长 度多态性。
[0046] 下面通过对16种花生、8种甘蔗、11种玉米、9种马铃薯、16种菜心和4份真菌材 料的实施例对本发明做进一步详细说明，所举实例只是为了更好的理解本发明方法，并不 具有任何限制作用，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围，即在上述引物基础上按 照本发明的原理设计出来的引物均包含在本发明的技术方案的保护范围中。
[0047] 一种基于单引物扩增反应的DNA分子标记方法，包括以下步骤：
[0048] L材料准备
[0049] I. 1实验材料：本实例共选取了花生[1.冷水大麻壳、2.瑶上小麻壳、3.临 桂麻壳长腰、4.平乐子、5.荔浦番鬼豆、6.资源花生、7.全县番鬼豆、8.全州方壳子、 9.桂花 17、10·桂花 771、11·桂花 836、12.桂花 1026、13.A.moticola(PI468199)、 14.A.duranensis(PI262133)、15.A.duranensis(PI219823)、16.A.ipaensis(PI ?)]、甘 蔗（1.桂糖21号、2.新台糖22号、3.桂糖30号、4.桂糖31号、5.桂糖32号、6.桂糖34 号、7.桂糖35号、8.拔地拉）、玉米（1.正大619、2.兆丰788、3.桂单688、4.桂单591、 5.兆丰688、6.桂单08KK7.桂单589、8.云瑞88、9.玉美头105、10.南校9665U1.桂单 901)、马铃薯（1.中薯11号、2.中薯7号、3.中薯14号、4.费乌瑞它、5.中薯8号、6.冀张 薯8号、7.中薯13号、8.中薯6号、9.中薯17号）、菜心（1.特青60天粗条菜心、2.澳洲 008全年油绿甜菜心、3.澳洲超级608、4.香港45天油青甜菜心、5.名优308超冠甜菜心 王、6.澳洲 50短柄粗条菜心、7.桂柳十月柳叶菜心、8.菜兴利国际新一代碧绿油菜心49、 9.绿宝 701、10. 3-1 菜心、11. 3-6-1 菜心、12. 5-3 菜心、13. 5-4 菜心、14. 5-14 菜心、15. 6-6 菜心、16. 6-6-1菜心）和真菌（1.镰刀菌、2.毛霉、3.曲霉、4.白僵菌）六大种真核生物样 品来检测该分子标记方法中所使用的单引物的多态性和通用性。
[0050] 1. 2实验仪器：低温高速离心机、凝胶成像系统、PCR仪、水平电泳仪、-40°c冰箱、 紫外-可见光分光光度计、水浴锅、漩涡振荡器、移液枪。
[0051] 1.3实验试剂：〇^、1'1^-!1(^&!18.〇)4〇了六，0-巯基乙醇、似(：1、順，(3、1'1^8平 衡酷、氯仿、异戊醇、无水乙醇、琼脂糖、RNA酶、DNA Polymerase (大连宝生物工程有限公 司），dNTPs(上海生工生物工程有限公司），1XTAE。
[0052] 2.实验方法
[0053] 2. 1引物设计：所述的单引物是指一个PCR反应中只使用一条固定引物，这一条固 定引物同时充当正向引物和反向引物的角色，该固定引物是基于真核生物基因组中的基因 外显子区富含GC来设计的，引物序列长度17bp，5 '端的6个碱基填充序列为富含AT碱基的 限制性内切酶酶切位点序列，中间核心区序列是由8个碱基长短的GC碱基随机排列组成， 这14个碱基组成核心序列，最后3'端是3个随机添加的选择性碱基。本发明具体实施方 式中所选用的引物的序列、引物的GC含量和熔点温度Tm如表1所示：
[0054] 表1实施例中所有引物的序列
[0055]
[0056] 2.2引物合成：将待合成的引物序列发到上海生工生物工程有限公司进行合 成，合成后的粉末状引物先用离心机短暂离心，再用超纯水或TE溶液将其配成终浓度 10 μ mol/L，-20°c保存备用。
