pg、l〇pg、l〇〇pg、lng及10ng分别表示在25μL的PCR反应体系中，所 加入的 1μL模板DNA的浓度分别为 100fg/μL、lpg/μL、10pg/μL、100pg/μL、lng/μL及 10ng/μL〇
[0098] 如图1所示，使用本发明的引物对时，各自以femA、hilA和ipaH基因为目标检测 基因的单重PCR检测反应灵敏度均达到lpg/μL。
[0099] 比较例1 :引物灵敏度的比较
[0100] 将使用本发明引物对的检测方法的灵敏度与现有技术的检测灵敏度进行比较，结 果如表3所示：
[0101] 使用本发明的引物对时，各自以femA、hilA和ipaH基因为目标检测基因的单 重PCR检测反应灵敏度均达到lpg/μL，均远高于现有技术的记载，表明本发明的引物对、 引物组及相应的检测方法能够获得较高的灵敏度，具备更好地满足食品安全国家标准的前 旦 -5^0
[0102] 表3检测用引物对及灵敏度
[0103]
[0104] 实施例2 :二重PCR反应体系及反应条件的建立
[0105] 1.二重PCR反应体系及反应条件的建立
[0106] 基于单重PCR检测的反应体系及反应条件，本发明对二重PCR检测中的各参数进 行了优化，确定了最佳的反应体系及反应条件。
[0107] 最佳二重PCR反应体系为（以25μL的PCR最终反应溶液计）：
[0109] 对于以金黄色葡萄球菌和沙门氏菌为检测目标的二重PCR反应，本实施例中采用 总共25μL的如下反应体系：
[0112] 其中，所述femA基因扩增用引物对为：
[0113] femA-F:AAGCACACAACAAGCGAGATAAC ;
[0114] femA-R:TTGATAAAGAAGAAACCAGCAGAG,
[0115] 所述hilA基因扩增用引物对为：
[0116] hilA-F ：TGAATTACGCTCACAACACCTG；
[0117] hi1A-R :TGCTAAGCAACCAGATTACGATG。
[0118] 对于以金黄色葡萄球菌和志贺氏菌为检测目标的二重PCR反应，本实施例中采用 总共25μL的如下反应体系：
[0119]
[0120] 其中，所述femA基因扩增用引物对为：
[0121] femA-F:AAGCACACAACAAGCGAGATAAC；
[0122] femA-R:TTGATAAAGAAGAAACCAGCAGAG,
[0123] 所述ipaH基因扩增用引物对为：
[0124] ipaH-F:CTCACATGGAACAATCTCCG ;
[0125] ipaH-R:TCATTCTCTTCACGGCTTCTG。
[0126] 对于以沙门氏菌和志贺氏菌为检测目标的二重PCR反应，本实施例中采用总共 25μL的如下反应体系：
[0127]
[0128] 其中，所述hilA基因扩增用引物对为：
[0129] hilA-F ：TGAATTACGCTCACAACACCTG；
[0130] hilA-R :TGCTAAGCAACCAGATTACGATG。
[0131] 所述ipaH基因扩增用引物对为：
[0132] ipaH-F:CTCACATGGAACAATCTCCG ;
[0133] ipaH-R:TCATTCTCTTCACGGCTTCTG。
[0134] 进行上述二重PCR反应的反应条件均为：
[0135] 95°C预变性2min ;94°C变性15s，55°C退火20s，72°C延伸30s，共进行35个循环； 72°C延伸7min。
[0136] 2.二重PCR检测中引物特异性的验证
[0137] 利用上述二重PCR反应体系及反应条件，通过正交反应多次试验，对15株购买的 标准菌株（如表2所示）进行二重PCR检测，结果表明：
[0138] 当将本发明筛选出的针对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌的引物对两两联 用时，可在同时含有所对应的菌株的基因组DNA的样品中扩增出相应的两个目的片段。该 结果表明，本发明筛选出的三组引物对两两联用时，各引物对可适用相同的反应条件、且彼 此间不会互相干扰，具备用于同时对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌中的多个目标 基因进行多重PCR检测的潜能。
[0139] 3.二重PCR检测中引物灵敏度的验证
[0140] 分别培养金黄色葡萄球菌CGMCC1.2465、沙门氏菌CICC21482及志贺氏菌 CGMCC1. 1868,抽提基因组DNA，用超微量分光光度计NanoDrop2000检测DNA浓度，进行10 倍梯度稀释，分别以2μL混合DNA(金黄色葡萄球菌、沙门氏菌以及志贺氏菌基因组DNA两 两等体积等浓度混合）作为模板进行PCR扩增，反应体系及反应条件如本实施例中"1.二 重PCR反应体系及反应条件的建立"所述；为更好地检测灵敏度，进一步补充了将金黄色 葡萄球菌、沙门氏菌以及志贺氏菌基因组DNA两两混合，各菌株体积均为1μL、浓度均为 100fg/yL的情况。
[0141] 对PCR产物进行电泳分析，结果如图2所示。
