的工艺方法成本都较为昂贵，找到廉价生产海藻糖的方法将获得很重大的经济效益。
发明内容
本发明的目的在于提供一种廉价的，应用基因工程、酶工程和发酵工程酶法合成海藻糖的工艺方法，以获得重大的经济效益。
海藻糖是一种有着广阔应用前景的双糖，目前生产海藻糖的方法成本都较为昂贵，找到廉价生产海藻糖的方法将获得很重大的经济效益。有文献报道，在担子苗灰树花中，海藻糖的干重最高达到15～17％左右，这说明灰树花合成海藻糖的能力很强。本发明的出发点是拟通过灰树花海藻糖合成酶基因的克隆和表达，将基因工程和酶工程结合，在酶法生产海藻糖方面形成新的技术和工艺。
灰树花海藻糖的合成途径如下
由上述合成途径可见，海藻糖合成酶需要D-葡萄糖和α-D-葡萄糖-1-磷酸作为反应底物。而在大肠杆菌中，蔗糖磷酸化酶能将蔗糖分解为果糖和α-D-葡萄糖-1-磷酸(KOKI SAITO et al，1998)。
本发明的思路就是将灰树花海藻糖合成酶和大肠杆菌蔗糖磷酸化酶的基因克隆，通过基因工程和发酵工程的方法获得这两种酶。利用这两种酶，可以以蔗糖和葡萄糖这两种廉价的原料来工业化规模化生产海藻糖。
本发明的目的通过以下技术方案予以实现本发明提供的一种酶法合成海藻糖的工艺方法，包括下列步骤a.分别克隆灰树花海藻糖合成酶基因和大肠杆菌蔗糖磷酸化酶基因；b.分别构建灰树花海藻糖合成酶基因和大肠杆菌蔗糖磷酸化酶基因的表达载体；c.在酵母中分别转化、表达灰树花海藻糖合成酶基因以及大肠杆菌蔗糖磷酸化酶基因的表达载体，构成重组蛋白，然后对重组蛋白进行纯化；d.在以蔗糖和葡萄糖为主要成分的反应液中，分别加入纯化的上述重组蛋白合成海藻糖。
本发明可采取如下进一步措施在所述步骤a中克隆灰树花海藻糖合成酶基因的方法是利用引物15′CCGAA TTC ATG GCT CCT CCC CAC CAG-3′，引物25′GC TCT AGA TCC CTGCAC ATG CAG TTC-3′，采用RT-PCR方法从灰树花总RNA中扩增出一个大约2.2kb左右的片段，将该片段连接到pMD-T载体上；克隆大肠杆菌蔗糖磷酸化酶基因的方法是利用引物15′CC GAA TTC ATG AAA CAG AAA ATT ACG-3′，引物25′GC TCT AGA TTT AAT CCA CAT AACCTG-3′，采用RT-PCR方法从大肠杆菌的总DNA中得到大约1.7kb左右的片段，将该片段连接到PMD-T载体上。
在所述步骤b中将灰树花海藻糖合成酶基因用EcoRI和BamHI双酶切，然后和双酶切后的pPICZα质粒连接；将大肠杆菌蔗糖磷酸化酶基因用EcoRI和XbaI双酶切，然后和双酶切后的pPICZα质粒连接。如需获得更多是质粒载体，所述步骤b中构建的表达载体还可采用如下方法复制参照Sambrook方法，按CaCl2法在E.Coli.DH5α菌株中转化质粒，用含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB培养基转化细菌，碱法提取质粒。
在所述步骤c中将构建好的灰树花海藻糖合成酶基因和大肠杆菌蔗糖磷酸化酶基因的表达载体利用电激法，将其转入培养好的毕赤酵母细胞中，转化后均匀涂于含有Zeocin的YPDS平板中，大约3-4天可看到白色菌落出现。
在所述步骤c中挑取酵母转化子单菌落接种于10mlBMGY中，置于50ml锥形瓶中，30℃，250rpm摇瓶培养至OD600＝2-6左右，离心收集菌体，菌体重悬于50mlBMMY中至OD600＝1；振荡培养，每隔24小时加入100％甲醇至终浓度1％进行诱导表达，灰树花海藻糖合成酶基因和大肠杆菌蔗糖磷酸化酶基因的表达量分别为180毫克/升和120毫克/升。