[0057] 2. 3DNA提取：其中16种花生材料、9种马铃薯材料和16种菜心材料的基因组DNA 采用下述方法提取，详细步骤如下：取新鲜花生嫩叶、马铃薯嫩叶和菜心嫩叶样品，每种取 0. 3-0. 5g，用剪刀剪碎，放入研钵中并在研钵中加入Ig的PVP，分多次倒入足量的液氮，将 叶片样品充分研磨成粉末状，将全部粉末样品转移到事先加入了 1.0 mlCTAB提取液且经过 65°C预热的2ml离心管中，再加入20 μ 1 β -巯基乙醇，于65 °C水浴锅中温浴60min，期间 上下颠倒混匀，以便DNA充分析出；然后在冷冻离心机中以转速为12000rpm离心10min后 除去底部残渣，吸取上清液到另外一支2ml离心管，并在上清液中加入0. 5 μ 1的RNaseA， 上下充分颠倒混匀，静置5min，加入与上清液等体积的氯仿抽提，上下充分颠倒混匀，静置 5min ;然后在冷冻离心机中以转速为12000rpm离心10min，吸取上清液并加入与上清液等 体积且事先在_40°C预冷的无水乙醇于_40°C冰箱中沉淀30min，用白色小枪头或牙签将沉 淀挑出来到新的I. 5ml离心管中，用75% vol乙醇洗涤沉淀一遍，再用600 μ I DEPC水充 分溶解沉淀，再加入600 μ I Tris平衡酚充分混匀抽提，静置5min，冷冻离心机中以转速为 12000rpm离心10min，取上清液并在上清液中加入与上清液等体积的事先预冷的无水乙醇 于-40°C冰箱中沉淀30min，再次用白色小枪头或牙签将白色沉淀挑出来到新的I. 5ml离心 管中，用75% vol乙醇洗涤沉淀一遍，短时间（5min以内）晾干后，用200 μ I DEPC水或TE 溶解沉淀。
[0058] 其中，8份甘蔗样品和11份玉米样品的基因组DNA采用下述方法提取，详细步骤 如下：取新鲜甘蔗嫩叶和玉米嫩叶样品每种0. 3-0. 5g，用剪刀剪碎，放入研钵中并加入Ig 的PVP，多次倒入足量的液氮，将叶片样品充分研磨成粉末状，将全部粉末样品转移到事先 加入了 1.0 ml CTAB提取液且经过65°C预热的2ml离心管中，并加入20 μ 1 β -巯基乙醇， 于65°C水浴锅中温浴60min，期间上下颠倒混匀，以便DNA充分析出，然后在冷冻离心机中 以转速为12000rpm离心10min后除去底部残渣，吸取上清液到新的2ml离心管并在上清液 中加入0. 5 μ 1的RNaseA，上下充分颠倒混匀，静置5min，加入与上清液等体积的氯仿抽提， 上下充分颠倒混匀，静置5min，冷冻离心机中以转速为12000rpm离心10min，吸取上清液并 再次加入与上清液等体积的氯仿抽提，冷冻离心机中以转速为12000rpm离心10min，吸取 上清液并加入与上清液等体积的事先在_40°C预冷的无水乙醇于_40°C冰箱中沉淀30min， 用白色小枪头或牙签将沉淀挑出来到新的I. 5ml离心管中，用75% vol乙醇洗绦沉淀一遍， 短时间（5min以内）晾干后，用200 μ I DEPC水或TE溶解沉淀。
[0059] 其中，4份真菌样品的基因组DNA采用下述方法提取，详细步骤如下：取一粒常温 保存的菌核放到加有硫酸链霉素的PDA培养基平板上，28°C培养两天，用口径5_的打孔器 打成菌饼，挑取两块菌饼接种到装有IOOmL PSB培养基（马铃薯200g，蔗糖20g，水1000 mL) 的三角瓶中，28°C培养3-5天，在产生菌核前收集菌丝体，用无菌水冲洗2次，无菌条件下风 干，再将干燥的新鲜菌丝体放入加有少许经灭菌的石英砂的研钵中，加入液氮后充分研磨， 充分研磨后转移到I. 5mL离心管中，加入事先在65°C预热的600 yL CTAB提取液，振荡混 匀后放入水浴锅中，65°C恒温水浴30min，每IOmin振荡混匀一次，接着将提取液在冷冻离 心机中以转速为12000rpm离心10min后取上清液转入另一支I. 5ml离心管中，加与上清液 等体积的氯仿/tri s饱和酚/异戊醇混合液[V (氯仿）：V (tris饱和酚）：V (异戊醇）= 24:24:1]充分摇匀，于冷冻离心机中以转速为12000r/min离心10min，取上清液移入另一 离心管中，加入上清液2. 5倍体积且经-30°C预冷的无水乙醇和上清液10%体积的3mol/ L NaAc溶液（pH 6. 0)沉淀，于冷冻离心机中以转速为12000r/min离心10min，弃上清液， 将沉淀用70% vol的酒精洗2~3次，晾干，加200 μ L TE (含lOmmol/L Tris-HCl，Immol/ L EDTA pH8. 0)缓冲液充分溶解后加入RNase于水浴锅中37°C恒温酶解lh。重复用氯仿/ Tris饱