一种用于检测人kras基因突变的试剂盒及其检测方法
【专利摘要】本发明涉及一种用于检测人KRAS基因突变的试剂盒及其检测方法，包括2对扩增引物和2条测序引物，本发明公开的检测KRAS基因突变的试剂盒完全基于一种新的实验方法设计，结构设计简单合理、使用方便；在检测KRAS基因突变时具有敏感性高、特异性强、耗时短等优点。
【专利说明】—种用于检测人KRAS基因突变的试剂盒及其检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种用于检测人KRAS基因突变的试剂盒及其检测方法，属于分子生物学领域。
【背景技术】
[0002]1)KRAS基因突变在结直肠癌中的临床意义
[0003]近年来，随着人民生活水平的不断提高，饮食习惯和饮食结构的改变以及人口老龄化，我国结直肠癌(colorectal cancer，CRC)的发病率和死亡率均保持上升趋势。其中，结肠癌的发病率上升尤为显著。大多数患者发现时已属于中晚期。结直肠癌发病率22.1万，死亡率11万，5年生存率63.7%。
[0004]KRAS是EGFR (表皮生长因子受体)信号传导通路中的一个关键的下游调节因子，参与细胞生长的调节，在癌变发生过程中起着重要作用。KRAS基因产物参与了控制基因转录的激酶信号传导路径，从而能调节细胞的生长与分化。KRAS基因的改变使KRAS蛋白发生变化，其结果KRAS蛋白不再具有裂解GTP分子和释放GTP分子的能力。这样的改变导致这条信号传导路径始终处于“开”通的状态。这种“开”的信号导致细胞的生长和增生。因此KRAS的过度表达与扩增导致持续的细胞增殖，这是肿瘤发生的关键一步。
[0005]西妥昔单抗和帕尼单抗是作用于EGFR的单克隆抗体，可以抑制下游的信号通路传导。2008年6月，美国临床肿瘤学会(ASCO)年会上CRYSTAL、OPUS等研究了西妥昔单抗联合F0LFIRI和FOLFOX作为转移性结直肠癌的初始治疗作用，结论为:KRAS野生型患者在加用西妥昔单抗治疗后PFS得到了显著改善。若KRAS有突变，则无论单药或联合均不应使用西妥昔单抗或帕尼单抗，因为不仅无效，还增加副反应，浪费金钱。
[0006]2008年10月，KRAS基因检测被写入《美国国立癌症综合网络(NCCN)结直肠癌临床实践指南》，专家组强烈推荐所有转移性结直肠癌患者均应进行KRAS基因型检测，原发灶或继发灶组织均可，对于KRAS野生型的患者可考虑进一步检测BRAF分型。
[0007]2010年版中国《结直肠癌诊疗规范》指出:完整的病理报告内容应该包括K-ras基因状态的检测，同时晚期/转移性结直肠癌靶向药物治疗前应检测KRAS。
[0008]2) KRAS基因突变在非小细胞肺癌NSCLC的临床意义
[0009]原发性肺癌(以下简称肺癌)是我国最常见的恶性肿瘤之一。2012年WHO统计显示，肺癌是我国目前发病率和死亡率第I位的恶性肿瘤。基于肺癌的生物学特性、治疗和预后，WHO将其分为两大类:非小细胞肺癌NSCLC和小细胞肺癌SCLC。其中NSCLC占肺癌的85%以上。虽然治疗肺癌技术有了很大的提高，但5年生存率没有明显改善，而且大多数肺癌患者死于无法控制的远处转移，传统的化疗和放疗由于缺乏特异性，取得疗效的同时也往往给患者带来较大的副作用。因此，选择肺癌细胞特异的分子靶点，应用针对该靶点的药物进行治疗，在取得明显疗效的同时又避免对正常细胞的伤害的治疗模式，已经被肿瘤学术界和广大患者所认同和采用。
[0010]EGFR (epidermal growth factor receptor,表皮生长因子受体)是目前用于NSCLC分子靶向治疗的最主要靶点。EGFR受体抑制剂TKI小分子酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor),通过阻断细胞受体的ATP结合位点，阻止下游信号传递而产生抑制肿瘤作用。
[0011]三种EGFR-TKI (吉非替尼/易瑞沙，厄罗替尼/特罗凯，和凯美钠)是目前用于NSCLC分子靶向治疗的主要药物，但在不同的病人中EGFR-TKI的疗效差异很大。大量临床实验发现，除了 EGFR突变，KRAS突变能帮助NSCLC病人更好的预测吉非替尼疗效；KRAS突变的NSCLC病人用厄洛替尼联合处理后临床预后较差。
[0012]2012年《美国国立癌症综合网络(NCCN)非小细胞肺癌临床实践指南》病理评估原则中明确=KRAS突变和内源性TKI耐药有关，确定KRAS基因状态有助于选择适合TKI治疗的病人。同时指出，KRAS基因状态是NSCLC生存的预后指标，也是EGFR-TKI药物的疗效预测指标。
