l):TSGCSTGCTTCGAYGCSATC，
[0041]下游引物IIPR6(SEQ ID No.2):TGGAANCCGCCGAABCCGCT;
[0042] 该对引物由Metsa-Ketela等设计，扩增基因片段如图2所示，引自文献"Metsa-Ketelaetal.,1999.AnefficientapproachforscreeningminimalPKSgenesfrom Streptomyces.FEMSMicrobiolLett·180，1-6·"。
[0043] PCR扩增体系具体为：10μ1TaqPremix，2μ1IIPF6(10yM)，2ylIIPR6(10yM)，lyl DMS0,0.5yl基因组DNA，4.5yldH20。
[0044] PCR扩增条件具体为:95°C变性5min; 95°C变性35s，55°C复性40s，72°C延伸lmin， 共30个循环;72°C延伸10min。
[0045] 检测方法具体为:PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后观察是否有约600bp的DNA条 带。
[0046] PCR产物纯化回收方法具体为:切胶回收目标DNA条带，使用Takara公司的Agarose GelDNAPurificationKit进行纯化。
[0047] 克隆方法具体为:使用Takara公司的T-A克隆试剂盒进行目标基因与T-载体的连 接，通过42°C热激45s转化E.coliDH5a感受态细胞，通过蓝白斑筛选阳性克隆。
[0048] 阳性克隆子的测序委托上海美吉生物医药科技有限公司进行。
[0049] 结果筛选得到了 17株芳香环聚酮合成潜力菌株Kocuriasp·S12，Micromonospora aurantiacaS97,NocardiaaraoensisSI07,NocardiopsisalbaS78,Nocardiopsis halotoleransS92,SaccharopolysporagloriosaS36,SalinisporaarenicolaS33, SalinisporapacificaS34,StreptomycesparvulusS10,StreptomycescarnosusS31, StreptomycesdjakartensisS39,StreptomycesluteosporeusS40,Streptomyces rocheiS41,StreptomycesanulatusS71,StreptomycesxiamenensisS72, StreptomycesdiastaticusS81,StreptomycesgriseorubensS86)。部分菌株的PCR电泳 图如图3所示。
[0050] 实施例2、通过对所述扩增产物读码的氨基酸序列进行比对、系统进化分析预测产 物化学型
[0051] 本实施例提供了对实施例1所述17株芳香环聚酮合成潜力菌株的18条酮合酶基因 氨基酸序列的系统进化分析。
[0052]结果如图4所示。其中3放线菌个菌株S·roche i S4 1、S·anul atus S7 1、 N.araoensis S107的酮合酶基因氨基酸序列聚在角蒽环类聚酮化合物簇，提示这三株放线 菌具有合成角蒽环类化合物的能力。
[0053]实施例3、发酵所述菌株并于发酵液提取物中寻找、鉴定所述化学型产物的步骤[0054]本实施例提供了对实施例2所述3株角蒽环聚酮合成潜力菌株的小量发酵和目标 化合物的寻找与鉴定的结果。
[0055] 1、所述放线菌菌株的小量摇瓶发酵和发酵液的有机溶剂提取
[0056]发酵条件具体为：250ml三角瓶中加入100mlGYM4培养基（10g葡萄糖，4g酵母浸 粉，4g麦芽浸粉，1L蒸馏水，pH7.2)，接种后置于摇床中，以120rpm的转速于28°C培养5天。 [0057]提取方法具体为:发酵液通过抽滤除去菌体，滤液加入等体积乙酸乙酯进行萃取， 通过旋蒸蒸发乙酸乙酯，加入甲醇溶解提取物。
[0058] 2、从小量发酵液提取物中寻找符合角蒽环类聚酮化合物紫外-可见吸收特征的信 号
[0059]如图 5所不（引自文献"Fengeta1 ·，20 11 ·Functiona1ana1ysisof environmentalDNA-derivedtypeIIpolyketidesynthasesrevealsstructurally diversesecondarymetabolites.ProcNatlAcadSciUSA. 108,12629-12634·"。），角蒽 环类化合物具有特征性的紫外-可见吸收曲线。本实施例中，一株链霉菌（即S.anulatus S71)的发酵液提取物中出现了特征性吸收信号，如图6所示。
[0060] 3、特征吸收化合物的鉴定
