提高微藻细胞含糖量的培养方法
【专利摘要】本发明提供一种提高微藻细胞含糖量的培养方法，所述提高微藻细胞含糖量的培养方法至少包括：1）第一段培养，以微藻细胞接种在培养基上，在25?30℃，CO2 占混合气体体积百分比为1%?5%和50?200 μmol photons m?2 s?1，光暗循环（12?24/12?0小时）、通气量0.1?0.6 vvm条件下培养2?3天；2）第二段培养，将第一段培养后的微藻细胞接种在培养基上，在25?30℃，光暗循环（12?24/12?0小时）、通气量0.1?0.6 vvm条件下培养3?5天。采用本发明可以显著的提高微藻细胞的含糖量。
【专利说明】
提高微藻细胞含糖量的培养方法
技术领域
[0001] 本发明设及一种提高微藻细胞含糖量的培养方法，属于生物领域。
【背景技术】
[0002] 能源与国民经济W及社会发展息息相关。我国的能源需求随经济发展在逐年增 加，但能源利用结构主要还是W化石能源为主。大量的化石能源使用造成了严重的环境问 题。开发低碳能源W及控制碳排放、开发C〇2的重固定技术已成为人类社会亟待解决的问 题。微藻是典型的固碳生物。通过光合作用固定C〇2,再转化为生物质[1'2^。微藻生物质含有 大量的糖、油脂和蛋白质，大量的科学研究聚焦于提高微藻的油脂含量，W微藻为原材料的 生物柴油已经取得一定进展，但是微藻生物柴油的生产成本还是过高。
[0003] 藻类的光合作用首先产生的是碳水化合物。相关研究表明：在微藻的生长周期前 期细胞能源积累主要是W糖类为主，后期藻细胞将糖类物质转换成油脂类储存[3]。微藻的 糖类W淀粉为主，可W用来发酵生产多种燃料醇，是很好的生物能源生产原料。因此，利用 微藻固碳并调控其细胞大量积累糖类物质不仅能够重固定大气中的C〇2,而且能够生物能 源开发提供原材料，在环境治理上一举两得。
[0004] 培养基中氮源或憐源胁迫、高C〇2浓度和培养环境条件(溫度、光照、培养方式等） 都将影响藻类代谢。Solovchenko A等研究了无碳源的BGll培养基在空气和高浓度C〇2下链 带藻的生长情况，发现高浓度C〇2能够使藻细胞中糖类含量增加，细胞碳组分提高氮组分降 低，碳氮比显著增加。Li等研究了 7%C02和模拟烟道气环境下特殊栅藻的细胞组分，发现其 总糖含量达到了细胞干重的60% W上。Ho研究了两段培养法对栅藻糖积累的影响，第一段 在营养丰富的培养环境进行生物量积累后转移到氮匿乏环境，藻细胞碳水化合物的积累增 加，需要指出的是该两段法中藻细胞由第一段转入第二段中没有经过稀释。Sun等研究了氮 浓度、较低光照强度W及金属离子浓度发现其对藻油脂积累有很大影响。研究结果显示藻 类的碳水化合物积累W葡萄糖成分为主。
【发明内容】
[0005] 鉴于W上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种提高微藻细胞含糖量 的培养方法，可W提高微藻细胞的含糖量。
[0006] 为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种提高微藻细胞含糖量的培养方 法，所述
[0007] 提高微藻细胞含糖量的培养方法至少包括：
[000引1)第一段培养，W微藻细胞接种在培养基上，接种密度为0.02-0.05g/L，在25-30 °C，C02占混合气体的体积百分比为1-5%和50-200皿01 photons Hf2S-I,光暗循环（12-24/ 12-0小时）、通气量0.1 -0.6vvm条件下培养2-3天；
[0009] 2)第二段培养，将第一段培养后的微藻细胞接种在培养基上，在25-3(TC ,500- 1000皿〇1 photons Hf2S-I,光暗循环（12-24/12-0小时）、通气量0.1-0.6vvm条件下培养培 养3-5天。
[0010] 为了进一步优化设计方案，所述第二段培养中微藻细胞的C〇2的含量为5-30% (体 积比）。
[0011] 为了进一步优化设计方案，所述第二段培养中C〇2的体积占混合气体的体积百分 比为2-30%。
[0012] 为了进一步优化设计方案，所述第二段培养中C〇2的体积百分比含量为10%。
[0013] 为了进一步优化设计方案，所述第二段培养中微藻细胞接种密度为0.1~0.5g/L。
[0014] 为了进一步优化设计方案，所述第二段培养中微藻细胞接种密度为O.lg/L。
[0015] 为了进一步优化设计方案，所述第二段培养中光强为500-1000皿〇1 photons m- 2s_l。
[0016] 为了进一步优化设计方案，所述微藻细胞选自小球藻或者栅藻。
[0017] 为了进一步优化设计方案，所述第二段培养中采用的培养基中氮含量为第一段培 养采用的培养基的含氮量10-40%。
[0018] 为了进一步优化设计方案，所述第二段培养中采用的培养基中氮含量为第一段培 养采用的培养基的含氮量25%。
[0019] 为了进一步优化设计方案，所述第一段培养中采用培养基的含氮量为〇.12g/X- 0.48g/L〇
[0020] 如上所述，本发明的提高微藻细胞含糖量的培养方法，具有W下有益效果：
[0021] 通过控制培养微藻细胞培养条件，培养基的含氮量、0)2含量、接种密度、培养方 式、光照条件的改变提高微藻细胞的含糖量。
【附图说明】
[0022] 图1(a)显示为本发明实施例1中第1组实验中不同氮浓度下微藻细胞生长曲线(干 重)示意图。
[0023] 图1(b)显示为本发明实施例1中第1组实验中不同氮浓度下微藻细胞糖含量变化 示意图。
[0024] 图2(a)显示为本发明实施例1中第2组实验中不同C〇2浓度下微藻细胞生长曲线 (干重)示意图
[0025] 图2(b)显示为本发明实施例1中第2组实验中不同C〇2浓度下微藻细胞含糖量变化 示意图。