【发明内容】
[0013]KRAS基因最常见的突变位点见于12、13、61密码子，这些突变可发生在许多人类肿瘤中。本发明解决上述技术问题提供一种用于检测人KRAS基因突变的试剂盒及其检测方法，本发明采用基于实时序列检测的焦磷酸测序(Pyro Mark KRAS v2.0)技术对上述突变进行检测和定量，本试剂盒在检测KRAS基因突变时具有敏感性高、特异性强、耗时短等优点。
[0014]本试剂盒包含2套PCR引物。一套能够扩增KARS基因外显子I，包含12、13密码子在内的片段，另一套能够扩增KARS基因外显子2，包含61密码子在内的片段。每套PCR引物中均有一条引物标记了生物素的引物，它能保证在测序反应中正确分离出待测DNA链。同时，该试剂盒还含有2条不同的测序引物，一条用于12、13密码子，另一条用于61密码子，它们用于后续的焦磷酸序列分 析中检测最常见的3个密码子突变(正常样品的分析序列如图1、2所示)。
[0015]本发明解决上述技术问题的技术方案如下:一种用于检测人KRAS基因突变的试剂盒，包括如下扩增引物和测序引物:
[0016]I)扩增引物:
[0017]KARS 密码子 12、13F:5' -AGGCCTGCTGAAAATGACTGAAT-3' (SEQ ID N0.1)；
[0018]KARS 密码 12、13R: 5' -GTTGGATCATATTCGTCCACAAA-3' (SEQ ID N0.2)，5'端生物素标记；
[0019]KARS 密码 61F:5' -CAGACTGTGTTTCTCCCTTCTCAGGATT-3' (SEQ ID N0.3)；
[0020]KARS 密码 6IR: 5' -AAGAAAGCCCTCCCCAGTCC-3' (SEQ ID N0.4)，5'端生物素标记；
[0021]2)测序引物:
[0022]KARS 密码子 12、13:5' -TTGGATATTCTCGACACAGCAGGT-3' (SEQ ID N0.5)，检测密码子12和13 ；
[0023]KARS 密码 61:5' -AAACTTGTGGTAGTTGGAGC-3' (SEQ ID N0.6),检测密码子 61。
[0024]其中，F:正向引物，R:反向引物。
[0025]试剂盒中的其他试剂及溶液为PCR和DNA焦磷酸测序的常规试剂。[0026]本发明还提供了一种应用上述的试剂盒检测人KRAS基因突变的方法，包括:
[0027]I)提取样本DNA (使用天根公司基因组DNA提取试剂盒，货号DP331)；
[0028]2) PCR 扩增:
[0029]配制50 μ I PCR 反应体系，包含:ddH2021 μ 1、2XTaq mix25 μ I (novoprotein 公司，产品货号:E005)、样本DNA2y 1、浓度为10 μ M的EGFR基因一对引物混合物2 μ 1，按照下面的循环参数设置循环仪:95°C
[0030]5min预变性；然后依次在95°C 30s,61°C 30s,72°C 30s，35个循环；再在72°C保持IOmin,最终保持在4°C，得到扩增产物；
[0031]其中，2XTaq mix包含:Taq DNA聚合酶、dNTP混合物、MgCl2以及反应缓冲液。
[0032]其中KRAS基因引物混合物含有正向引物和反向引物各I μ I ;
[0033]3)制备单链DNA模板；
[0034]4)利用Qiagen公司的焦磷酸测序仪Pyro Mark Q96ID对分离的模板进行序列分析。
[0035]本发明的有益效果是:
[0036]本发明公开的检测KRAS基因突变的试剂盒完全基于一种新的实验方法设计，结构设计简单合理、使用方便、分区设计使得检测过程不易受污染；
[0037]本试剂盒在检测KRAS基因突变时具有敏感性高、特异性强、耗时短等优点；
【专利附图】
【附图说明】
[0038]图1为本发明基因KARS12-13密码子正向测序原理图；
[0039]图2为本发明基因KARS61密码子正向测序原理图，密码子是CAA ；
[0040]图3为向Pyro Mark Q96ID的试剂槽中加入核苷酸、酶和底物的加样位置图；
[0041]图4为本发明基因KARS密码子12的位置2突变(GGT)，密码子13正常的焦磷酸测序结果图；
[0042]图5为本发明基因KARS密码子13的位置2突变(GGC)，密码子12正常的焦磷酸测序结果图；
[0043]图6为本发明基因KARS密码子12、13正常对照的焦磷酸测序结果图；
[0044]图7为本发明基因KARS密码子61正常对照的焦磷酸测序结果图；
[0045]附图中，各标号所代表的部件列表如下:
[0046]FP:正向引物；FPB:生物素标记的正向引物；RP:反向引物；RPB:生物素标记的反向引物；Seq:测序引物。
[0047]G:dGTP, C:dCTP, T:dTTP, S:Substrate Mixture (底物)，A:dATPaS, EiEnzymeMixture (酶)。
【具体实施方式】
[0048]以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
[0049]实施例1
[0050]I)扩增引物:[0051]KARS 密码子 12、13F:5' -AGGCCTGCTGAAAATGACTGAAT-3' (SEQ ID N0.1)；
[0052]KARS 密码子 12、13R: 5' -GTTGGATCATATTCGTCCACAAA-3' (SEQ ID N0.2)，5'端生物素标记；
[0053]KARS 密码子 6IF:5' -CAGACTGTGTTTCTCCCTTCTCAGGATT-3' (SEQ ID N0.3)；
[0054]KARS 密码子 6IR: 5' -AAGAAAGCCCTCCCCAGTCC-3' (SEQ ID N0.4)，5'端生物素标记；
[0055]2)测序引物:
[0056]KARS 密码子 12、13:5' -TTGGATATTCTCGACACAGCAGGT-3' (SEQ ID N0.5)；
[0057]KARS 密码子 61:5' -AAACTTGTGGTAGTTGGAGC-3' (SEQ ID N0.6) 10
[0058]一、提取样本DNA:
[0059]1.样本处理
[0060]a.石腊切片:取石腊切片(5-10 μ m厚，I X Icm2大小)5-8张。
[0061]b.石蜡块:手术刀刮取约30mg的组织样本(尽量去除多余的石蜡)。
[0062]注意:如果样品表面暴露于空气中，最初刮取的2-3片弃掉不用。
[0063]c.福尔马林等固定液中的样本:取30mg样本，用手术刀切为数块，置于1.5ml离心管中，
[0064]加入500 μ I PBS(10mM,pH7.4)涡旋振荡混匀，12，OOOrpm (-13, 400 Xg)室温离心Imin,重复2次，然后从步骤7开始操作。
[0065]2.将石蜡切片或石蜡块样本装于1.5ml无菌离心管中，加入Iml 二甲苯，剧烈涡旋1Osec0
[0066]3.12, OOOrpm(-13, 400 Xg)室温离心2min，弃上清。注意:不要倒掉沉淀。
[0067]4.在上述管中加入Iml无水乙醇，涡旋混匀lOsec。
[0068]5.12，000rpm(-13, 400Xg)室温离心2min,弃上清。注意:不要倒掉沉淀。
[0069]6.室温放置5-10min,充分挥发乙醇。
[0070]7.加入200 μ I缓冲液GA和20 μ I Proteinase K，充分混匀，56°C孵育Ih直至样本完全裂解。
[0071]8.置于 90°C孵育 Ih。
[0072]9.(可选步骤)如果要去除RNA，可以将样品中加入2μ I RNase A (100mg/ml)，室温孵2min后,进行下一步操作。
[0073]10.在上管中加入220 μ I缓冲液GB涡旋混匀，再加入250 μ I无水乙醇，涡旋震荡充分混匀，短暂离心使管壁上的溶液收集到管底。
[0074]11.将上一步所得的混合液加入一个吸附柱CR2中8，OOOrpm (_6，OOOXg)室温离心2min，倒掉废液，重新将吸附柱放回收集管中。注意:吸附柱最大容量为700 μ 1，可将剩余液体重复上述步骤上柱。
[0075]12.向吸附柱CR2中加入500μ I缓冲液⑶，8，OOOrpm (-6，OOOXg)室温离心60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。
[0076]13.向吸附柱CR2中加入600μ I漂洗液PW，8，000rpm (_6，000Xg)室温离心60sec，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中。
[0077]14.重复操作步骤13。[0078]15.将吸附柱CR2放回收集管中，12，000rpm(-13，400Xg)离心2min，倒掉废液。将吸附柱开盖置于室温放置2-5min，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。注意:乙醇残留会抑制后续的酶反应，所以晾干时要确保乙醇挥发干净。但也不要干燥太长时间，以免难以洗脱DNA。