[0061]鉴定方法具体为:使用超高效液相色谱-四极杆飞行时间高分辨质谱仪获得特征 吸收化合物的高分辨率质谱，推测可能的分子式，用这些分子式到化合物数据库中比对已 知的角蒽环。本实施例中，一个相对高质荷比丰度的分子离子峰的可能分子式为C25H23〇9(如 图7所示），鉴于电离模式为正离子模式，用分子式C25H22〇9比对化合物数据库发现了一个角 蒽环化合物amycomycinB(如图8所示），该化合物的紫外-可见吸收峰(参考文献"Guoet al.,2012.Angucyclinesfromaninsect-derivedactinobacteriumAmycolatopsis sp.HCalandtheircytotoxicactivity.BioorgMedChemLett.22,7490_7493·"。）与特 征吸收化合物的基本一致，结合基因分析、质谱和紫外-可见吸收判断检测到的特征吸收化 合物为amycomycinB(图8)或者其结构类似物。
[0062]以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述 特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影 响本发明的实质内容。
【主权项】
1. 一种基因分析介导的芳香环聚酮化合物的寻找和鉴定方法，其特征在于，包括通过 对待测菌株π型聚酮酮合酶基因的扩增筛选具有芳香环聚酮合成潜力的菌株的步骤，通过 对所述扩增产物读码的氨基酸序列进行比对、系统进化分析预测产物化学型的步骤，发酵 所述菌株并于发酵液提取物中寻找、鉴定所述化学型产物的步骤。2. 根据权利要求1所述的基因分析介导的芳香环聚酮化合物的寻找和鉴定方法，其特 征在于，通过对Π型聚酮酮合酶基因的扩增筛选具有芳香环聚酮合成潜力的菌株的步骤 中，所述扩增具体对待测菌株基因组DNA的扩增。3. 根据权利要求2所述的基因分析介导的芳香环聚酮化合物的寻找和鉴定方法，其特 征在于，所述待测菌株基因组DNA的提取方法具体为： 收集菌株菌体，加入450μ1TE缓冲液，悬涡混匀；加入50μ1 1 %溶菌酶，混匀，37°C水浴 30min;加入50μ1 0.5MEDTA，50yl10%SDS，10yl0.1%蛋白酶K，55°C水浴60min;加入 1/2 体积7.5M乙酸铵，混匀；12000rpm离心20min，上清转移至新管;加入等体积异丙醇，-20°C沉 淀30min，12000rpm离心lOmin收集沉淀；加入70 %乙醇洗涤沉淀2次；吹干，溶于50μ1TE缓 冲液。4. 根据权利要求1或2所述的基因分析介导的芳香环聚酮化合物的寻找和鉴定方法，其 特征在于，所述扩增的引物对如SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示。5. 根据权利要求1所述的基因分析介导的芳香环聚酮化合物的寻找和鉴定方法，其特 征在于，通过对所述扩增产物读码的氨基酸序列进行比对、系统进化分析预测产物化学型 的步骤中，所述扩增产物为613bp的片段，所述读码序列为203个氨基酸。6. 根据权利要求1或5所述的基因分析介导的芳香环聚酮化合物的寻找和鉴定方法，其 特征在于，通过对所述扩增产物读码的氨基酸序列进行比对、系统进化分析预测产物化学 型的步骤中，所述比对、系统进化分析具体是将所述扩增产物与已知芳香环聚酮化合物产 生菌株的Π型聚酮酮合酶基因序列进行分析。7. 根据权利要求1所述的基因分析介导的芳香环聚酮化合物的寻找和鉴定方法，其特 征在于，发酵所述菌株并于发酵液提取物中寻找、鉴定所述化学型产物的步骤中，所述发酵 具体为:将所述菌株于120rpm、28°C条件下在GYM4培养基中培养5天。8. 根据权利要求1或7所述的基因分析介导的芳香环聚酮化合物的寻找和鉴定方法，其 特征在于，发酵所述菌株并于发酵液提取物中寻找、鉴定所述化学型产物的步骤中，所述寻 找具体为从发酵液提取物中寻找与所述预测产物化学型的紫外-可见光吸收特征相符的信 号。9. 根据权利要求1或7所述的基因分析介导的芳香环聚酮化合物的寻找和鉴定方法，其 特征在于，发酵所述菌株并于发酵液提取物中寻找、鉴定所述化学型产物的步骤中，所述提 取物的获得方法具体为:抽滤所述发酵液得滤液，向所述滤液中加入等体积乙酸乙酯萃取， 然后旋蒸蒸发去除乙酸乙酯，即得。10. 根据权利要求1或7所述的基因分析介导的芳香环聚酮化合物的寻找和鉴定方法， 其特征在于，发酵所述菌株并于发酵液提取物中寻找、鉴定所述化学型产物的步骤中，所述 鉴定具体为通过液相色谱联合高分辨率质谱推测寻找所得目标产物分子式，通过比对数据 库，判断其是否为已知化合物。
【专利摘要】本发明公开了一种基因分析介导的芳香环聚酮化合物的寻找和鉴定方法，包括通过对待测菌株Ⅱ型聚酮酮合酶基因的扩增筛选具有芳香环聚酮合成潜力的菌株的步骤；通过对所述扩增产物读码的氨基酸序列进行比对、系统进化分析预测产物化学型的步骤；发酵所述菌株并于发酵液提取物中寻找、鉴定所述化学型产物的步骤。与现有技术相比，该方法可用于从野生型放线菌菌株的代谢产物中定向发现芳香环聚酮类化合物。
【IPC分类】G01N30/02, G01N21/33, C12Q1/68
【公开号】CN105463078
【申请号】CN201510894975
【发明人】孙伟, 李志勇, 张风丽
【申请人】上海交通大学
【公开日】2016年4月6日
【申请日】2015年12月7日