[0026] 图3(a)显示为本发明实施例1第3组实验中不同细胞接种浓度下微藻细胞生长曲 线(干重)示意图。
[0027] 图3(b)显示为本发明实施例1中第3组实验中不同细胞接种浓度下微藻细胞含糖 量变化示意图。
[0028] 图4(a)显示为本发明实施例1中第4组实验中不同光强下微藻细胞生长曲线（干 重)示意图。
[0029] 图4(b)显示为本发明实施例1中第4组实验中不同光强下微藻细胞含糖量变化示 意图。
【具体实施方式】
[0030] W下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书 所掲露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可W通过另外不同的具体实 施方式加W实施或应用，本说明书中的各项细节也可W基于不同观点与应用，在没有背离 本发明的精神下进行各种修饰或改变。
[0031] 在进一步描述本发明【具体实施方式】之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下 述特定的具体实施方案;还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体 实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中 另外明确指出，单数形式"一个"、"一"和"运个"包括复数形式。
[0032] 当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端 点W及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和 科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、 材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可W使用与本 发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实 现本发明。
[0033] 除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领 域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及 相关领域的常规技术。运些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等 MOLECULAR CL0NING:A LABORATORY MANUAL,Second edition,Cold Spring Harbor LaboratoiT Press，1989and !"Mrd edition,2001;Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,John Wiley&Sons,New York,1987and periodic updates；the series METHODS IN ENZYMOLOGY,Academic Press,San Diego；Wolffe,CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTIONJMrd edition ,Academic Press, San Diego ,1998 !METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.304，畑romatin。.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.),Academic Press，San Diego,1999;和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY'Vol.119,Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press,Totowa，1999等。
[0034] 实施例1
[0035] 利用实验室适应性进化得到的小球藻AEIO。该藻株能够在高浓度C〇2通气环境下 快速生长。培养基为BGll培养基。
[0036] 第一段培养：Wo. 02g/L接种，在28°C、占混合气体体积百分比为2 %C〇2和100皿〇1 photons 、光暗循环比（24小时/0小时）、通气量0.25vvm条件下培养3天，培养基中 NaN〇3 含量为 1.5g/L。
[0037] 第二段培养:得到的小球藻培养液经离屯、，去上清，沉淀培养基调整细胞密度后接 种，考察不同细胞接种密度、光强、0)2通气浓度、氮浓度的影响，实验条件见表1。其它实验 条件:培养溫度恒溫水浴28°C，白光LED，光暗循环比（24小时/0小时）、通气量0.25vvm条件 下培养5天。
[0038] 表1考察不同实验条件对细胞生长和糖含量的影响 E 广A。。I [(
[0041] 培养体系为约300ml。每组实验设置3个平行。
[0042] 培养过程中，每天取样进行干重和糖含量等数据测定。
[0043] 干重计算方法:取一定体积(V)的藻液，用预称重的0.45WI1的玻璃纤维过滤(Wl)， 烘干后再测定含藻滤纸的重量(W2)。另外考虑到烘滤纸的时间，烘箱的工作负荷，在干燥器 中降溫的时间W及操作环境的湿度，对实验结果有一定的影响，故至少选择=个滤纸做参 照，用W过滤去离子水，来衡量外界环境对测量过程的影响。故每次取样时，小球藻的生物 量干重计貸加下.