在所述步骤c中利用组氨酸亲和柱对重组蛋白进行纯化，纯化后的蛋白纯度达到90％以上。
所述步骤d中在sucrose∶glucose∶Pi＝30∶30∶1mM的反应液中，加入溶于MES(pH6.5)缓冲液中浓度为1微克/微升的海藻糖合成酶和大肠杆菌蔗糖磷酸化酶，两种酶在反应液中的浓度各为1微克/毫升，于37℃反应24小时。
本发明具有以下有益效果应用基因工程、酶工程和发酵工程合成海藻糖，在酶法生产海藻糖方面形成了新的技术和工艺，同时以蔗糖和葡萄糖这两种廉价的原料来实现工业化规模化生产海藻糖，降低了成本，具有重大的经济效益。
下面将结合实施例和附图对本发明作进一步的详细描述，但不以任何形式限制本发明。
图1是pPICZα-TR载体构建策略图2是pPICZα-TR的酶切鉴定图中1、pPICZα-TR为模板的扩增结果2、pPICZα-TR/EcoRI+XbaI3、pPICZα-TR/EcoRI4、pPICZα-TR/EcoRI5、trehalose synthase gene图3是pPICZα-SUC载体构建策略图4是pPICZα-SUC的酶切鉴定图中1、pPICZα-SUC为模板的扩增结果2、pPICZ α-SUC/EcoRI+XbaI3、pPICZα-SUC/EcoRI4、pPICZα-TR/EcoRI5、sucrose phosphorylase图5是毕赤酵母转化的PCR鉴定图中1-4pPICZα-SUC转化子基因组DNA扩增结果5-7pPICAα-TR转化子基因组DNA扩增结果。
图6是蔗糖磷酸化酶的纯化图中1、低分子量蛋白质标样2、Pichia/pPICZα-SUC转化子诱导表达4天的发酵液3、纯化的蔗糖磷化酶图7是海藻糖合成酶的纯化图中1、低分子量蛋白质标样2、Pichia/pPICZα-TR转化子诱导表达4天的发酵液3、纯化的海藻糖合成酶图8是纸层析法分析酶反应结果图中1、海藻糖标准样品2、海藻糖合成结果(酶由酵母表达)具体实施方式
实施例1灰树花海藻糖合成酶基因的克隆和序列分析根据基因bank网站记载的灰树花海藻糖合成酶基因序列设计了一对引物引物15′CC GAA TTC ATG GCT CCT CCC CAC CAG-3′，引物25′GC TCT AGA TCCCTG CAC ATG CAG TTC-3′，利用RT-PCR方法从灰树花总RNA中扩增出了一个大约2.2kb的片段，将该片段连接到pMD-T载体上(命名为PMD-T-TR)，进行测序。从灰树花RNA中扩增的片段全长2199bp，编码732个氨基酸，根据DNASIS软件分析，同报道的序列相比，有98.5％的碱基相同，而氨基酸序列则有99.2％的相似性。
实施例2大肠杆菌蔗糖磷酸化酶基因的克隆和序列分析提取大肠杆菌的总DNA，利用引物15′CC GAA TTC ATG AAA CAG AAAATT ACG-3′，引物25′GC TCT AGA TTT AAT CCA CAT AACCTG-3′进行PCR扩增，得到大约1.7kb的片段，将其连接到PMD-T载体上(命名为PMD-T-SUC)，进行测序。该基因全长1680bp，编码559个氨基酸，根据DNASIS软件分析，测序结果与基因BANK中大肠杆菌蔗糖磷酸化酶的序列相比，完全相同。
实施例3灰树花海藻糖合成酶基因酵母表达载体的构建如图1所示，将PMD-T-TR载体上的海藻糖合成酶基因用EcoRI和BamHI双酶切，和双酶切后的pPICZα质粒连接，连接后的质粒命名为pPICZα-TR。如图2所示，单酶切结果和双酶切结果都表明，海藻糖合成酶基因已和载体相连。以载体为模板进行PCR反应，也扩增出了目的片段，经过测序结果表明和以前测序结果相同。
