采用固体罐发酵制备米曲霉乳糖酶发酵曲的方法
【专利摘要】本发明属于微生物发酵，特别是指一种采用固体罐发酵制备米曲霉乳糖酶发酵曲的方法。包括孢子悬液的制备、固体罐发酵、曲盘培养等工艺步骤，本发明解决了现有技术存在的发酵周期长、染菌率高等技术问题，具有发酵周期短、染菌率低、生产效率高等优点。
【专利说明】采用固体罐发酵制备米曲霉乳糖酶发酵曲的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物发酵，特别是指一种采用固体罐发酵制备米曲霉乳糖酶发酵曲的方法。
【背景技术】
[0002]乳糖酶(Lactase)是一类催化特殊类型的糖苷键——β _半乳糖苷类化合物中β-半乳糖苷键发生水解断裂的酶。乳糖酶能将乳糖水解为半乳糖和葡萄糖，并具有半乳糖苷的转移作用，在乳糖分子的半乳糖一侧连接1-4个半乳糖，生成低聚半乳糖。米曲霉(Aspergillus oryzae)产生的乳糖酶是高温乳糖酶,最适温度较高,一般在50°C以上,应用于生产中可有效防止杂菌污染，而且较耐热、耐酸，稳定性较高，不需要活化剂和稳定剂，并且反应速度快、时间短，酶的用量少。
[0003]根据发酵过程培养基质的不同，发酵方式分为固态发酵和液态发酵。固态发酵比较粗放，一般不需要严格的无菌培养。固态发酵的基质浓度高，所以发酵产量一般比液态发酵要高，而且后处理工艺简单，三废少。
[0004]米曲霉乳糖酶是胞外酶，既可以采用固态发酵，也可以采用液体深层发酵，固态发酵发酵成本低，分离提取方便，生产效率高。但与液态发酵相比，固态发酵的周期一般较长，难以实现纯种培养，而且是在没有或者几乎没有游离水的条件下进行发酵，其传质传热效率非常低。固态发酵受很多因素的限制，各项参数不易监测，而且很难保证每批次发酵条件一致，再现性差，是比液态发酵更为复杂的发酵过程。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种发酵周期短、染菌率低的采用固体罐发酵制备米曲霉乳糖酶发酵曲的方法。`
[0006]本发明的整体技术构思是:
[0007]采用固体罐发酵制备米曲霉乳糖酶发酵曲的方法，包括如下工艺步骤:
[0008]A、孢子悬液的制备
[0009]将米曲霉菌株经培养后制成浓度为I 一 5 X 107cfu/mL的孢子悬液；
[0010]B、固体罐发酵
[0011]将步骤A制备的孢子悬液接种至固体发酵培养基进行发酵，固体发酵培养基包括如下单位重量份的组分组成:
[0012]麸皮I ;水 0.8-1.1 ;乳糖 0.05-0.15 ； (NH4)2SO40.005-0.015 ；MgS040.00 2-0.008 ；KH2PO40.005-0.01，聚丙二醇 0.0008-0.0012 ；
[0013]发酵温度为28-32 °C，湿度为45-75%，压力为0.03-0.05MPa,空气流量为1.0-2.0mVmin,每间隔4_8小时间歇搅拌5_15分钟，搅拌转速15-30转/分；培养24-36小时；
[0014]C、曲盘培养[0015]当步骤B中基质菌丝体覆盖率达到90%以上，出料转至曲盘培养；曲盘培养至乳糖酶酶活不再提高或提高缓慢时结束培养；
[0016]所述的米曲霉菌株选用米曲霉(Aspergillus oryzae),保藏编号为ATCC66222。
[0017]本发明的具体技术解决方案还有:
[0018]孢子悬液的制备应属于常规技术范畴，其中较为优选的技术方案是:所述的步骤A包括如下工艺步骤:
[0019]Al、将米曲霉菌株转接入查氏培养基上，在温度为28 - 32°C条件下培养3_5天；
[0020]A2、将步骤Al中培养的菌株转接麸曲培养基，在温度为28 — 32°C条件下培养3_5天;
[0021]A3、用无菌水洗涤步骤A2制备的菌丝体，然后用脱脂棉过滤，滤液转入灭菌后的种子罐中，加入无菌水调整孢子浓度，制成孢子悬液。
[0022]为保证固体发酵罐过程的顺利进行，接种过程优选的技术方案如下，所述的步骤B中的接种步骤中工艺条件如下:
[0023]开启搅拌，转速为15-30转/分，将步骤A中制备的孢子悬液按照孢子悬液:麸皮的质量比为1%_8%的接种量接种至灭菌后的固体发酵培养基中，继续搅拌5-15分钟。
[0024]曲盘培养中优选的培养条件是:步骤C中曲盘培养的温度为28_32°C，湿度为45-75%，麸曲厚度l_4cm，培养时间为48-60小时。
[0025]步骤Al中培养优选采用霉菌培养箱。
[0026]步骤A2中麸曲培养基采用麸皮:水的质量比=1:0.8-1.1配制。
[0027]本发明所取得的实质性特点和显著技术进步在于:
[0028]本发明前期采用了固体罐发酵，生产条件可根据需要调控，菌体生长速度快，发酵周期短，并且由于是原位灭菌，有效控制了杂菌污染，染菌率控制在1%以内，提高了生产效率，采用本发明所生产的乳糖酶酶活最高可达320U/g。
【具体实施方式】
[0029]以下结合实施例对本发明做进一步描述，但不作为对本发明的限定，本发明的保护范围以权利要求记载的内容为准，任何依据说明书做出的等效技术手段替换，均不脱离本发明的保护范畴。
[0030]实施例1
[0031]采用固体罐发酵制备米曲霉乳糖酶发酵曲的方法，包括如下工艺步骤:
[0032]A、孢子悬液的制备
[0033]将米曲霉菌株经培养后制成浓度为I 一 5 X 107cfu/mL的孢子悬液；
[0034]B、固体罐发酵
[0035]将步骤A制备的孢子悬液接种至固体发酵培养基进行发酵，固体发酵培养基包括如下单位重量份的组分组成:
[0036]麸皮I ;水 0.8 ;乳糖 0.05 ； (NH4) 2S040.005 ；MgS040.002 ；KH2PO40.005，聚丙二醇0.0008 ；
[0037]发酵温度为28°C，湿度为45%，压力为0.03MPa，空气流量为1.0-2.0m3/min，每间隔4小时间歇搅拌5分钟，搅拌转速15转/分；培养24-36小时；[0038]C、曲盘培养
[0039]当步骤B中基质菌丝体覆盖率达到90%以上，出料转至曲盘培养；曲盘培养至乳糖酶酶活不再提高或提高缓慢时结束培养；
[0040]所述的米曲霉菌株选用米曲霉(Aspergillus oryzae),保藏编号为ATCC66222。
[0041]所述的步骤A包括如下工艺步骤:
[0042]Al、将米曲霉菌株转接入查氏培养基上，在温度为28 - 32°C条件下培养3_5天；
[0043]A2、将步骤Al中培养的菌株转接麸曲培养基，在温度为28 — 32°C条件下培养3_5天;
[0044]A3、用无菌水洗涤步骤A2制备的菌丝体，然后用脱脂棉过滤，滤液转入灭菌后的种子罐中，加入无菌水调整孢子浓度，制成孢子悬液。
[0045]所述的步骤B中的接种步骤中工艺条件如下:
[0046]开启搅拌，转速为15转/分，将步骤A中制备的孢`子悬液按照孢子悬液:麸皮的质量比为1%_8%的接种量接种至灭菌后的固体发酵培养基中，继续搅拌5分钟。
[0047]曲盘培养中优选的培养条件是:步骤C中曲盘培养的温度为28_32°C，湿度为45-75%，麸曲厚度l_4cm，培养时间为48-60小时。
[0048]步骤Al中培养优选采用霉菌培养箱。
[0049]步骤A2中麸曲培养基采用麸皮:水的质量比=1:0.8配制。
[0050]所制备的米曲霉乳糖酶酶活为265U/g。
[0051]实施例2
[0052]采用固体罐发酵制备米曲霉乳糖酶发酵曲的方法，包括如下工艺步骤:
[0053]A、孢子悬液的制备
[0054]将米曲霉菌株经培养后制成浓度为I 一 5 X 107cfu/mL的孢子悬液；
[0055]B、固体罐发酵
[0056]将步骤A制备的孢子悬液接种至固体发酵培养基进行发酵，固体发酵培养基包括如下单位重量份的组分组成:
[0057]麸皮I ;水 1.1 ;乳糖 0.15 ； (NH4)2SO40.015 ；MgS040.008 ；KH2PO40.01，聚丙二醇
0.0012 ；