[0044]
[0045] 糖含量计算方法:取一定体积的藻液，利用苯酪硫酸法进行总糖含量的测定。具体 为:配置一定梯度浓度的葡糖糖标准溶液，取10化L的标准液，加入5 %苯酪溶液10化L，混匀 后迅速加入硫酸0.5血，每个梯度S个重复，震荡混匀，静止20min后取20化L于96孔板，bio- reader酶标仪波长490nm下读取OD值，并计算出糖浓度与0〇49日的标准曲线(R2需大于0.99)。 然后取一定体积(V，化)藻液，加入5 %苯酪溶液10化L，混匀后迅速加入硫酸0.5mL，每个实 验组S个重复，震荡混匀，静止20min后取20化L于96孔板，bio-reader酶标仪波长49化m下 读取OD值，将OD490带入标准曲线计算出相应的糖浓度，然后用该糖浓度Si，样品的糖浓度S 计算如下：
[0046] S = Sl+Vi/100
[0047] 实验结果如图1-4所示:在经过不同的调控之后，我们得到了小球藻AElO的高产糖 的最佳培养方式。发现氮浓度梯度影响糖含量最大，缺氮有利于产糖，第二段培养基的使用 的培养基氮含量为第一段培养使用的培养基的1/4是最佳的氮源培养条件。第二段培养中 10%C〇2有利于取得高含糖藻株，细胞接种密度中，O. Ig/L比0.5g/L和0.8g/L更能获得高生 物量和高含糖量。在其它条件不变的条件下，高光强有利于获得高含糖藻株。综合W上因 素，采用两段法培养，同时调整接种密度W及培养过程中C〇2的含量、光照条件可W有效的 提高微藻细胞的含糖量。
[004引实施例2
[0049]利用实验室适应性进化得到的小球藻AE20。该藻株能够在高浓度C〇2通气环境下 快速生长。培养基为BGll培养基。
[00加]一段式培养：W〇.〇5g/L接种，在30°C、5%C02和200皿〇1 photons nf2s-i、光暗循环 比（12小时/12小时）、通气量0.6vvm条件下培养5天，接种时培养基中NaN〇3浓度为1.5g/L;。 [0051] 两段式培养:第一段培养：W〇.〇5g/L接种，在30°C、5%C02和200皿〇1 photons Hf2s-i、光暗循环比（12小时/12小时）、通气量0.6vvm条件下培养前2天，接种时培养基中化N03 浓度为2.4g/L。。第二段培养:第一段得到的小球藻培养液经离屯、，去上清，沉淀培养基调整 细胞密度后Wo. 5g/L接种，光强500WHO 1/V/s; 30 % C〇2，通气量0.6vvm;氮浓度为原培养基 的10% (BGll培养基）。培养溫度恒溫水浴30°C，光暗循环比（12小时/12小时）、条件下培养3 天，接种时培养基中NaN〇3浓度为0.6g/L。
[0052] 培养体系为约300ml。每组实验设置3个平行。
[0053] 实验结果表明，一段式实验结束后，AE20含糖40.5%，两段式实验结束后，AE20含 糖 62.8%。
[0054] 实施例3
[0055] 本实验室分离纯化的一株栅藻。培养基为BGll培养基。
[0056] -段式培养：W〇.〇5g/L接种，在25°C、1%C02和 150皿〇1 地Otons m-2s-i、光暗循环 比（16小时/8小时）、通气量0.1 vvm条件下培养8天，接种时培养基中NaN〇3浓度为1.5g/L。 [0057] 两段式培养：第一段培养：W〇.05g/L接种，在25°C、1%C02和150皿〇1 photons Hf VI、光暗循环比（16小时/8小时）、通气量0.1 vvm条件下培养前3天，接种时培养基中化N03 浓度为0.6g/L。第二段培养:第一段得到的小球藻培养液经离屯、，去上清，沉淀培养基调整 细胞密度后Wo. 3g/L接种，光强SOOwnol/V/s; 10 % C〇2，通气量0.1 vvm;氮浓度为原培养基 的40% (BGll培养基）。培养溫度恒溫水浴25°C，光暗循环比（16小时/8小时)条件下培养5 天，接种时培养基中NaN〇3浓度为0.15g/L。
