一种新型两亲性离子型多肽及其在细胞培养方面的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种新型两亲性离子型多肽。具有如下序列DFEFKDFEFKYRGD(F为苯丙氨酸，DF为D构型的苯丙氨酸，E为谷氨酸，K为赖氨酸，Y为酪氨酸，R为精氨酸，G为甘氨酸，D为天冬氨酸)的多肽化合物。实验表明两亲性多肽能在中性介质中快速形成小分子水凝胶。通过实验验证，表明该类水凝胶形成的三维纳米结构更接近于细胞生长的真实环境，非常适合细胞的三维培养。
【专利说明】—种新型两亲性离子型多肽及其在细胞培养方面的应用【技术领域】
[0001]本发明属于自组装领域，特别涉及一种能在中性条件性自组装的小分子水凝胶多肽及其在细胞培养方面的应用。
【背景技术】
[0002]自二十世纪九十年代以来，多肽通过非共价键自组装形成的小分子水凝胶由于良好的生物相容性，低毒性，生物可降解等优点已经发展成一种新型的极佳生物材料。小分子水凝胶在细胞培养、组织工程、伤口愈合、再生医学及药物载体等方面取得了广泛应用。小分子水凝胶的成胶方法包括调节pH和温度，改变离子强度，光催化，酶催化，水溶性有机溶剂辅助，超声等。其中改变离子强度，光催化，酶催化的成胶方法最为温和，生物相容性与其它方法比较相对较好。但是现有的光催化和酶催化方法在可控性，成胶前体分子的选择方面有更多的要求，因此通过改变离子强度的方法是目前来说最理想的成胶方法。但是现在已有的通过改变离子强度成胶的多肽分子中，大部分都是在酸性条件下成胶，这就限制了它的应用，而且即使能在细胞培养，伤口愈合等方面应用，体系也相对复杂。因此能够在中性条件或者模拟人体环境下成胶的多肽分子的探索尤为重要。
【发明内容】
[0003]本发明的内容在于提供一种新型的，通过改变离子强度能在中性条件下形成小分子水凝胶的两亲性多肽。
[0004]本发明把D构型氨基酸和L构型的氨基酸结合起来开发了一种新型的成胶分子，通过某个氨基酸构型的改变形成一种在中性条件下能稳定性存在的水凝胶。其主要原理是通过分子间非共价键的相互作用，D构型与L构型的氨基酸通过某些特定的空间排列形成纳米纤维相互缠绕的三维空间结构，本发明提供的短肽成分明确，多肽序列为dFEFKdFEFKYRGD(F为苯丙氨酸，dF为D构型的苯丙氨酸，E为谷氨酸，K为赖氨酸，Y为酪氨酸，R为精氨酸，G为甘氨酸，D为天冬氨酸)。
[0005]实验表明可以通过控制离子强度的大小改变所形成多肽dFEFKdFEFKYRGD的纳米结构和力学性能。此种多肽的在中性条件下，浓度大于或者等于0.15% (质量/体积)都可以形成水凝胶，形成的水凝胶大部分都是由水组成。
[0006]实验表明，本发明形成的多肽水凝胶形成均匀的纳米纤维结构，所形成的纳米纤维结构适合细胞的三维培养，本发明实例中培养的Hela(宫颈癌细胞)细胞形成集落结构，这种结构有别于二维培养的单分散伸展状态，而这种集落结构被认为更接近于细胞真实的三维生长环境。(Yamada,K.M., Cukierman,E.Modeling Tissue Morphogenesis and Cancerin3D.(2007) Cell, 130(4)，pp.601-610.)
