蛇胆汁的鉴别方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医药领域，具体涉及一种蛇胆汁的鉴别方法。
【背景技术】
[0002] 蛇胆汁具有祛风镇惊、化痰止咳、清肝明目、消肿止痛的功效，用于风热惊痫、痰迷 痉搐、肺热咳嗽、痰多、目赤肿痛等症。目前，在医药领域使用的蛇胆汁主要取自眼镜蛇科、 游蛇科以及蝰蛇科这三科蛇的蛇胆，具体的，蛇胆应用于医药的蛇有3科共12种，即：眼镜蛇 科包括眼镜蛇Naja naja(Linnaeus)、金环蛇Bungarus fasciaius(Schneider)、银环蛇 Buragorus multicinctus Blyth、眼镜王虫它Ophiophagus hannan(Cantor);游虫它科包括三 索线蛇Elaphe radiata(Schlegel)、乌梢蛇Zaocys dhumnades(Cantor)、灰鼠蛇Ptyas korros(Schlegel)、滑鼠虫它Ptyas mucosus(Linnaeus)、王锦虫它Elapht carinata (Guenther);蜂蛇科包括蕲蛇Deinagkistrodon acutus(Guenther)、複蛇Agkistrodon halys(Pallas)、竹叶青Trimeresurus albolabris Gray。以上列举的12种蛇的胆汁可在多 种临床上被广泛应用于疑难杂症和急重病症等的治疗。
[0003] 由于蛇胆资源的缺乏，近年来市场上出现的蛇胆或蛇胆汁经检测或是伪品或是掺 杂，不仅无法实现预期的疗效，而且延误了患者的治疗，因此对蛇胆或蛇胆汁进行鉴别显得 尤为重要。但是，传统的较为便捷的蛇胆汁的鉴别方法主要依靠性状鉴定、薄层鉴别、以及 检查牛磺胆酸的含量，由于很多动物的胆汁与蛇胆汁所含的成分相似，如鸡胆汁、猪胆汁 等，因此采用上述传统的鉴定方法均难以达到准确鉴别蛇胆汁的目的。
[0004] 经查阅文献表明，现有技术中可以采用DNA分子鉴定技术对蛇肉进行准确的鉴别 (比如文献1.王义权，周开亚，徐珞珊等.中药材乌梢蛇及其混淆品的DNA序列分析鉴别.药 学学报，1999，34( 1): 67; 2.王义权，周开亚，徐珞珊等.金钱白花蛇及其伪品的Cyt b基因片 段序列分析和PCR鉴别研究.药学学报，1998，33(12): 941; 3.冯成强，唐晓晶，黄璐琦等.金 钱白花蛇及其混淆品高特异性PCR的鉴别.中国中药杂志，2006，31 (13): 1050; 4.宋文成，宋 社吾，刘道芳等.蕲蛇药材及其市售混淆品的Cytb基因序列与分析.中草药，2006，37(12): 1862)，但是这些文献公开的技术方案均是对单一品种蛇的蛇肉组织进行真伪鉴别，以确定 其来源的真伪。也就是说，现有技术中针对具体的每种蛇都需要采用特定的DNA鉴定方法对 其进行准确鉴定，这样无疑给鉴定工作增加难度，同时，蛇胆汁作为蛇的分泌物，目前尚未 有报道可以采用DNA分子鉴定方法进行准确鉴定。
[0005] 综上所述，现有技术中鉴定蛇胆药材的方法要么准确度低，要么鉴定方法的应用 范围窄、适用性差，因此，针对蛇胆药材建立一套操作简捷、结果准确可靠、且适用性强的鉴 定方法迫在眉睫，同时也具有重要的临床意义和实践意义。
[0006] 发明目的
[0007] 本发明的首要目的是提供一种操作简捷、结果准确可靠、且适用性强的蛇胆汁的 鉴别方法。
[0008] 为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案:一种蛇胆汁的鉴别方法，其步骤 如下：
[0009] a)提取待测蛇胆汁的DNA，并以该DNA为模板分别采用第一、第二及第三对引物进 行PCR扩增，得三组扩增产物，第一对引物Yanjing-F和Yanjing-R、第二对引物YouShe-F和 YouShe-R、第三对引物KuiShe-F、KuiShe-R的核苷酸序列分别如SEQIDN0.3-8所示；
[0010] b)将三组扩增产物分别进行凝胶电泳，当任意一组扩增产物的电泳图在300-400bp处有一条DNA条带，则该蛇胆为正品，反之则为伪品。
