一种绵羊卵母细胞体外成熟培养方法
【专利摘要】本发明属生物细胞【技术领域】，提供一种绵羊卵母细胞体外成熟的培养方法。本发明将绵羊卵母细胞体外成熟培养分为两步完成，总时长为30小时，具体方法是：1、配制含有IBMX和FSK的成熟培养液Ⅰ（IVMⅠ液）和含有Cilostamide的成熟培养液Ⅱ（IVMⅡ液）；2、在39℃、5%CO2及饱和湿度条件下，绵羊卵母细胞先在IVMⅠ液中体外培养2小时完成第1步成熟，然后移入IVMⅡ液中体外培养28小时完成第2步成熟。本发明利用IBMX、FSK和Cilostamide适当延迟绵羊卵母细胞的细胞核成熟进程，使其细胞核和细胞质成熟趋于同步，达到提高体外成熟绵羊卵母细胞胚胎发育能力的实际效果。
【专利说明】一种绵羊卵母细胞体外成熟培养方法
【技术领域】
[0001]本发明属生物细胞【技术领域】，具体涉及绵羊卵母细胞体外成熟的培养方法。
【背景技术】
[0002]卵母细胞体外成熟是哺乳动物体外受精、单精子显微注射、细胞核移植、转基因等胚胎生物技术的首要环节，是胚胎工程的一项关键技术。自从德国科学家Schenk于1878年首次证明卵母细胞在体外环境下可以成熟以来，许多学者对哺乳动物卵母细胞体外成熟培养进行了大量的研究。我国从20世纪80年代末开始对家畜卵母细胞体外成熟培养进行研究，取得较大进展，旭日干等将绵羊卵母细胞进行体外成熟培养并受精，经胚胎移植后获得后代。目前，绵羊卵母细胞体外成熟通常采用的培养时长为24小时，其技术改进主要集中在向成熟培养液中添加血清、生长因子、细胞因子或抗氧化物质等方面，如今卵母细胞经体外成熟能够发育至囊胚的比率为20%~30%，其胚胎发育能力尚有较大提升空间。 [0003]卵母细胞体外成熟包括细胞核成熟和细胞质成熟。卵母细胞体外成熟质量的高低是决定其随后发育能力的关键因素。体外成熟卵母细胞的胚胎发育能力低与卵母细胞的细胞核成熟与细胞质成熟不同步有关。在卵母细胞体外成熟过程中，由于卵母细胞脱离卵泡抑制环境，可自发恢复减数分裂，在较短的时间内即可达到细胞核成熟，但此时卵母细胞的细胞质却没能达到同步成熟。然而，这一问题并不能通过在卵母细胞达到核成熟后继续延长卵母细胞体外成熟时间的方法得到解决。因为卵母细胞一旦达到细胞核成熟，再延长卵母细胞成熟时间会导致其老化，不但不能提高卵母细胞的随后发育能力，反而会引起其随后发育力能力的降低。可见，发明一种新的卵母细胞体外成熟方法，适当延迟卵母细胞的核成熟进程，使细胞核和细胞质成熟趋于同步，必将有利于提高体外成熟卵母细胞的发育能力。
[0004]调控卵母细胞核成熟进程的关键因素是卵母细胞内环腺苷酸(cAMP)水平的变化。当卵母细胞内cAMP水平降低到某阈值之下，卵母细胞减数分裂恢复，启动细胞核成熟进程；而当卵母细胞内cAMP在一定时期内维持较高水平时，则可抑制卵母细胞减数分裂的恢复，从而延长细胞核成熟进程。可见，有效升高卵母细胞内cAMP水平是延长卵母细胞核成熟进程的关键。在卵母细胞体外成熟初期，紧密包裹卵母细胞的大量卵丘细胞可合成cAMP，并通过卵丘细胞绒毛嵌入卵母细胞内所形成的缝隙连接向卵母细胞输送cAMP，因此卵母细胞内cAMP水平的变化主要决定于卵丘细胞所合成cAMP的量。但随着成熟时间的延长，这种缝隙连接的强度会随着卵丘细胞的向外扩散而减弱，而使输入卵母细胞中的cAMP量减少，此时卵母细胞内cAMP水平的变化则主要取决于卵母细胞中cAMP的降解速率。cAMP的合成受腺苷酸环化酶(AC)的调控，而cAMP的降解则受磷酸二酯酶(PDE和TOE3)的控制。AC和PDE较广泛地分布于卵丘细胞中，PDE3则主要分布在卵母细胞内。