农杆菌介导的小对叶遗传转化方法

专利名称：：农杆菌介导的小对叶遗传转化方法
技术领域：
：本发明涉及一种农杆菌介导的小对叶遗传转化方法。
背景技术：
：小对叶0feco/7s历o//w'eW)是玄参科假马齿苋属多年生沉水草本植物，不仅具有较高的观赏价值，而且还兼有药用之功能。它的自然繁殖系数很低，采用常规方法很难形成规模化的生产。目前主要对小对叶采用组织培养方法，通过叶片进行增殖，在短期内得到大量试管苗，既填补了这一领域的空白，又具有一定的经济价值和药用价值。随着小对叶养殖规模的扩大，迫切需要培育出优良的新品系，以提高产量和品质。因此,培育出抗逆、优质的小对叶新品种成为亟需解决的问题。目前，基因工程方法是最有效、最快捷、最可靠的新品种培育方法。因此，利用基因工程技术研究小对叶的生物学特性，培育小对叶的新品种成为必然的发展方向。随着组织培养技术、基因重组技术的发展，植物转基因技术得到日益广泛的应用。这无论对于分子遗传学研究或是遗传改良都具有特别重要的意义。自从19S4年首次获得转基因烟草以来，植物遗传转化技术迅速发展，目前已经建立了多种遗传转化方法，如农杆菌介导法、基因枪法、原生质体法、脂质体法、花粉管通道法、电激转化法、PEG介导法、显微注射法等。其中根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)介导法是目前研究最多、理论机制最清楚、技术方法最成熟的遗传转化方法。在己获得的近200种转基因植物中约80%是由农杆菌介导法完成的。这一方法的遗传转化率受农杆菌菌株类型、浸染时间、共培养时间、外植体预培养时间等因素的影响。目前，根癌农杆菌介导法的小对叶遗传转化研究还未见报道。绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)是源于海洋生物多管水母属(AequoriaVictoria)的一种发光蛋白，能够自身催化形成生色团并在蓝光或紫外光激发下发出绿色荧光，能在活细胞内稳定表达。GFP的荧光反应不需要任何底物及辅助因子，使表达检测非常简单。同时，GFP在细胞中呈自主表达，没有细胞种类、位置和种属的特异性。GFP对受体细胞无毒性，对目的基因没有影响，因而可以很方便的对活体进行观察，来研究GFP基因的表达。由于GFP对光漂白、氧化剂、还原剂、酸、碱以及其它许多化学试剂具有极强的稳定性，因此，GFP可作为报告基因来监测转基因的表达、信号转导、蛋白运输与定位等。
发明内容本发明的目的是提供一种农杆菌介导的小对叶遗传转化方法。本发明所提供的一种农杆菌介导的小对叶遗传转化方法，包括如下步骤以小对叶的叶片为外植体，用处于对数生长期的、OD6。。值为0.4-0.6的目的农杆菌菌液侵染所述外植体5-10分钟；所述目的农杆菌菌液的OD柳值优选为0.5，所述侵染的时间优选为7分钟。所述方法中还包括在所述侵染之前，对外植体进行预培养的步骤，所述预培养的时间可为1-3天，优选为2天。所述方法中还包括在所述侵染之后进行共培养的步骤，所述共培养的时间可为4-6天，优选为4天。所述方法中还包括在所述共培养之后进行脱菌培养的步骤，所述脱菌培养中所用的培养基可含有450mg/L的头孢霉素。所述目的农杆菌含有潮霉素抗性基因。所述方法中在所述脱菌培养后还包括筛选培养的步骤，所述筛选培养的方法包括如下步骤将所述脱菌培养后的外植体转入含有10mg/L潮霉素的分化培养基中进行培养，分化得到芽。所述筛选培养方法中还包括如下步骤将所述分化得到的芽用含有9mg/L潮霉素的生根培养基进行培养。所述目的农杆菌菌液中可含有100mg/L乙酰丁香酮。所述共培养的培养基中也可含有100mg/L乙酰丁香酮。用本发明方法对小对叶进行遗传转化，得到的抗性芽率为7.5%，表明本方法转化效率高。本发明中以水生植物小对叶为实验材料，以报告基因——绿色荧光蛋白基因(greenfluorescentprotein,GFP)来检测外来基因能否在其中稳定和瞬间表达，为今后建立小对叶遗传转化系统，使外源基因在其中稳定表达奠定了基础，对小对叶的遗传改良有十分重要的意义。另外，绿色荧光蛋白基因的转入，还可以提高小对叶的观赏价值，既美化了环境，又为后续净化水体的研究奠定了基础。图1为头孢霉素Cef对小对叶愈伤组织诱导的影响。图2为卡那霉素对小对叶离体叶片绿芽分化的影响。图3为潮霉素对小对叶离体叶片绿芽分化的影响。图4为小对叶离体叶片分化率与抗生素浓度的回归关系。图5为转基因植株的总DNA提取。图6为GUS基因PCR扩增分析。图7为GFP基因PCR扩增分析。