实施例4大肠杆菌蔗糖磷酸化酶基因表达载体的构建如图3所示，将PMD-T-SUC上的大肠杆菌蔗糖磷酸化酶基因用EcoRI和XbaI双酶切，和双酶切后的pPICZα质粒连接，连接后的质粒命名为pPICZα-SUC。如图4所示，单酶切结果和双酶切结果都表明，大肠杆菌蔗糖磷酸化酶基因已和载体相连。以载体为模板进行PCR反应，也扩增出了目的片段，经过测序结果表明和以前测序结果相同。
实施例5毕赤酵母的转化和转化子的鉴定将构建好的转化质粒利用电激法，将其转入培养好的酵母细胞中，转化后均匀涂于含有Zeocin的YPDS平板中，大约3-4天可看到白色菌落出现。挑取适当数目的菌落，培养过夜，取适量菌液，采用煮沸法提取基因组DNA作为PCR模板(刘秋云，2001)。通过PCR检测目的基因。如图5所示，从电泳图谱中可以看出，以基因组DNA为模板进行PCR反应扩增出了目的片段，说明蔗糖磷酸化酶基因和海藻糖合成酶基因已经整合到酵母基因组中，扩增出的目的片段连接到T载体上进行测序，同以前的测序结果相比是相同的。
实施例6海藻糖合成酶基因和蔗糖磷酸化酶基因在酵母中的表达挑取酵母转化子单菌落接种于10mlBMGY中，置于50ml锥形瓶中，30℃，250rpm摇瓶培养至OD600＝2-6左右，离心收集菌体，菌体重悬于50mlBMMY中(装于500毫升三角瓶中)至OD600＝1；振荡培养，每隔24小时加入100％甲醇至终浓度1％进行诱导表达，灰树花海藻糖合成酶基因和大肠杆菌蔗糖磷酸化酶基因的表达量分别为180毫克/升和120毫克/升。每隔12小时取样做菌浓度分析，每24小时取样做蛋白检测。
实施例7海藻糖合成酶和蔗糖磷酸化酶的纯化用毕赤酵母表达的蛋白C末端有6个组氨酸(pPICZα载体上所带)，使用组氨酸亲和柱，可将蛋白快速纯化。纯化后的重组蛋白纯度达到90％以上(见图6和图7)。
实施例8海藻糖的合成试验在1毫升的反应液(300mM sucrose，300mM glucose，10mMPi)中，加入溶于MES(pH6.5)缓冲液中的海藻糖合成酶和蔗糖磷酸化酶各1微升(浓度约为1微克/微升)，于37℃反应24小时，取30微升做纸层析分析，通过纸层析定性分析，如图8所示，在反应液中都检测到了海藻糖的存在。证明在酵母和细菌中表达的海藻糖合成酶和蔗糖磷酸化酶都具有酶活性。而且说明利用重组表达的海藻糖合成酶和蔗糖磷酸化酶合成海藻糖的方法是可行的。
另外，如需获得更多是质粒载体，所述步骤b中构建的表达载体还可采用如下方法复制参照Sambrook(Sambrook，et al.1989，Molecular cloing.Cold Spring HarborLabroratory Press.USA)方法，按CaCl2法在E.Coli.DH5α菌株中转化质粒，用含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB培养基转化细菌，碱法提取质粒。
将上述实施例6、实施例7的规模放大便可实现通过应用本发明专利的技术达到应用较廉价的原料来工业化生产海藻糖的目的。
权利要求
1.一种酶法合成海藻糖的工艺方法，包括下列步骤a.分别克隆灰树花海藻糖合成酶基因和大肠杆菌蔗糖磷酸化酶基因；b.分别构建灰树花海藻糖合成酶基因和大肠杆菌蔗糖磷酸化酶基因的表达载体；c.在酵母中分别转化、表达灰树花海藻糖合成酶基因以及大肠杆菌蔗糖磷酸化酶基因的表达载体，构成重组蛋白，然后对重组蛋白进行纯化；d.在以蔗糖和葡萄糖为主要成分的反应液中，分别加入纯化的上述重组蛋白合成海藻糖。