毛喉素(FSK)能激活AC的活性使卵丘细胞合成cAMP的能力增加，3 —异丁基一 I 一甲基黄嘌呤(IBMX)则可抑制PDE的活性使卵丘细胞中cAMP的降解速度减慢，这两种物质的共同作用的结果是提高卵丘细胞中cAMP的含量；西洛酰胺(Cilostamide)为TOE3的特异性抑制剂，使卵母细胞内中cAMP的降解速度减慢，从而使卵母细胞在较长时间内维持较高水平的cAMP。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种绵羊卵母细胞体外成熟培养方法，通过利用FSK、IBMX和Cilostamide延长卵母细胞的细胞核成熟进程，使绵羊卵母细胞在体外成熟过程中的细胞核和细胞质成熟趋于同步，从而提高成熟卵母细胞的发育能力。
[0006]为实现上述目的，本发明由以下步骤组成:1、配制绵羊卵母细胞体外成熟培养基础液(IVM 基础液):1VM 基础液的配方为 TCM199 (液体)+10% FBS (v/v)+10 μ g/ml FSH+10μ g/ml LH +1 μ g/ml E2 +1 mmol/L L-谷氨酸胺+20 ng/ml EGF。
[0007]2、配制绵羊卵母细胞体外成熟培养液的I液(IVM I液)和II液(IVM II液):1VM I液的配方为IVM基础液+100 μ mol/L的IBMX+ 50~100 μ mol/L FSK ;IVM II液的配方为IVM 基础液+5 μ mol/L 的 Cilostamide。
[0008]3、绵羊卵母细胞的体外成熟:在39°C、5% CO2及饱和湿度条件下，分两步完成:绵羊卵母细胞先在IVM I液中体外成熟培养2小时，进行第I步成熟；然后再将卵母细胞转入IVM II液中体外成熟培养28小时，进行第2步成熟。
[0009]本发明与现有技术相比，具有以下特点:1、本发明分两步对绵羊卵母细胞进行体外成熟培养，即先在IVM I液中进行第一步体外成熟，然后再将卵母细胞转入IVM II液中进行第二步体外成熟，而现有技术为一步成熟；2、本发明的IVM I液和IVM II液由于含有IBMX、FSK和Cilostamide，因而具有延迟绵羊卵母细胞的细胞核成熟进程的特殊效果，而现有技术的成熟液无此 功效；3、本发明绵羊卵母细胞体外成熟培养的总时长为30小时，而现有技术为24小时；4、用本发明体外成熟绵羊卵母细胞的胚胎发育能力较现有技术可提闻39%左右。
【具体实施方式】
[0010]以下实施例用于说明本发明，但不用于限制本发明的使用范围，包括以下步骤:1、体外成熟培养液(IVM I液和IVM II液)配制:a、配制IVM基础液，在TCM199液中加入10%FBS (v/v) > 10 μ g/ml FSH、10 μ g/ml LH、1 μ g/ml E2、1 mmol/L L_ 谷氛酸胺和 20 ng/ml EGF ;b、配制IBMX、FSK和Cilostamide浓贮液，用二甲基亚砜(DMSO)分别溶解BMX、FSK和 Cilostamide,其浓度分别为 500 mmol/L、100 mmol/L和 20 mmol/L ;c、配制 IVM I 液，在IVM基础液中分别加入IBMX浓贮液及FSK浓贮液，使入IBMX和FSK浓度分别为100 μ mol/L和50~100 μ mol/L ;d、配制IVM II液，在IVM基础液中加入Cilostamide浓忙液，使Cilostamide 浓度为 5 μ mol/L。
[0011]2、卵巢采集及运输:从屠宰场采集绵羊卵巢，立即放入盛有30°C的0.9%生理盐水的保温瓶中(生理盐水中含100 IU/ml青霉素和100 IU/ml链霉素)，在2~4小时内运回实验室。