具体实施例方式下述实施例中主要化学试剂为-GUS基因和GFP基因引物由上海生工生物工程技术有限公司合成；rragDNApolymerase、IPTG、X-gal、dNTP(宝生物工程大连有限公司)；琼脂糖(Promega公司)；卡那霉素(Ka画ycin，Km)(Amresco公司)；潮霄素(Hygromycin，Hy)(Roche公司)；壮观霉素(Spectacularadriamycin)(Sigma公司)；氯霉素(Chloramphenicol)(Amresco公司)；组织培养及其它所用化学试剂均为国产或进口分析纯。下述实施例中主要仪器设备为-低温冷冻离心机(BECKMANALLegra21R，美国)；紫外分光光度仪(UNICAMHE入I0S，英国)；PCR扩增仪(PTC-100,MJRearch，美国);紫外检测仪(STS—20.WM);凝胶成像分析系统(DC120EDASKODAK,美国)；电泳仪(IIOO—型，DYY-A型，DYY-III型，国产);各种玻璃仪器(培养皿、三角瓶、玻璃刮铲等)摇床(HZS—H，国产)；微量移液器(Gilson，法国)；电热手提式蒸汽压力锅(YXQ，SG46'280型，国产)；超净工作台(SW-CJ-2FD双人单面净化工作台；国产)培养箱(DHP-9162型;国产)。下述实施例中用到的溶液和培养基的组成如下1、配卡那霉素(kan)、潮霉素(Hyg):用灭菌蒸馏水配制浓度为50mg/ml的母液，经0.22Mm滤膜过滤灭菌，用1.5ml离心管分装，-20。C保存备用。2、配头孢霉素(Cef):用灭菌蒸馏水配制浓度为250mg/ml的母液，经0.22Mni滤膜过滤灭菌，用1.5ml离心管分装，-20C保存备用。3、配乙酰丁香酮(AS):先用少量甲醇溶解，后用灭菌蒸馏水配制浓度50mg/ml的母液，经0.22Mm滤膜过滤灭菌，用1.5ml离心管分装，-20C保存备用。4、配利福平(Rif):用灭菌蒸馏水配制浓度为50mg/ml的母液，经0.22Hm滤膜过滤灭菌，用1.5ml离心管分装，-20°0保存备用。5、YEB培养基其组成和含量为蛋白胨5g/1，酵母粉lg/1，牛肉膏5g/1，蔗糖5g/l，MgS04，7H200.493g/l，其余为水。pH值7.0，121。C高压灭菌20min。YEB固体培养基中加0.8%琼脂，YEB液体培养基不加琼脂。6、MS培养基其组成及含量如表l所示，培养基中附含30gl—'蔗糖和6gl一1琼脂，PH5.6，液体MS培养基中不加琼脂，120C高压灭菌20rain。表l、MS培养基<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>7、几种主要培养基(单位mg/1)愈伤组织诱导培养基(MSI):MS+6-BA0.5mg/l+NM0.02mg/l;芽分化培养基(MS2):MS+6-BA0.5mg/l+NAA0.05mg/l;增殖及壮苗培养基(MS3):MS+6-BA0.5mg/l;生根培养基(MS4):1/2MS+IBA0.1mg/l;其它培养基根据研究目的的不同附加不同浓度的潮霉素(Hyg)、头孢霉素(Cef)、乙酰丁酰酮(AS)。8、CTAB提取缓冲液:NaCl1.4mol/l，Tris-HC10.lmo1/1(pH8.5)，CTAB2%(w/v)，EDTA-2Na0.02mol/l。pH值7.5，高压灭菌20min。9、TE缓冲液Tris-HC110mM(pH8.0)，EDTA0.lmM(p朋.O)。10、50XTAE缓冲液Tris242g/l，冰醋酸57.lml，0.5mol/LEDTA(pH8.0)100ml，加水定容至1L。11、3MNaAc(PH5.2):称取40.824gNaAc3H20或无水NaAc24.6g，溶于30ml水中，加HAc调pH至5.2，用水定容至100ml。实施例1、农杆菌介导小对叶进行遗传转化的最优条件的筛选一、不同预培养时间对小对叶遗传转化的影响将小对叶叶片用自来水冲洗l-2小时，然后用0.1%升汞泡2min，再用无菌蒸馏水冲洗5-6次；将灭过菌的叶片切成0.5cniX0.5cm的小块，接种在愈伤组织诱导培养基MS1上，分别预培养0、1、2、3、4、5天，再用农杆菌菌液侵染，进行转化，其它的遗传转化条件均相同。30天后统计愈伤组织形成率，50天后统计其不定芽率及抗性芽率。结果如表2所示。结果表明，叶盘经过1-3天预培养后进行转化是比较适宜的，其中预培养2天的效果最好。未经过预培养的叶盘转化率较低，分析原因是幼嫩的无菌苗叶片经过切割，己经受到较大的伤害，甚至少数出现萎蔫状态，当马上用农杆菌对其进行侵染时，其难以抵抗农杆菌的伤害，以至叶盘迅速褐化死亡。而对于预培养2天的叶盘，其切口边缘的细胞对所受的伤害己经开始修复，同时细胞也开始旺盛地分裂，形成较多的感受态细胞，此时，对农杆菌的侵染较敏感，有利于T-DNA的整合，因此转化率相对较高。