小菜蛾对钠离子通道阻断剂靶标抗性的分子检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及小菜蛾对钠离子通道阻断剂靶标抗性的分 子检测方法，专用于小菜蛾对钠离子通道阻断类杀虫剂（Sodium Channel Blocking Insecticides，简称SCBIs，包括茚虫威和氰氟虫腙）靶标抗性的高灵敏度快速检测。 技术背景
[0002] 小菜蛾作为世界性十字花科蔬菜和油菜害虫，全球每年造成的损失和防治费用高 达40~50亿美元。十字花科蔬菜是世界各国食用蔬菜的主要来源，与人们日常生活息息 相关；油菜是各国重要的油料作物，事关食用油产量安全。20世纪80年代中后期以来，小 菜蛾在我国持续大面积暴发成灾，据统计近年来我国蔬菜种植面积接近3亿亩/年，已是世 界第一大蔬菜种植和生产国，因小菜蛾为害造成的蔬菜减产和治理费用极其高昂。在长期 的杀虫剂选择压力作用下，小菜蛾已对至少92种杀虫活性成分产生了不同程度的抗药性， 几乎涵盖了所有用于其防治的杀虫剂。我国田间小菜蛾抗药性发展速度极快，并导致蔬菜 农药残留超标严重威胁农产品质量安全，小菜蛾抗药性治理形势十分严峻。
[0003] 茚虫威是由美国杜邦公司20世纪末开发的第一个商品化的钠离子通道阻断型杀 虫剂，已在中国、澳大利亚、美国等多个国家作为优良的候选杀虫剂登记注册。茚虫威在昆 虫体内迅速转化为N-去甲氧碳基代谢物，它能更有效抑制电压门控钠通道进而阻断神经 冲动传导。经过十多年使用，一些地区种群对茚虫威的抗性逐渐显现，部分使用较多地区的 小菜蛾种群对其已产生极高水平抗性。氰氟虫腙是德国巴斯夫公司和日本农药公司联合开 发的一种全新的化合物，其不需要生物激活本身具有杀虫活性，也属于神经元钠离子通道 阻断剂。目前，昆虫中报道甜菜夜蛾对氰氟虫腙产生了较强的抗药性。茚虫威和氰氟虫腙 同属钠离子通道阻断类杀虫剂，而钠离子通道基因突变是导致抗性产生的最主要原因。
[0004] 至今，国内外尚未建立昆虫对SCBIs类杀虫剂抗性的分子检测方法，基于该靶标 基因的分子检测技术均集中在DDT和拟除虫菊酯类杀虫剂相关的突变位点。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是针对现有技术中小菜蛾对钠离子通道阻断类杀虫剂抗性检测方 法灵敏度低、周期长、材料要求高等问题，根据我们对小菜蛾SCBIs类杀虫剂抗药性机理的 研究，提供小菜蛾对钠离子通道阻断剂靶标抗性的分子检测方法。
[0006] 本发明的目的可通过以下技术方案实现：
[0007] -种小菜蛾对钠离子通道阻断剂抗性靶标的分子检测方法，所述的钠离子通道阻 断剂为茚虫威和氰氟虫腙，利用SEQ ID NO. 1所示的特异性正向引物F和SEQ ID N0. 2所 示的特异性反向引物R对小菜蛾基因组DNA模板进行PCR扩增，对PCR纯化产物直接测序， 根据测序色谱图鉴定小菜蛾个体钠离子通道编码1845和1848位氨基酸的核苷酸是否突变 及其具体类型，一次性区分出所述钠离子通道阻断剂抗性靶标的敏感纯合子、抗性杂合子 和抗性纯合子。
[0008] 本发明涉及的小菜蛾野生型钠离子通道基因 cDNA序列全长5850bp (GenBank登录 号为KM027335)，我们研究发现：敏感型序列R0TH-S第5534位核苷酸由T突变为A(附图 1 :SCBIs-R2，GenBank登录号为KM027337)，其编码的蛋白质由F突变为Y，将导致小菜蛾对 钠离子通道阻断剂茚虫威和氰氟虫腙产生抗性；敏感型序列R0TH-S第5542位核苷酸由G 突变为A(附图1 :SCBIs-Rl，GenBank登录号为KM027336)，其编码的蛋白质由V突变为I， 将导致小菜蛾对钠离子通道阻断剂茚虫威和氰氟虫腙产生抗性。