[0142] 图2A-图2C中，Μ表不100bp ladder Marker ;femA -130/hilA-430表不同时以 femA及hilA为目标检测基因的二重PCR检测；femA-130/ipaH-320表示同时以femA及 ipaH为目标检测基因的二重PCR检测；hilA-430/ipaH-320表示同时以hilA及ipaH为 目标检测基因的二重PCR检测；表示利用2μL浓度为lOOng/μL的阴性对照大肠杆菌 菌株CGMCC1. 3373的基因组DNA进行的相应的二重PCR检测；图2A中的" + "表示利用1μL 浓度为lOOng/μL的阳性对照金黄色葡萄球菌菌株CGMCC1. 2465的基因组DNA及1μL浓度 为lOOng/μL的阳性对照沙门氏菌菌株CICC21482的基因组DNA同时以femA及hilA为目 标检测基因的二重PCR检测；图2B中的" + "表示利用1μL浓度为lOOng/μL的阳性对照 金黄色葡萄球菌菌株CGMCC1. 2465的基因组DNA及1μL浓度为lOOng/μL的阳性对照志 贺氏菌菌株CGMCC1. 1868的基因组DNA同时以femA及ipaH为目标检测基因的二重PCR检 测；图2C中的" + "表示利用1μL浓度为lOOng/μL的阳性对照沙门氏菌菌株CICC21482的 基因组DNA及1μL浓度为lOOng/μL的阳性对照志贺氏菌菌株CGMCC1. 1868的基因组DNA 同时以hi1Α及ipaH为目标检测基因的二重PCR检测。从左至右，各泳道所标注的10ng、 lng、lOOpg、10pg、lpg及lOOfg分别表示：在25μL的PCR反应体系中，所加入的1μL金黄 色葡萄球菌基因组DNA以及lyL沙门氏菌基因组DNA的浓度分别为lOng/yLUng/yL、 lOOpg/μL、10pg/μL、lpg/μL及lOOfg/μL;或在 25μL的PCR反应体系中，所加入的 1μL 金黄色葡萄球菌基因组DNA以及lyL志贺氏菌基因组DNA的浓度分别为10ng/μL、lng/ μL、lOOpg/μL、10pg/μL、lpg/μL及lOOfg/μL;或在 25μL的PCR反应体系中，所加入 的1μL沙门氏菌基因组DNA以及1μL志贺氏菌基因组DNA的浓度分别为lOng/μL、lng/ μL、lOOpg/μL、10pg/μL、lpg/μL及lOOfg/μL。
[0143] 从图2中可以看出，同时以femA和hilA作为目标基因，对金黄色葡萄球菌和沙门 氏菌进行多重PCR检测的灵敏度达到lpg/μL;同时以femA和ipaH作为目标基因，对金黄 色葡萄球菌和志贺氏菌进行多重PCR检测的灵敏度达到lpg/yL;同时以hilA和ipaH作 为目标基因，对沙门氏菌和志贺氏菌进行多重PCR检测的灵敏度达到lpg/μL。
[0144] 可以看出，通过使用本发明的多重PCR检测用引物组进行上述二重PCR检测方法， 可以在基本不牺牲灵敏度的条件下，对不同种属的菌（金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺 氏菌）中的多个目标基因进行检测，即，提高了PCR检测的通量。
[0145] 实施例3 :三重PCR反应体系及反应条件的建立
[0146] 1.三重PCR反应体系及反应条件的建立
[0147] 基于单重和二重PCR检测的反应体系及反应条件，本发明对三重PCR检测中的各 参数进行了优化，确定了最佳的反应体系及反应条件。
[0148] 最佳三重PCR反应体系为（以25μL的PCR最终反应溶液计）：
[0149]
[0150] 其中，所述femA基因扩增用引物对为：
[0151] femA-F ：AAGCACACAACAAGCGAGATAAC；
[0152] femA-R：TTGATAAAGAAGAAACCAGCAGAG,
[0153] 所述hilA基因扩增用引物对为：
[0154] hilA-F ：TGAATTACGCTCACAACACCTG；
[0155] hilA-R：TGCTAAGCAACCAGATTACGATG,
[0156] 所述ipaH基因扩增用引物对为：
[0157] ipaH-F ：CTCACATGGAACAATCTCCG；
[0158] ipaH-R :TCATTCTCTTCACGGCTTCTG。
[0159] 在本实施例中，同时以金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌为检测目标的三重 PCR反应采用总共25 μ L的如下反应体系：
[0160]
[0161] 其中，所述femA基因扩增用引物对为：
[0162] femA-F:AAGCACACAACAAGCGAGATAAC ;
[0163] femA-R:TTGATAAAGAAGAAACCAGCAGAG,
[0164] 所述hilA基因扩增用引物对为：
[0165] hilA-F ：TGAATTACGCTCACAACACCTG；
[0166] hilA-R：TGCTAAGCAACCAGATTACGATG,
[0167] 所述ipaH基因扩增用引物对为：
[0168]ipaH-F:CTCACATGGAACAATCTCCG ;
[0169] ipaH_R:TCATTCTCTTCACGGCTTCTG。
[0170] 进行上述三重PCR反应的反应条件为：
[0171] 95°C预变性2min;94°C变性15s，55°C退火2