但是，当预培养的时间超过4天时，叶盘的切口己经基本愈合，创伤产生的小分子酚类物质等基因诱导物减少，处于转化的不敏感期，从而不利于农杆菌的侵染及外源基因的整合，使转化率降低。_表2、预培养时间对小对叶转化的影响_预培养时/d外植体数不定芽诱导率(％)抗性芽率(％)<table>complextableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>二、不同农杆菌菌液浓度对小对叶遗传转化的影响菌液浓度是影响转化效率的重要因素之一。同时，适宜的菌液浓度，也说明农杆菌处于生长的指数期，酶系活跃，代谢旺盛，此时用于转化，可以得到较高的转化率。菌液浓度越大，附着于外植体伤口的农杆菌的数量越多，侵染外植体的机率就越大。但是菌液浓度过高，会使叶片上附着的农杆菌过多，经过共培养会导致菌体过量生长，最终会致使叶盘褐化死亡；而菌液浓度过低，叶盘附着的农杆菌过少，减少了T-DNA整合的机率，从而大大降低了转化率。取对数生长期的、0D柳值分别为0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0七种不同浓度的农杆菌菌液，用七种不同浓度的农杆菌菌液分别侵染小对叶无菌苗，其它转化条件均相同，通过比较共培养后的不定芽诱导率以及抗性芽率，选择最适合的ODe。。值作为侵染的最佳浓度。结果如表3所示。结果表明，当菌液浓度0D6。。值在0.4-0.6的范围内时效果比较好，其中OD6oo值为0.5时抗性芽率最高、效果最好。当菌液浓度的OD目值为0.8及以上时，农杆菌对叶盘的伤害加大，得到的抗性芽率较低甚至没有；当菌液浓度的ODeoo值低于0.3时，抗性芽率最低。表3、；R杆菌菌液对小对叶转化的影响<table>complextableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>三、不同侵染时间对小对叶遗传转化的影响农杆菌侵染时间的长短对小对叶叶盘转化也有一定影响。若小对叶叶盘在菌液中浸泡的时间过长，会因农杆菌毒害缺氧而软腐，且在筛选培养时抑制农杆菌的生长困难。而浸泡的时间过短，农杆菌还末充分附着到叶盘伤口面，减少了农杆菌的结合机率，从而降低转化率。将经过预培养的叶片用相同浓度的农杆菌菌液侵染，侵染时间设置成不同梯度，分别为3、5、7、10、15、20min，进行遗传转化，其它转化条件均相同，观察不同侵染时间对叶片外植体生活力的影响，统计抗性芽率。结果如表4所示。结果表明，侵染时间为5-IO分钟时，效果比较好，其中侵染7分钟的效果最好。当侵染时间为3min时，抗性芽率为0%，不能实现转化；当侵染时间延长到7min时，抗性芽率有显著的提高；而随着时间的延长，最终得到的抗性芽率并不高，呈现下降趋势，一方面可能是因为侵染时间的延长虽然能提高叶盘的接菌量，有利于提高转化效率，但在菌液中浸泡时间越长，叶片受菌液伤害的程度就越严重，叶片再生就越困难；另一方面可能是因为农杆菌的繁殖速度很快，培养后期易出现农杆菌过度生长杀死叶盘的现象。与侵染7min的处理相比，侵染15min处理的叶盘受害程度严重，出现切口变褐、坏死，边缘部位呈热水浸渍状伤害，个别叶片明显失绿。这些叶盘在后续培养过程中，难以存活。表4、不同的侵染时间对小对叶转化的影响浸染时间(min)外植体数不定芽诱导率(％)抗性芽率(％)312022.500.00512021.674.17712025.007.501012020.833.331512014.171.67201200.000.00四、不同共培养时间对小对叶遗传转化的影响共培养时间对转化影响很大，因为农杆菌的附着、T-DNA的转移及整合都是在共培养期间完成的。当农杆菌侵染小对叶叶盘后，农杆菌附着在创伤的植物细胞上，并不能立即转化，只有在创伤部位生存16h之后才能诱发菌株产生肿瘤，这一段时间称为"细胞调节期"。因此共培养时间必须长于16h，但若共培养时间太长，由于农杆菌的过度生长，植物细胞会因受到毒害而死亡。若共培养时间过短，又不能完成转化过程。只有合宜的共培养时间才会使农杆菌在培养基上正常增殖，并顺利地在叶盘与培养基的接触部位形成肉眼可见的菌落，从而保证遗传转化过程的完成。将经过相同条件进行农杆菌转化的叶盘，分别共培养0、2、4、6、8天，然后再进行其它遗传转化步骤，除共培养时间不同外，其余遗传转化步骤均相同，60天后统计抗性芽率。结果如表5所示。