[0009] 所述的根据直接测序色谱图准确鉴定小菜蛾个体钠离子通道1845和1848位氨基 酸是否突变及其具体类型，一次性区分出两个位点敏感纯合子、抗性杂合子和抗性纯合子 的方法为：小菜蛾钠离子通道基因5534位碱基（即色谱图识别序列5' -CCTCATC-3'前一 位）为T单峰、5542位碱基（即色谱图识别序列5' -CCTCATCHV后一位）为G单峰，则 表明该小菜蛾个体为不携带钠离子通道突变的敏感纯合子；5534位碱基为T/A双峰、5542 位碱基为G单峰，则表明该小菜蛾个体为携带F1845Y氨基酸突变的杂合子；5534位碱基为 A单峰、5542位碱基为G单峰，则表明该小菜蛾个体为携带F1845Y氨基酸突变的纯合子； 5534位碱基为T单峰、5542位碱基为G/A双峰，则表明该小菜蛾个体为携带V1848I氨基酸 突变的杂合子；5534位碱基为T单峰、5542位碱基为A单峰，则表明该小菜蛾个体为携带 V1848I氨基酸突变的纯合子；5534位碱基为T/A双峰、5542位碱基为G/A双峰，则表明该 小菜蛾个体为同时携带F1845Y和V1848I氨基酸双突变的杂合子；5534位碱基为A单峰、 5542位碱基为A单峰，则表明该小菜蛾个体为同时携带F1845Y和V1848I氨基酸双突变的 纯合子。
[0010] 说明书中所述的F1845Y表示第1845位氨基酸发生由F到Y的突变，V1848I表示 第1848位氨基酸发生由V到I的突变。
[0011] 所述的分子检测方法，优选包含以下步骤：
[0012] (1)提取单头小菜蛾幼虫或成虫的基因组DNA ;
[0013] (2)利用SEQ ID NO. 1所示的特异性正向引物F和SEQ ID N0. 2所示的特异性反 向引物R，对上一步提取的小菜蛾基因组DNA进行PCR扩增；
[0014] (3)将上一步获得的PCR产物进行1. 5%的琼脂糖凝胶电泳，对目的片段纯化回收 后进行直接测序，测序引物为SEQ ID N0. 2所示的引物R，通过检测编码1845和1848位氨 基酸的核苷酸测序色谱图，一次性区分在这两个位点分别或同时携带所述钠离子通道阻断 剂抗性基因的个体。
[0015] 其中 PCR 反应体系 25ul :12. 5ul 2xGC Buffer I，1. 25U LA Taq DNA 聚合酶，lul 单头小菜蛾样本的基因组DNA，lul 10mM dNTPs，10mM的引物各lul，加双蒸水至反应总体 积为25ul ;PCR反应程序：94°C预变性3min，然后循环数为35 :94°C变性30s，47°C退火30s， 72°C 延伸 10min。
[0016] 用于分子检测小菜蛾对钠离子通道阻断剂靶标抗性的引物对，由SEQ ID NO. 1所 示的特异性正向引物F和SEQ ID NO. 2所示的特异性反向引物R组成。
[0017] -种用于检测小菜蛾对钠离子通道阻断剂靶标抗性的试剂盒，包含本发明所述的 引物对。
[0018] 本发明所述的引物对在分子检测小菜蛾对钠离子通道阻断剂靶标抗性中的应用。
[0019] 本发明所述的试剂盒对在分子检测小菜蛾对钠离子通道阻断剂靶标抗性中的应 用。
[0020] 有益效果
[0021] 发明人研究发现小菜蛾钠离子通道第4结构域第6跨膜片段的F1845Y和V1848I 突变与茚虫威和氰氟虫腙抗性相关，且在我国多个田间种群中可以检测到不同频率的等位 基因突变情况。本发明基于上述发现建立了小菜蛾对钠离子通道阻断剂抗性靶标的分子检 测方法。
[0022] 本发明与常规的生物测定技术相比，其优点和积极效果表现在：（1)快速准确：生 测技术需要采集试虫并繁殖到一定规模才可以进行检测，至少需要2周时间，本发明可直 接检测田间小菜蛾个体，从取得样本到获得检测结果在12个小时以内（若送公司测序也 仅需2天时间）；生物测定技术要求试虫标准化，取样误差和虫体之间的差异对结果影响很 大，造成结果的不稳定性。本技术由于采取了核苷酸测序策略，在可快速操作的基础上实现 了准确性的最强化。（2)材料要求少：生物测定技术中测定一个标准曲线至少需要200-300 头标准试虫，这些试虫的饲养需要花费一定的人力、物力。而本发明对一个种群的检测只 需要50头左右，即可判定种群中突变个体的基因型，计算出与抗性有关的等位基因突变频 率。（3)灵敏度高：生物测定检测