[0007]所述新型小分子水凝胶的制备方法包含以下步骤:
[0008](I)固相合成序列为dFEFKdFEFKYRGD的多肽化合物。
[0009](2)使所述多肽以0.15%到5%的浓度(质量分数)溶于水性介质，再通过与高离子强度溶液混合增强离子强度诱导形成小分子水凝胶。
[0010](3)用浓度为I %的小分子水凝胶应用于Hela细胞的三维培养
[0011]本发明的有益效果是:
[0012]I提供了一种新型两亲性离子型自组装多肽，增加了自组装多肽领域的类型
[0013]2提供一种新型自组装多肽水凝胶材料，在中性条件下形成可注射的水凝胶，该类水凝胶合成简单，成胶条件温和，有非常广阔的应用前景。
[0014]3应用该类水凝胶培养癌细胞，提供非常接近于实际中细胞三维生长的环境，有利于体外肿瘤的生长。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1:多肽化合物的1HNMR谱图；
[0016]图2:多肽在PBS中形成的果冻状水凝胶；
[0017]图3:多肽在DMEM中形成的果冻状水凝胶；
[0018]图4:用透射电子显微镜观察小分子水凝胶的三维形貌结构；
[0019]图5:小分子水凝胶三维培养HeLa细胞死活染色照片；
[0020]图6:CCK-8测得的HeLa细胞在不同浓度多肽和不同时间的增值率。
【具体实施方式】
[0021]实施例1:多肽化合物(dF`EFKdFEFKYRGD)的合成
[0022]多肽化合物采用多肽固相合成法合成。使用2-氯三苯甲基氯树脂和相应的Fmoc (荷甲氧羰酰基)保护氨基，tert-butyl (叔丁基)、Pbf (2, 2,4,6, 7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基)或Boc (叔丁氧羰基)保护侧链的氨基酸。在树脂上的第一个从C-端氨基酸连接上之后，用含20%哌啶的无水N，N' - 二甲基甲酰胺，脱保护基团Fmoc。接着下一个Fmoc保护的氨基酸在HBTU(苯并三氮唑-N，N，N' ,N1-四甲基脲六氟磷酸酯)作为偶合试剂和DIEA(二异丙基乙胺)作为催化试剂的条件下被连接到游离的氨基上。根据固相合成技术的步骤增长肽链。最后一个氨基酸连接后，除去过量的试剂，用N，N' - 二甲基甲酰胺洗涤5分钟(5毫升每克树脂)，二氯甲烷洗涤5次，持续2分钟(5毫升每克树脂)。用95%的三氟乙酸，2.5%的三甲基硅烷和2.5%的水作用30分钟将合成的多肽从树脂上切下。用旋转蒸发除去三氟乙酸，再在溶液中加入冰乙醚(每克树脂20毫升)。所得沉淀物在4°C以1000Orpm下离心10分钟后，去上层清液，将得到的固体溶解在DMSO中，用含有
0.05%的三氟乙酸的甲醇和含甲醇5%的水作为洗脱剂进行HPLC(高效液相色谱)分离。
[0023]实施例2:小分子水凝胶的制备I
[0024]称取3.0mg多肽，加入双蒸水1000 μ L，使多肽在水中的浓度为0.3%，加四倍当量的碳酸氢钠调节PH值，此时形成粘稠透明液体。将上述溶液与等体积的2X PBS (磷酸盐缓冲液，成分)混合。最终多肽化合物的浓度为0.15%。
[0025]上述溶液静置立即成胶，最终形成透明均一的果冻状小分子水凝胶。
[0026]实施例3:小分子水凝胶的制备2
[0027]称取3.0mg多肽，加入双蒸水1000 μ L，使多肽在水中的浓度为0.3%，加四倍当量的碳酸氢钠调节PH值，此时形成粘稠透明液体。将上述溶液与等体积的DMEM培养基混合。最终多肽化合物的浓度为0.15%。
[0028]上述溶液静置立即成胶，最终形成透明均一的果冻状小分子水凝胶。
[0029]实施例4:小分子水凝胶的制备3
[0030]称取4.0mg多肽，加入双蒸水200 μ L，使多肽在水中的浓度为2 %，加四倍当量的碳酸氢钠调节PH值，此时形成粘稠透明液体。将上述溶液与等体积的2X PBS (磷酸盐缓冲液)混合。最终多肽化合物的浓度为I %。
[0031]上述溶液静置立即成胶，最终形成透明均一的果冻状小分子水凝胶(如图2)。
[0032]实施例5:小分子水凝胶的制备4
[0033]称取4.0mg多肽，加入双蒸水200 μ L，使多肽在水中的浓度为2%，加四倍当量的碳酸氢钠调节PH值，此时形成粘稠透明液体。将上述溶液与等体积的DMEM培养基混合。最终多肽化合物的浓度为1%。