结果表明，不经共培养直接转到选择培养基中，虽然可以得到很高的不定芽诱导率，但是抗性芽率为0%;随着共培养时间的延长，叶盘转化效率明显提高，在共培养4天时，抗性芽率最高，为6.67%，共培养6天时，效果也比较好，抗性芽率为3.33%;在共培养8天时，农杆菌生长过于旺盛，在选择培养时难以抑制，使叶盘严重受伤，不定芽诱导率和抗性芽率降至0%，不利于转化体的获得。表5、不同的共培养时间对小对叶3睹化的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>五、脱菌培养中抗菌素浓度的确定(一)头孢霉素(Cef)抑制农杆菌浓度的确定农杆菌浸染植物后，一个重要的环节就是要抑制农杆菌的过度生长，必须利用一种抗生素来杀死农杆菌，阻止农杆菌对遗传转化的破坏作用，即需要脱菌培养。在脱菌培养过程中，必须有一个适合的抑菌剂浓度范围，保证抑菌剂在能够有效地抑制农杆菌菌株生长的前提下，最大限度地降低对植物外植体生长的影响。Cef对农杆菌有很好的抑制作用。实验方法如下在9ml含有不同浓度Cef的YEB液体培养基中分别加入lml相同浓度的农杆菌菌液，于28'C，180r/min振荡培养，其中，YEB液体培养基中Cef的浓度(mg/l)分别为100、200、250、300、350、400、450、500，其余实验条件均相同，向9ml不含有抗生素Cef的YEB母液中加入lral农杆菌菌液以作为阳性对照，以10ml不含有抗生素Cef且不含有农杆菌的YEB母液作为阴性对照，每种浓度重复3次。培养16小时后，在波长600nm下用紫外分光光度计测定其紫外吸收值ODe。。，并计算三个重复样品值的算术平均值。实验结果如表6所示。实验结果表明，振荡培养后，阳性对照管变混浊，阴性对照管清亮透明，浓度为100mg/1、200mg/lCef的实验管比阴性对照管稍微混浊，250mg/lCef的实验管稍微有一点点混浊，当Cef浓度为300mg/l-500mg/l时，菌液的平均ODe。。值都非常低，均能抑制农杆菌菌株的生长，因此浓度为300mg/l-500mg/l的Cef为抑制农杆菌的浓度。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>(二)头孢霉素Cef对小对叶愈伤组织诱导的影响抑菌剂不仅对农杆菌有杀伤或抑制作用，而且对植物细胞也具有一定的生物效应。不同浓度的Cef对愈伤组织诱导影响有明显差异，低浓度时能促进外植体分化形成愈伤组织，但高浓度时能抑制甚至完全抑制外植体愈伤组织的分化。将小对叶无菌叶片接种于加有不同浓度Cef的愈伤组织诱导培养基MS1中，除培养基中Cef浓度不同外，其余实验条件均相同。Cef共设8个浓度梯度(mg/1):100、200、250、300、350、400、450、500，以未加抗生素的培养基为对照。每瓶接种10个外植体，每种浓度接种4瓶，培养温度控制在(25士2)'C，光照强度1800Lx，光照时间12h.d—1。每10天换一次培养基。20天后观察愈伤组织的诱导情况。实验结果如图l所示，表明，外植体培养20天后，大部分叶片能够形成愈伤组织，各种浓度Cef的培养基差异不大，同时所形成的愈伤组织的大小、颜色与对照组相比也都无明显差别。虽然随着Cef浓度的增加，愈伤组织诱导率有下降趋势，但是这种趋势并不明显，只是在Cef浓度为500mg/l时的诱导率稍低了一些。因此表明Cef对小对叶愈伤组织诱导的影响不大，结合Cef的抑菌实验，确定以450mg/l的Cef作为脱菌浓度。六、筛选培养中选择压和不同筛选方法对小对叶遗传转化的影响(一)筛选培养中选择压的确定1、抗生素种类及浓度设置抗生素卡那霉素(Kanamycin，Kan)(Amresco公司)、潮霉素(Hygromycin,Hyg)(Roche公司)。配制参考Sambrook等的方法，母液质量浓度均为50mg.L两种抗生素浓度梯度设置如下卡那霉素0、5mg.L—1、7mg.L—\10mg.L—'、12mg.L一1、15mg.L—\20mg.L一1、25mg.L—1;潮霉素0、3mg.L—\5mg.L—'、7mg.L—\8mg.L—\9mg.L—'、10mg.L—1、12mg.L—1，2、抗生素对小对叶离体叶片分化的影响用于转化植物的质粒在构建时已经嵌合了抗生素抗性标记基因,可以使被转化细胞或植株对该抗生素产生抗性，能正常生长、发育，并分化成植株；而非转化细胞因为没有抗生素抗性标记基因，所以不能在附加抗生素的培养基上生长、发育。植物基因工程中，对转化体进行筛选时,首先要根据用于侵染的菌株所携带的抗生素抗性标记基因的不同，而使用不同种类的抗生素。抗生素的使用浓度因不同的植物材料而异。若浓度过高，会杀死已转化的植物细胞；而浓度过低又会使大量非转化细胞得以生长。