[005引培养体系为约300ml。每组实验设置3个平行。
[0059] 实验结果表明，一段式实验结束后，AE20含糖32.5%，两段式实验结束后，AE20含 糖 65.5%。
[0060] W上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制， 应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可W做出 若干改进和补充，运些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员， 在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用W上所掲示的技术内容而做出的些许更 动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对 上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围
【主权项】
1. 一种提高微藻细胞含糖量的培养方法，其特征在于，所述提高微藻细胞含糖量的培 养方法至少包括： 1) 第一段培养，以微藻细胞接种在培养基上，接种密度为0.02-0.05g/L，在25-30 °C，CO2 占混合气体的体积百分比为1-5 %和光强为50-200μηιο1 photons nf2S'光暗循环（12-24/ 12-0小时）、通气量0.1-0.6vvm条件下培养，培养2-3天； 2) 第二段培养，将第一段培养后的微藻细胞接种在培养基上，在25-30 °C，光暗循环 (12-24/12-0小时）、通气量0.1-0.6vvm条件下培养，培养3-5天。2. 根据权利要求1所述的提高微藻细胞含糖量的培养方法，其特征在于:所述第二段培 养中微藻细胞的CO2的体积占混合气体的体积百分比为2-30%。3. 根据权利要求2所述的提高微藻细胞含糖量的培养方法，其特征在于:所述第二段培 养中C〇2的体积百分比含量为10 %。4. 根据权利要求1所述的提高微藻细胞含糖量的培养方法，其特征在于:所述第二段培 养中微藻细胞接种密度为〇. 1~〇. 5g/L。5. 根据权利要求4所述的提高微藻细胞含糖量的培养方法，其特征在于:所述第二段培 养中微藻细胞接种密度为〇. I g/L。6. 根据权利要求1所述的提高微藻细胞含糖量的培养方法，其特征在于:所述第二段培 养中光强为500-1000ymol photons Jif2S-1O7. 根据权利要求1所述的提高微藻细胞含糖量的培养方法，其特征在于:所述微藻细胞 选自小球藻或者栅藻。8. 根据权利要求1所述的提高微藻细胞含糖量的培养方法，其特征在于:所述第二段培 养中采用的培养基中氮含量为第一段培养采用的培养基的含氮量10-40%。9. 根据权利要求8所述的提高微藻细胞含糖量的培养方法，其特征在于:所述第二段培 养中培养基的含氮量是原始培养基的25%。10. 根据权利要求1所述的提高微藻细胞含糖量的培养方法，其特征在于:所述第一段 培养中采用培养基的含氮量为〇. 12g/L-0.48g/L。
【文档编号】C12N1/12GK105925487SQ201610554225
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年7月14日
【发明人】程度佳, 李登进, 赵权宇, 汪靓, 孙予罕, 李晋平, 肖亚宁, 王东飞
【申请人】中国科学院上海高等研究院, 山西潞安矿业(集团)有限责任公司