2.根据权利要求1所述的酶法合成海藻糖的工艺方法，在所述步骤a中克隆灰树花海藻糖合成酶基因的方法是利用引物15′CC GAA TTC ATG GCT CCTCCC CAC CAG-3′，引物25′GC TCTAGA TCC CTG CAC ATG CAG TTC-3′，采用RT-PCR方法从灰树花总RNA中扩增出一个大约2.2kb左右的片段，将该片段连接到pMD-T载体上；克隆大肠杆菌蔗糖磷酸化酶基因的方法是利用引物15′CC GAA TTC ATG AAA CAG AAA ATT ACG-3′，引物25′GC TCT AGA TTT AATCCA CAT AACCTG-3′，采用RT-PCR方法从大肠杆菌的总DNA中得到大约1.7kb左右的片段，将该片段连接到PMD-T载体上。
3.根据权利要求1所述的酶法合成海藻糖的工艺方法，在所述步骤b中将灰树花海藻糖合成酶基因用EcoRI和BamHI双酶切，然后和双酶切后的pPICZα质粒连接；将大肠杆菌蔗糖磷酸化酶基因用EcoRI和XbaI双酶切，然后和双酶切后的pPICZα质粒连接。
4.根据权利要求1所述的酶法合成海藻糖的工艺方法，所述步骤b中构建的表达载体还可采用如下方法复制参照Sambrook方法，按CaCl2法在E.Coli.DH5α菌株中转化质粒，用含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB培养基转化细菌，碱法提取质粒。
5.根据权利要求1所述的酶法合成海藻糖的工艺方法，在所述步骤c中将构建好的灰树花海藻糖合成酶基因和大肠杆菌蔗糖磷酸化酶基因的表达载体利用电激法，将其转入培养好的毕赤酵母细胞中，转化后均匀涂于含有Zeocin的YPDS平板中，大约3-4天可看到白色菌落出现。
6.根据权利要求1所述的酶法合成海藻糖的工艺方法，在所述步骤c中挑取酵母转化子单菌落接种于10mlBMGY中，置于50ml锥形瓶中，30℃，250rpm摇瓶培养至OD600＝2-6左右，离心收集菌体，菌体重悬于50mlBMMY中OD600＝1；振荡培养，每隔24小时加入100％甲醇至终浓度1％进行诱导表达，灰树花海藻糖合成酶基因和大肠杆菌蔗糖磷酸化酶基因的表达量分别为180毫克/升和120毫克/升。
7.根据权利要求1所述的酶法合成海藻糖的工艺方法，在所述步骤c中利用组氨酸亲和柱对重组蛋白进行纯化，纯化后的蛋白纯度达到90％以上。
8.根据权利要求1所述的酶法合成海藻糖的工艺方法，所述步骤d中在sucrose∶glucose∶Pi＝30∶30∶1mM的反应液中，加入溶于MES(pH6.5)缓冲液中浓度为1微克/微升的海藻糖合成酶和大肠杆菌蔗糖磷酸化酶，两种酶在反应液中的浓度各为1微克/毫升，于37℃反应24小时。
全文摘要
本发明公开了一种酶法合成海藻糖的工艺方法，包括下列步骤a.分别克隆灰树花海藻糖合成酶基因和大肠杆菌蔗糖磷酸化酶基因；b.分别构建灰树花海藻糖合成酶基因和大肠杆菌蔗糖磷酸化酶基因的表达载体；c.在酵母中分别转化、表达灰树花海藻糖合成酶基因以及大肠杆菌蔗糖磷酸化酶基因的表达载体，构成重组蛋白，然后对重组蛋白进行纯化；d.在以蔗糖和葡萄糖为主要成分的反应液中，分别加入纯化的上述重组蛋白合成海藻糖。本发明应用基因工程、酶工程和发酵工程合成海藻糖，在酶法生产海藻糖方面形成了新的技术和工艺，同时以蔗糖和葡萄糖这两种廉价的原料来实现工业化规模化生产海藻糖，降低了成本，具有重大的经济效益。
文档编号C12P19/12GK1740323SQ200410051199
公开日2006年3月1日 申请日期2004年8月24日 优先权日2004年8月24日
发明者李宝健, 徐志祥 申请人:李宝健