因此，在进行遗传转化之前对待转化材料进行抗生素敏感性测定，是建立遗传转化系统的必然条件。实验方法如下取培养2周的小对叶无菌苗叶片，切成0.5cmX0.5cm的小块，接种于MS1培养基上预培养后，再分别接种于添加不同浓度梯度的二种抗生素的MS2培养基上进行分化培养，以诱导分化出芽。除抗生素种类及浓度不同外，其余实验条件均相同。每个浓度设3次重复，每次重复选用30个外植体。观察不同抗生素种类及其不同浓度对叶片不定芽诱导的影响，30天后统计不定芽数目。实验结果如下(1)不同浓度的卡那霉素对小对叶离体叶片分化的影响结果如表7和图2所示。表明，卡那霉素对小对叶叶片的分化有抑制作用，且随着浓度的提高作用增强，叶片的褐化程度也越严重，产生白化芽也越多。当卡那霉素浓度为12mg.L—'时，叶片出芽率大幅度下降，仅为5.56%，15mg.L—i的卡那霉素已能完全抑制不定芽的发生。浓度为20mg.L—1或以上时叶片切口处均无愈伤组织分化，20天后叶片呈黄褐色，全部死亡。研究结果表明卡那霉素筛选的适宜浓度为15mg.L一1。表7、卡那霉素对小对叶离体叶片分化的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>(2)不同浓度的潮霉素对小对叶离体叶片分化的影响潮霉素对许多种植物都产生很髙的毒性，因为它是一种很强的细胞生长抑制剂，它抑制核糖体上肽链的延长，从而导致细胞死亡。潮霉素对小对叶离体叶片分化的影响结果如表8和图3所示，结果表明，小对叶叶片分化对潮霉素特别敏感，8mg.L—'的潮霉素对叶片愈伤组织的形成及芽分化已产生明显的抑制作用，20天后浓度大于9mg.L…的外植体叶片开始出现萎縮、失绿、褐化现象，且随着浓度的升高，叶片褐化程度明显增加。10mg.L—i的潮霉素已能完全抑制叶片愈伤组织和不定芽的分化，是适宜的筛选浓度。浓度为12mg.L—i及以上时外植体叶片全部死亡。表8、潮霉素对小对叶离体叶片分化的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>(3)小对叶离体叶片对二种抗生素的敏感程度比较二种抗生素对小对叶叶片分化的抑制程度不同。当叶片分别接种到含有相同浓度的二种抗生素的培养基上时，其分化的生长状态明显不同(图4)。当抗生素浓度为IOmg.L—'时，含有卡那霉素的培养基上的叶片褐化死亡的程度比较严重，而且分化率也较低，仅为30%;含有潮霉素的培养基上的叶片已全部死亡。应用MicrosoftExcel表格，绘制出抗生素与小对叶离体叶片分化率的回归图，见图4。回归曲线的方程分别为卡那霉素yi3.21-4.23x;潮霉素y二98.15-9.34x。回归方程斜率的绝对值反映的是抗生素对植物的危害程度的大小，斜率的绝对值越大，说明该抗生素对外植体的分化抑制作用越强烈。从图4可看出，小对叶对二种抗生素的敏感程度为潮霉素〉卡那霉素。(4)Hyg对小对叶试管苗生根的影响植物遗传转化过程中，尤其是以器官发生途径再生植株的转化系统，往往会产生较多的嵌合体或假转化体。因此，在转化苗生根时施用适当浓度的选择剂对于转基因植株的进一步筛选具有重要作用。将长势一致的小对叶试管苗，分别接种于添加不同浓度Hyg(O,3，5，7，8,9，lOrag/1)的生根培养基MS4中，观察不同浓度的选择剂对试管苗生根及生长的影响，以确定生根时筛选转化苗的合适选择压力，除生根培养基中潮霉素浓度不同外，其余实验条件均相同。每种浓度接种5瓶，每瓶接10个外植体。20天后，统计试管苗的生根率、平均根数及平均根长。实验结果如表9所示，表明，试管苗对Hyg特别敏感，仅3mg/l的Hyg即可使试管苗的生根受到一定影响，生根率下降到64%，且生根条数和根的长度都受到抑制；而当Hyg浓度增加为7mg/l时，试管苗生根能力则立即下降到12%，幼苗的生长也明显减慢；9mg/1以上的Hyg使试管苗完全不能生根，而且随着Hyg浓度的增加，幼苗逐渐停止生长，叶片黄化，芽的生长点死亡。因此，在生根时，为进一步筛选小对叶转化苗，Hyg的浓度应确定在9mg/1。表9、不同浓度的潮霉素对z」、对叶试管苗生根的影口<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>(二)不同选择方法对小对叶离体叶片分化的影响转化芽的选择采用三种方法一是前期选择，共培养后的叶盘直接转入含有Hygl0mg/1的分化培养基中诱导转化芽的再生；二是延迟选择，共培养后的叶盘先在不含Hyg的分化培养基中培养7天后，再转入Hygl0mg/1的培养基中进行选择培养；三是后期选择，共培养后的叶盘接种在不含Hyg的培养基中，直到分化出不定芽，然后再转到HyglOmg/l的培养基中进行选择。