[0058]发酵温度为32°C，湿度为75%，压力为0.05MPa，空气流量为1.0-2.0m3/min，每间隔8小时间歇搅拌15分钟，搅拌转速30转/分；培养24-36小时；
[0059]C、曲盘培养
[0060]当步骤B中基质菌丝体覆盖率达到90%以上，出料转至曲盘培养；曲盘培养至乳糖酶酶活不再提高或提高缓慢时结束培养；
[0061]所述的米曲霉菌株选用米曲霉(Aspergillus oryzae),保藏编号为ATCC66222。
[0062]步骤A2中麸曲培养基采用麸皮:水的质量比=1:1.1配制。
[0063]其余内容同实施例1。
[0064]所制备的米曲霉乳糖酶酶活为286U/g。
[0065]实施例3
[0066]采用固体罐发酵制备米曲霉乳糖酶发酵曲的方法，包括如下工艺步骤:
[0067]A、孢子悬液的制备[0068]将米曲霉菌株经培养后制成浓度为I 一 5 X 107cfu/mL的孢子悬液；
[0069]B、固体罐发酵
[0070]将步骤A制备的孢子悬液接种至固体发酵培养基进行发酵，固体发酵培养基包括如下单位重量份的组分组成:
[0071]麸皮I ;水 I ;乳糖 0.1 ; (NH4) 2S040.01 ；MgS040.00 5 ；KH2PO40.0075，聚丙二醇0.001 ；
[0072]发酵温度为30°C，湿度为50%，压力为0.035MPa，空气流量为1.0-2.0m3/min，每间隔6小时间歇搅拌10分钟，搅拌转速20转/分；培养24-36小时；
[0073]C、曲盘培养
[0074]当步骤B中基质菌丝体覆盖率达到90%以上，出料转至曲盘培养；曲盘培养至乳糖酶酶活不再提高或提高缓慢时结束培养；
[0075]所述的米曲霉菌株选用米曲霉(Aspergillus oryzae),保藏编号为ATCC66222。
[0076]步骤A2中麸曲培养基采用麸皮:水的质量比=1:1配制。
[0077]其余内容同实施例1。
[0078]所制备的米曲霉乳糖酶酶活为320U/g。
[0079]实施例4
[0080]采用固体罐发酵制备米曲霉乳糖酶发酵曲的方法，包括如下工艺步骤:
[0081]A、孢子悬液的制备
[0082]将米曲霉菌株经培养后制成浓度为I 一 5 X 107cfu/mL的孢子悬液；
[0083]B、固体罐发酵
[0084]将步骤A制备的孢子悬液接种至固体发酵培养基进行发酵，固体发酵培养基包括如下单位重量份的组分组成:
[0085]麸皮I ;水 I ;乳糖 0.12 ; (NH4) 2S040.01 ；MgS040.006 ；KH2PO40.008，聚丙二醇
0.001 ；
[0086]发酵温度为28-32 °C，湿度为45_75%，压力为0.03-0.05MPa,空气流量为
1.0-2.0mVmin,每间隔4_8小时间歇搅拌5_15分钟，搅拌转速15-30转/分；培养24-36小时；
[0087]C、曲盘培养
[0088]当步骤B中基质菌丝体覆盖率达到90%以上，出料转至曲盘培养；曲盘培养至乳糖酶酶活不再提高或提高缓慢时结束培养；
[0089]所述的米曲霉菌株选用米曲霉(Aspergillus oryzae),保藏编号为ATCC66222。
[0090]孢子悬液的制备应属于常规技术范畴，其中较为优选的技术方案是:所述的步骤A包括如下工艺步骤:
[0091]Al、将米曲霉菌株转接入查氏培养基上，在温度为28 - 32°C条件下培养3_5天；
[0092]A2、将步骤Al中培养的菌株转接麸曲培养基，在温度为28 — 32°C条件下培养3_5天;
[0093]A3、用无菌水洗涤步骤A2制备的菌丝体，然后用脱脂棉过滤，滤液转入灭菌后的种子罐中，加入无菌水调整孢子浓度，制成孢子悬液。
[0094]步骤A2中麸曲培养基采用麸皮:水的质量比=1:0.8配制。其余内容同实施例1。[0095]所制备的米曲霉乳糖酶酶活为304U/g。
[0096]实施例5
[0097]采用固体罐发酵制备米曲霉乳糖酶发酵曲的方法，包括如下工艺步骤:
[0098]A、孢子悬液的制备