[0034]上述溶液静置立即成胶，最终形成透明均一的果冻状小分子水凝胶(如图3)。
[0035]实施例6:小分子水凝胶的制备5
[0036]称取20.0mg多肽，加入双蒸水200 μ L，使多肽在水中的浓度为10%，加四倍当量的碳酸氢钠调节PH值，此时形成粘稠透明液体。将上述溶液与等体积的2X PBS (磷酸盐缓冲液)混合。最终多肽化合物的浓度为5%。
[0037]上述溶液静置立即成胶，最终形成透明均一的果冻状小分子水凝胶。
[0038]实施例7:小分子水凝胶`的制备6
[0039]称取4.0mg多肽，加入双蒸水200 μ L，使多肽在水中的浓度为10%，加四倍当量的碳酸氢钠调节PH值，此时形成粘稠透明液体。将上述溶液与等体积的DMEM培养基混合。最终多肽化合物的浓度为5%。
[0040]上述溶液静置立即成胶，最终形成透明均一的果冻状小分子水凝胶。
[0041]实施例8:小分子水凝胶的三维结构
[0042]上述多肽形成的水凝胶通过透射电子显微镜观察其三维形貌
[0043]称取4.0mg多肽，加入双蒸水200 μ L，用碳酸氢钠小心调节pH至7.4，形成粘稠液体。与等体积2X PBS混合均匀，静置成胶(时间)。
[0044]用移液枪吸取大约15 μ L左右的水凝胶滴加到表面干净的铜网上，用氮气处理使其均匀，于干燥器中静置干燥在透射电子显微镜下观察其结构(如图4)。其形貌为网状的纳米纤维结构。
[0045]实施例9:小分子水凝胶应用于细胞的三维培养
[0046]将含有2%多肽的双蒸水与等体积的含3Χ106个/mL HeLa (实验用增殖表皮癌细胞)细胞的完全培养基混合，将细胞混悬液向九十六孔板中每孔加50 μ L，静置成胶。最终多肽化合物的浓度为I %，细胞密度为1.5Χ106个/mL。放入37摄氏度恒温培养箱(5% CO2)培养。对培养1、3、5、7天的癌细胞进行死活染色(如图5)，得到结果表明癌细胞在上述水凝胶中成活率极高，且不扩散生长，形成细胞集落。
[0047]实施例10 =HeLa细胞在小分子水凝胶中增值率的测定
[0048]将含有0.6%、1%、2%多肽的双蒸水与等体积的含3乂106个/1^ HeLa(实验用增殖表皮癌细胞)细胞的完全培养基混合，将细胞混悬液向九十六孔板中每孔加50 μ L，静置成胶。最终多肽化合物的浓度为0.3^^0.5^^1 %、细胞密度为1.5Χ106个/mL。放入37摄氏度恒温培养箱(5% CO2)培养。在1、3、5、7天取出细胞，用不含血清的DMED洗涤后，向每孔加入100 μ LlO % (体积/体积)的CCK-B (2-(2-甲氧基-4-硝基苯基-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐)。将九十六孔板放入37摄氏度恒温培养箱(5%C02)4小时。取出，用酶标仪(MultiskaniMark，Bio-Rad，USA)测定其在450nm出的吸收值。重复上述实验五次并将结果取平均值得到实验结果(如图6) 。
【权利要求】
1.一种新型两亲性离子型多肽，其特征在于它的氨基酸序列为dFEFKdFEFKYRGD。
2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，氨基酸序列中I位和4位的氨基酸为D构型的苯丙氨酸。
3.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，能够自组装形成纳米结构。
4.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，具有D、L构型的中性疏水氨基酸及间隔的正、负电荷氨基酸，并含有RGD序列。
5.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，溶于水性介质。加入高强度的离子溶液，能够自组装成小分子水凝胶。
6.如权利要求1所述两亲性多肽在细胞培养中的应用。
7.权利要求1-6中任一项所述制备方法得到的一种新型两亲性离子型多肽及其在细胞培养方面的应用。`
【文档编号】C12N5/09GK103509088SQ201310421701
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2013年9月13日 优先权日:2013年9月13日
【发明者】杨志谋, 王玲, 冯赵骞琦, 史洋 申请人:南开大学