这三种方法获得的再生芽在含有Hygl0mg/1的继代培养基中继续筛选。以上3种选择培养过程中，各种培养基中均加入Cef450mg/1以抑制农杆菌的生长。50天后统计抗性芽率。当外源基因进入受体细胞后，整合与表达以及表达量的积累都需要有一个过程。因此，加入筛选压的时间及共培养后延迟多长时间进行筛选都会影响到转化的成败。共培养后先在无Hyg，只含有Cef的分化培养基上延迟筛选分化一段时间后，再转入筛选培养基，这可以让刚侵染过的植物细胞生理状态在无Hyg筛选时有机会恢复，并且能分裂增殖，而其后再转入较髙浓度的Hyg筛选培养基中，又能使非转化的细胞受到抑制，有利于提高转化率。但是随着延迟筛选时间的延长，叶盘在筛选培养基中的再生率逐渐升高，但超过一定时间，假抗性愈伤组织也随之增加，影响后期的鉴定工作量。实验结果表明，Hyg的延迟筛选可有效提高抗性愈伤和芽苗的比率，转化的外植体在转入筛选培养基时，如果立即加入Hyg，即使在很低的浓度下，绝大多数外植体也会白化死亡，愈伤组织诱导率很低，而且也很难分化出Hyg抗性芽。这可能是由于在转化的最初阶段，在含Hyg的选择培养基上，非转化细胞不能生长，而转化细胞由于数量少、生长能力弱，对Hyg抗性还不强，难以生长获得转化体。延迟筛选时间过长则会因为非转化细胞的大量活跃生长，对转化细胞的生长处于劣势，因此虽然愈伤诱导率很高，但随着进一步筛选培养，很多外植体都会褐化死亡，也难以有效分化出抗性芽苗来。实验确定一般以延迟7天筛选为佳。七、乙酰丁香酮(AS)对小对叶遗传转化的影响乙酰丁香酮是一类酚类化合物，根据农杆菌感染植物的作用机制，AS对Vir区基因的活化具有重要的作用，有助于提高农杆菌对植物的转化效率。理论上，T-DNA的转移发生在共培养阶段，侵染过程一般认为不会发生T-DNA的转移，较多的研究者认为在共培养阶段添加AS更能提高转化效率。在其它实验条件均相同的情况下，分别采用以下方法添加AS:(l)侵染时加入不同浓度的AS,即用液体MS重悬溶液悬浮农杆菌时加入不同浓度的AS;(2)在共培养时的培养基中加入不同浓度的AS;(3)在侵染液和共培养基中均加入不同浓度的AS。以不加AS为对照，观察三种处理对不定芽诱导率的影响。实验结果如表IO所示，结果表明，在不添加AS的处理中，抗性芽诱导率很低，仅为1.67%;在共培养培养基中加入AS要好于在菌液中加入AS;在菌液和共培养培养基中都添加AS的效果最好，且菌液和共培养培养基中AS浓度均为lOOnig/L,抗性芽诱导率高达7.5%。表10、乙酰丁香酮对小对叶遗传转化的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>实施例2、通过农杆菌介导向小对叶中转入GUS基因和GFP基因本实施例的遗传转化步骤如下先将小对叶无菌苗叶片，切成0.5cmX0.5cra的小块，接种于MS1培养基中进行预培养，然后进行浸染，将材料放入用愈伤组织液体诱导培养基MS1稀释到一定0D值的菌液中，期间不断轻轻晃动浸染瓶，使材料切口充分与菌液接触。取出后用灭菌滤纸吸干多余菌液，转移到共培养基上进行共培养，共培养后的外植体转入到脱菌培养基中，一周后再转入到筛选培养基中，每10天继代一次。40天后可看到有筛选到的抗性分化芽。待筛选的抗性芽长到2-3cm左右时，切下单芽苗转入到生根培养基中进行生根培养，继而得到完整植株。一、重组农杆菌的构建载体pC扁IA1303(CAMBIA)(GenBank序列号为AF234299，参考文献JOURNALPlantMol.Biol.1994,25(6),989~994)。将载体pCAMBIA1303导入农杆菌通过电击转化法将载体pCAMBIA1303导入根癌农杆菌LBA4404中，电击转化仪为GenePulserXCell(Bio-Rad)，方法参照电击转化仪操作手册。阳性重组农杆菌的筛选方法挑选在含有卡那霉素(50mg/L)和利福平(50mg/L)的YEB固体培养基(含0.8%琼脂)生长的单菌落，得到含有载体pCAMBIA1303的重组农杆菌，命名为重组根癌农杆菌(Ato7e/a"e/^)LBA4404/pCAMBIA1303。菌株的保存在已灭菌的1.5ml离心管中加入700ml培养过夜的重组根癌农杆菌(At咖e/3CJ'e/s)LBA4404/pC細IA1303菌液和700ml25%的甘油，放入-80。C冰箱中长期保存；若不需长期保存，可放入4'C冰箱保存，每半个月活化一次。