[0079]16.将吸附柱CR2转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加65°C预热的30-100 μ I洗脱缓冲液TE或ddH20洗脱，室温放置2_5min，12，OOOrpm(-13, 400 X g)离心2min，将收集有DNA的离心管_20°C保存。注意:洗脱缓冲液体积不应少于30 μ 1，体积过小影响回收效率。为增加基因组DNA的得率，可将离心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室温放置2min，12，OOOrpm (-13, 400 Xg)离心2min。洗脱液的pH对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5范围内，pH值低于7.0会降低洗脱效率；且DNA产物应保存在_20°C，以防DNA降解。
[0080]二、PCR 扩增:
[0081]若要分析KRAS基因的12、13和61密码子突变，每个样品必须分别作2个PCR反应，一个用于扩增含12、13密码子的区域，另一个用于扩增含61密码子的区域。在后续的焦磷酸测序分析时，相应的每个样品也需要做2个反应体系，一个用于分析含12、13密码子的片段，另一个用于分析含61密码子的区域。但上述2个体系的分析可同时在一次测序程序中实现。
[0082]1、操作前注意事项
[0083]1.1在专门的DNA制备或PCR产物分析的区制备反应体系；
[0084]1.2使用带有滤芯的一 次性枪头避免交叉污染；
[0085]1.3打开含PCR引物的离心管前，先进行短暂的离心使引物聚集在离心管底部；
[0086]1.4将2套PCR引物分别溶于消毒后的高纯水中，IOuM浓度。
[0087]2、步骤
[0088]2.1解冻的2x Master PCR Mix, ddH20和引物(Primer)。上述试剂使用前须充分混合，避免试剂中盐在局部沉积。
[0089]2.2按照表1配制反应体系:
[0090]表1PCR配制反应体系
[0091]
2XTaq mix25ul
ddH2021μ I~
DNA(50ng)~2νΛ
引物混合物(10 μ Μ)~2μ1 ~
Total50 μ I
[0092]2.3用移液器轻轻上下抽吸主要混合物使之充分混合，并适当分布于PCR离心管中。
[0093]2.4每个PCR离心管中加入50ng样本DNA。[0094]2.5使用加热盖子的PCR仪时，不加矿物油，直接进入第6步。否则，需要加约100 μ I的矿物油覆盖。
[0095]2.6按照表2设置循环仪。
[0096]表2PCR反应条件
【权利要求】
1.一种用于检测人KRAS基因突变的试剂盒，其特征在于，包括如下扩增引物和测序引物: 1)扩增引物: KARS 密码子 12、13F: 5'-AGGCCTGCTGAAAATGACTGAAT-3'； KARS 密码子 12、13R:5'-GTTGGATCATATTCGTCCACAAA-3',5'端生物素标记； KARS 密码子 6IF: 5'-CAGACTGTGTTTCTCCCTTCTCAGGATT-3'； KARS 密码子 6IR:5'-AAGAAAGCCCTCCCCAGTCC-3' ,5'端生物素标记； 2)测序引物: KARS 密码子 12、13:5'-TTGGATATTCTCGACACAGCAGGT-3'； KARS 密码子 61:5'-AAACTTGTGGTAGTTGGAGC-3'。
2.一种应用如权利要求1所述的试剂盒检测人KRAS基因突变的方法，其特征在于，包括: 1)提取样本DNA； 2)PCR扩增: 配制50 μ I PCR反应体系，包含:ddH2021 y l、2XTaq mix25 μ 1、样本DNA2 μ 1、浓度为10μ M的EGFR基因一对引物混合物2 μ 1，按照下面的循环参数设置循环仪:95°C 5min预变性；然后依次在95°C 30s,61°C 30s, 72°C 30s，35个循环；再在72°C保持lOmin，最终保持在4°C，得到扩增产物； 其中KRAS基因引物混合物含有正向引物和反向引物各Iy I ； 3)制备单链DNA模板； 4)利用焦磷酸测序设备对分离的模板进行序列分析。
【文档编号】C12Q1/68GK103468808SQ201310422027
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年9月16日 优先权日:2013年9月16日
【发明者】王彤, 陈大方 申请人:瑞希基因科技（北京）股份有限公司