[0012]3、卵母细胞采集:用25°C生理盐水洗涤卵巢3次后，置于盛有25°C生理盐水的烧杯内，放在25°C的水浴锅内保温。用刀片划割或一次性注射器抽取卵巢上直径2飞mm的卵泡，在放有采卵液的培养皿洗涤2次，于显微镜下用口吸管将形态正常、胞质均匀、颗粒细胞不少于3层的COCs检出备用。采卵液配方为:TCM199+5 mmol/L NaHCO3+10 mmol/LHEPES+10 mmol/L HEPES-Na +0.01 g/L肝素钠+20 ml/L FBS +100 IU/ml 青霉素+100 IU/ml链霉素。
[0013]4、卵母细胞的体外成熟:COCs在IVM I液进行体外成熟培养2小时，然后转移至IVM II液中再进行体外成熟培养28小时。培养条件相同，均为39°C、5%C02和100%湿度。
[0014]5、体外受精:在每30 μ L受精液滴中放入15~20个体外成熟的卵子，再加入终浓度为I~3Χ IO6个/ml的获能精子，在39°C、5% CO2、饱和湿度条件下，精卵共孵育24小时。受精液配方为:SOF液+20%发情绵羊血清(v/v)+10 μ g/ml肝素钠。培养条件为39°C、5%C02和100%湿度。
[0015]6、胚胎体外发育:于受精24小时将假定受精卵移入胚胎发育液中，培养7天。培养条件为:39°C, 5% CO2,5 % CO2和90% N2,100%湿度。胚胎发育液配方为:S0F液+1% EAA+1%NEAA +10 ng/ml EGF +1 mmol/L L-谷氨酸胺+8 mg/ml BSA。
[0016]7、结果表明，采用本方法体外成熟绵羊卵母细胞的囊胚发育率可达到49.8~
51.6%，而现有技术为33.1%。
[0017]8、上文虽然已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽地描述，但在本发明基础上可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上 所做的修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【权利要求】
1.一种绵羊卵母细胞体外成熟培养方法，其特征在于所述培养方法分为两步完成:卵母细胞在IVM I液中进行第I步体外成熟培养2小时；将经过第I步成熟培养的卵母细胞再转移至IVM II液中进行第2步体外成熟培养28小时。
2.根据权利要求1所述的一种绵羊卵母细胞体外成熟培养方法，其特征在于IVMI液中包含IBMX和FSK及IVM II液中包含Cilostamide。
3.根据权利要求1一 2中任一项所述的IVM I液，其特征在于IVM I液配方组成:TCM199 + 10% FBS (v/v) + 10 μ g/ml FSH + 10 μ g/ml LH + I μ g/ml E2 + I mmol/LL-谷氨酰胺+ 20 ng/ml EGF + 100 μ mol/L IBMX + 50 ~100 μ mol/L FSK。
4.根据权利要求1一 2中任一项所述的IVM II液，其特征在于IVM II液配方组成:TCM199 + 10% FBS (v/v) + 10 μ g/ml FSH + 10 μ g/ml LH + I μ g/ml E2 + I mmol/LL-谷氨酸胺十 20 ng/ml EGF + 5 μ mol/L Cilostamide。
5.权利要求1一 4项中 任一项的技术应用。
【文档编号】C12N5/075GK103923878SQ201310014156
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2013年1月15日 优先权日:2013年1月15日
【发明者】田树军, 孙树春, 胡媛媛 申请人:河北农业大学