二、遗传转化步骤如下(一)根癌农杆菌的培养用接种环刮取步骤一获得的重组根癌农杆菌".Z^/Be/a"e7^)LBA4404/pCAMBIA1303后直接在含有50mg/L卡那霉素(Kan)的YEB固体培养基上划线；将平板倒置于28'C恒温培养箱中黑暗培养，至产生单菌落；挑取一个农杆菌单菌落，接种于30ml含50mg/L卡那霉素的YEB液体培养基中，放入28°C、180r/min恒温摇床上振荡培养过夜；取3ml农杆菌菌液，加入到30ml含50mg/L卡那霉素的YEB液体培养基中，在相同的条件培养至对数生长期；将30ml对数生长期的菌液离心，收集菌体，用含有100mg/LAS的MSi液体培养基重悬，并使其紫外吸收值0D6。。的值为0.5，以作为接种外植体的菌液。(二)小对叶外植体的预培养将小对叶叶片用自来水冲洗l-2小时，然后用0.1%升汞泡2min，再用无菌蒸馏水冲洗5-6次；将灭过菌的叶片切成0.5cmX0.5cm的小块，接种于愈伤组织诱导培养基MS1上，在温度控制在(25士2)。C、光照强度1800Lx、光照时间12h/d的条件下进行预培养，预培养2天，选取切口开始形成愈伤组织的用于接种。(三)重组农杆菌侵染小对叶外植体将步骤(二)中制备的小块小对叶外植体浸泡在步骤(一)中制备的接种外植体的菌液中，侵染时间是7min;然后将接种菌体后的外植体放在无菌吸水纸上吸干外植体非伤面的菌液，以备共培养。(四)农杆菌与外植体的共培养将步骤(三)获得的接种菌体后的外植体置于含有100mg/LAS的愈伤组织诱导培养基MS1中，在温度控制在(25士2)°C、光照强度1800Lx、光照时间12h/d的条件下进行共培养，共培养时间是4天。(五)脱菌培养将步骤(四)中共培养后的外植体转移到含有450mg/1Cef的愈伤组织诱导培养基MS1中，在(25士2)。C、光照强度1800Lx、光照时间12h.d—1的条件下继续培养7天。(六)筛选培养将步骤(五)中脱菌培养后的外植体，置于含有10mg.L—力yg及450mg/1Cef的芽分化培养基MS2中，在温度控制在(25士2)。C、光照强度1800Lx、光照时间12h/d的条件下继续培养以诱导出芽。(七)生根培养将步骤(六)中诱导出的不定芽切入含有9mg/lHyg生根培养基MS4中，在温度控制在(25士2)°C、光照强度1800Lx、光照时间12h/d的条件下进行生根培养。(八)转基因植株的分子检测1、用CTAB法提取遗传转化的小对叶的DNA(1)称取步骤(七)获得的小对叶叶片0.1g，迅速在液氮研磨成粉末，转入到1.5ml的离心管中。(2)加入700W经65'C预热的CTAB提取缓冲液，充分混匀后置65'C水浴45-60min，每23min摇匀一次。(3)取出置于冰上，待冷却后加入700W酚氯仿异戊醇，轻轻颠倒混匀，4°C，12000rpm离心10min。(4)取上清，加等体积的氯仿异戊醇，轻缓颠倒混匀，4'C，12000rpra离心10min。(5)取上清(若混浊可重复3、4步骤1-2次)，加入1/10体积的3MNaAC和2倍体积预冷的无水乙醇(或等体积异丙醇)，缓慢混匀，-8(TC纯沉15min。(6)4°C，12000rpm离心10min，弃上清，加入70%乙醇洗沉淀1-2次，将离心管倒置于滤纸上，使液体流尽，在空气中使核酸沉淀干燥。(7)抽干后溶于适量TE或去离子灭菌水中，于-2(TC保存备用。(8)0.8%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统照相。结果如图5所示。2、PCR扩增检测扩增GUS基因的引物为5，GCAACTGGACAAGGCACT3，和5，GCGTCGCAGAACATTACA3，；扩增GFP基因的引物为5，ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC3'禾卩5'TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGA3';引物均由上海生工生物工程技术有限公司合成。PCR反应体系为模板DNA1W，正向引物1W，反向引物1W,10Xbuffer2.5W，EXTaqDNA聚合酶(5U/W)0.5W，灭菌蒸馏水补充至25W。PCR反应程序为-GUS基因94。C7min反应完毕后，取5W扩增产物在含EB的0.8呢琼脂糖凝胶中电泳，紫外灯下检测结果，凝胶成像系统照相。每次反应以pCAMBIA1303的DNA为阳性对照，以未转入pCAMBIA1303的小对叶DNA为阴性对照，以水为空白对照。结果表明阳性质粒对照和转基因植株均能扩增出大小一致的条带，扩增GUS基因的产物为680bp(图6，其中，M表示Marker;1表示扩增pCAMBIA1303的DNA的结果即阳性对照；2-7表示转入pCAMBIA1303的植株;8-9表示未转入pCAMBIA1303的植株即阴性对照；IO表示空白对照)，扩增GFP基因的产物为480bp(图7，其中，M:Marker;1:表示扩增pCAMBIA1303的DNA的结果即阳性对照；2-4:表示转入pCAMBIA1303的植株；5-7:表示未转入pCAMBIA1303的植株即阴性对照；8:94。