[0011] 本发明公开的鉴定方法即是根据正品药材特定区域的DNA序列（即特异性DNA片 段)设计有高度特异性的正品鉴别引物，即第一、第二、第三对引物，这三对引物分别是针对 眼镜蛇科、游蛇科、蝰蛇科的蛇胆进行真伪鉴定的特异性引物，具体来说，待测样的DNA经第 一对引物扩增后得到的扩增产物经电泳后，若其电泳图在300_400bp处有一条DNA条带，则 该蛇胆为眼镜蛇科正品；同样道理，若采用第二对引物扩增后产物的电泳图在相应位置出 现条带则为游蛇科正品;采用第三对引物扩增后产物的电泳图在相应位置出现条带则为蝰 蛇科正品，如果以上三种产物的电泳图在相应位置均未出现条带，则该待测样为伪品。
[0012] 实际上，Cytb基因是动物线粒体上一个编码蛋白质的基因，其具有一定的保守性， 研究结果表明Cytb基因的DNA片段在蛇的种内个体间的序列差异很小，而在种间的序列差 异却较大，因此该基因的DNA片段是用于鉴别物种的理想标记。具体的，如本申请的背景技 术部分内容所列举的文献资料中记载的，现有技术已知Cytb基因片段的DNA序列是鉴别蛇 类药材原动物种类的一种良好分子标记。但与之相比，本申请一方面是采用蛇类药材的分 泌物胆汁作为鉴定对象，另一方面分别采用三对引物即可对本发明的【背景技术】中所述的12 种蛇的蛇胆进行鉴定，鉴定方法方便、快捷，且适用性强。
[0013] 作为进一步的优选方案，提取的待测蛇胆汁的DNA先进行如下验证处理:采用通用 引物对该DNA进行PCR扩增，得产物I，将产物I进行凝胶电泳，当产物I的电泳图在300-400bp 处有一条DNA条带，则该DNA提取完整，可以进入后序的扩增鉴别，否则需重新提取，通用引 物Cytb-H和Cytb-L的核苷酸序列分别如SEQ ID NO. 1和2所示。对提取的DNA样品先进行验 证处理，这样可以大大提升鉴定结果的准确性，防止因 DNA提取误差影响鉴定结果的准确 度。
[0014] 进一步的，所述待测蛇胆汁的DNA提取步骤为：取待测蛇胆的胆汁0.5-1.5ml，在 12000rpm的条件下离心3-5min，然后用碱裂解法提取离心所得沉淀物中的DNA。具体的，碱 裂解法提取离心所得沉淀物中的DNA的具体步骤为：
[0015] 1)取沉淀物〇 · 03-0 · 15g，加入裂解液2 · OmL、1/10体积的浓度为100g/L的SDS、1/10 体积的浓度l〇〇yg/mL的蛋白酶K，混匀，在56°C水浴中保温2h，期间轻摇数次，至样品完全消 化，得消化液；
[0016] 2)将消化液用等体积的酚-氯仿-异戊醇抽提2次，加1/10体积的浓度为3M的NaAc、 2.1倍体积的无水乙醇进行沉淀，然后置-20 °C的冰箱中8-12h，在12000rpm的条件下离心 20min，离心所得的沉淀体用70 %乙醇洗涤2次，室温晾干，加入适量TE溶解DNA，置-20 °C的 环境中保存备用，所述酚-氯仿-异戊醇中酚、氯仿、异戊醇的体积比为25:24:1。
[0017] 申请人通过大量的试验研究表明，在采用上述碱裂解法提取目标DNA时，蛋白酶K 加入后2h内即可将沉淀物完全消化，时间非常短，有效缩短了 DNA的提取时间。另外，另发现 加入无水乙醇沉淀时，采用通常沉淀目标DNA的方法沉淀2-3h所获得的DNA模板量较少，优 选是加入无水乙醇后置于-20°C的冰箱中8-12h，这样所获得的DNA模板量显著增加，如图1 所示的电泳图，其中样品1和2是加入无水乙醇分别沉淀2h和8h的DNA模板含量的比较，样品 1的电泳图中明显出现一个条带区域，说明其生成的DNA模板量明显要多与样品2。不仅如 此，经试验证明，采用本发明公开的上述方法同样适用于蛇胆胆衣的鉴定，也就是说可以采 用本发明公开的上述方法对蛇胆的胆汁或胆衣进行DNA分子鉴定，从而判定蛇胆的真伪，而 具体选择蛇胆的胆衣进行鉴定时，只需将上述方法中收集的0.5-1.5ml胆汁更换为0.3-lg 胆衣即可，胆衣无需离心处理，其他条件不变。
[0018] 具体的，待测蛇胆汁的收集前需要先用双蒸水将蛇胆冲洗干净;所述步骤a的产物 I和步骤b的扩增产物均是取3-5μ1，经1.0%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，然后成像得到电泳 图。
[0019] 作为进一步的方案：步骤a中PCR扩增的反应液组成为:Taq酶预混液6-12μ1;上下 游引物各〇. 3-0.6μL?〇1; DN