[0099]将米曲霉菌株经培养后制成浓度为I 一 5 X 107cfu/mL的孢子悬液；
[0100]B、固体罐发酵
[0101]将步骤A制备的孢子悬液接种至固体发酵培养基进行发酵，固体发酵培养基包括如下单位重量份的组分组成:
[0102]麸皮I ;水 1.1 ;乳糖 0.15 ； (NH4)2SO40.01 ；MgS040.0026 ;ΚΗ2Ρ040.008，聚丙二醇0.001 ；
[0103]发酵温度为30°C，湿度为60%，压力为0.05MPa，空气流量为1.0-2.0m3/min，每间隔6小时间歇搅拌10分钟，搅拌转速25转/分；培养24-36小时；
[0104]C、曲盘培养
[0105]当步骤B中基质菌丝体覆盖率达到90%以上，出料转至曲盘培养；曲盘培养至乳糖酶酶活不再提高或提高缓慢时结束培养；
[0106]所述的米曲霉菌株选用米曲霉(Aspergillus oryzae),保藏编号为ATCC66222。
[0107]步骤A2中麸曲培养基采用麸皮:水的质量比=1:1.1配制。
[0108]其余内容同实施例1。
[0109]所制备的米曲霉乳糖酶酶活为312U/g。
【权利要求】
1.采用固体罐发酵制备米曲霉乳糖酶发酵曲的方法，其特征在于包括如下工艺步骤: A、孢子悬液的制备 将米曲霉菌株经培养后制成浓度为I 一 5X107cfu/mL的孢子悬液； B、固体罐发酵 将步骤A制备的孢子悬液接种至固体发酵培养基进行发酵，固体发酵培养基包括如下单位重量份的组分组成:
麸皮1 ;水 0.8-1.1 ;乳糖 0.05-0.15 ； (NH4) 2S040.00 5-0.0 1 5 ；MgS040.00 2-0.008 ；KH2PO40.005-0.01，聚丙二醇 0.0008-0.0012 ； 发酵温度为28-32°C，湿度为45-75%，压力为0.03-0.05MPa,空气流量为1.0-2.0m3/分，每间隔4-8小时间歇搅拌5-15分钟，搅拌转速15-30转/分；培养24-36小时； C、曲盘培养 当步骤B中基质菌丝体覆盖率达到90%以上，出料转至曲盘培养；曲盘培养至乳糖酶酶活不再提高或提高缓慢时结束培养； 所述的米曲霉菌株选用米曲霉ATCC66222。
2.根据权利要求1所述的采用固体罐发酵制备米曲霉乳糖酶发酵曲的方法，其特征在于所述的步骤A包括如下工艺步骤: Al、将米曲霉菌株转接入查氏 培养基上，在温度为28 - 32°C条件下培养3-5天； A2、将步骤Al中培养的菌株转接麸曲培养基，在温度为28 - 32°C条件下培养3_5天； A3、用无菌水洗涤步骤A2制备的菌丝体，然后用脱脂棉过滤，滤液转入灭菌后的种子罐中，加入无菌水调整孢子浓度，制成孢子悬液。
3.根据权利要求1所述的采用固体罐发酵制备米曲霉乳糖酶发酵曲的方法，其特征在于所述的步骤B中的接种步骤中工艺条件如下: 开启搅拌，转速为15-30转/分，将步骤A中制备的孢子悬液按照孢子悬液:麸皮的质量比为1%_8%的接种量接种至灭菌后的固体发酵培养基中，继续搅拌5-15分钟。
4.根据权利要求1所述的采用固体罐发酵制备米曲霉乳糖酶发酵曲的方法，其特征在于所述的步骤C中曲盘培养的温度为28-32°C，湿度为45-75%，麸曲厚度l_4cm，培养时间为48-60小时。
5.根据权利要求2所述的采用固体罐发酵制备米曲霉乳糖酶发酵液的方法，其特征在于所述的步骤Al中培养采用霉菌培养箱。
6.根据权利要求2所述的采用固体罐发酵制备米曲霉乳糖酶发酵曲的方法，其特征在于所述的步骤A2中麸曲培养基采用麸皮:水的质量比=1:0.8-1.1配制。
【文档编号】C12R1/69GK103555692SQ201310519860
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年10月29日 优先权日:2013年10月29日
【发明者】赵从波, 章淑艳, 马清河, 李宾, 王云鹏, 李军, 韩韬, 罗同阳, 秦艳梅, 刘丽娜 申请人:河北省微生物研究所