C55。C72。C72。C4。CGFP基因94。C94。C50。C72。C72。C4°C表示空白对照。)；而未转任何基因的小对叶不能扩增出任何条带。以上结果证明外源基因已整合到小对叶细胞核基因组中。本实验中，一共将120块外植体进行转染，其中得到能诱导出芽的外植体数目为9块，即抗性芽率为7.5%，表明本发明方法的转染效率高。实施例3、通过农杆菌介导向小对叶中转入GUS基因和GFP基因在本实施例中，除以下各实验条件不同外，其余步骤均与实施例2中所述相同-(1)用于侵染的目的农杆菌菌液为处于对数生长期的、0De。。值为0.4的目的农杆菌菌液；所述侵染的时间优选为5分钟。(2)外植体预培养l天。(3)共培养5天。通过PCR扩增和凝胶电泳检测GUS和GFP基因是否转入植株中，得到的结果与实施例2中一致。在以上条件下，得到的抗性芽率为6.67%。实施例4、通过农杆菌介导向小对叶中转入GUS基因和GFP基因(下限值)在本实施例中，除以下各实验条件不同外，其余步骤均与实施例2中所述相同:(1)用于侵染的目的农杆菌菌液为处于对数生长期的、ODeoo值为0.6的目的农杆菌菌液；所述侵染的时间优选为10分钟。(2)外植体预培养3天。(3)共培养6天。通过PCR扩增和凝胶电泳检测GUS和GFP基因是否转入植株中，得到的结果与实施例2中一致。在以上条件下，得到的抗性芽率为3.33%。权利要求1、一种农杆菌介导的小对叶遗传转化方法，包括如下步骤以小对叶的叶片为外植体，用处于对数生长期的、OD600值为0.4-0.6的目的农杆菌菌液侵染所述外植体5-10分钟；所述目的农杆菌菌液的0D600值优选为0.5，所述侵染的时间优选为7分钟。2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中还包括在所述侵染之前，对外植体进行预培养的步骤，所述预培养的时间为l-3天，优选为2天。3、根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述方法中还包括在所述侵染之后进行共培养的步骤，所述共培养的时间为4-6天，优选为4天。4、根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述方法中还包括在所述共培养之后进行脱菌培养的步骤，所述脱菌培养中所用的培养基含有450mg/L的头孢霉素。5、根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述目的农杆菌含有潮霉素抗性基因。6、根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述方法中在所述脱菌培养后还包括筛选培养的步骤，所述筛选培养的方法包括如下步骤将所述脱菌培养后的外植体转入含有10mg/L潮霉素的分化培养基中进行培养，分化得到芽。7、根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述筛选培养方法中还包括如下步骤将所述分化得到的芽用含有9mg/L潮霉素的生根培养基进行培养。8、根据权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于所述目的农杆菌菌液中含有100mg/L乙酰丁香酮。9、根据权利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于所述共培养的培养基中含有100mg/L乙酰丁香酮。全文摘要本发明公开了一种农杆菌介导的小对叶遗传转化方法。本发明所公开的农杆菌介导的小对叶遗传转化方法，包括如下步骤以小对叶的叶片为外植体，用处于对数生长期的、OD₆₀₀值为0.4-0.6的目的农杆菌菌液侵染所述外植体5-10分钟；所述目的农杆菌菌液的OD₆₀₀值优选为0.5，所述侵染的时间优选为7分钟。用本发明方法对小对叶进行遗传转化，得到的抗性芽率为7.5％，表明本方法转化效率高。因此，本发明方法为使外源基因在小对叶中稳定表达奠定了基础，对小对叶的遗传改良有十分重要的意义。文档编号C12N15/82GK101338320SQ200810112349公开日2009年1月7日申请日期2008年5月22日优先权日2008年5月22日发明者旸关,吴丽爽,王晓萍,郭东林,郭长虹申请人:哈尔滨师范大学