用于裂解细胞的方法
【专利摘要】本发明涉及用于裂解细胞尤其是细菌细胞和分离核酸的方法。将样品用包含与水不能混溶的至少一种液体的裂解溶液处理且加热。然后将混合物冷却并且加入水，使得在冷却后生成两相系统。核酸可以在水相中找到。
【专利说明】用于裂解细胞的方法
[0001]本发明涉及用于裂解细胞尤其是细菌细胞和分离核酸的方法。将样品用包含与水不能混溶的至少一种液体的裂解溶液处理且加热。然后将混合物冷却并且加入水，使得在冷却后生成两相系统。核酸可以在水相中找到。
[0002]发明背景
核酸例如DNA广泛用于分子生物学领域中用于研究和临床分析。用于分析DNA的常见方法是DNA印迹、通过诸如聚合酶链反应(PCR)的方法扩增、和测序。使用这些方法，测定DNA序列中的差异，以帮助基因鉴定、群体筛选、病原体鉴定和诊断测试。所有这些分析都需要纯化的DNA样品作为一致和有效结果的基础。
[0003]核酸分离步骤一般在核酸的分析和体外操作前，以便使核酸不含不需要的污染物，所述污染物可以干扰后续处理程序。对于研究和诊断分子生物学的绝大多数程序，需要提取的核酸作为第一个步骤。在一般的DNA提取方案中，收获且裂解含有目的核酸的细胞。
[0004]细胞裂解是在用基于核酸的方法例如PCR和克隆技术进一步处理前，通过破坏细胞膜从细胞中释放材料的过程，并且特别是从细胞中提取细胞内材料以分离DNA或RNA的过程。
[0005]通过细胞破裂的细胞裂解方法可以分类成机械方法和非机械方法。
[0006]机械方法包括超声破碎、使用匀浆器的破坏、使用例如弗氏压碎器等的挤压、减压、粉碎等。非机械方法包括化 学方法、热方法、酶促方法等。
[0007]其为非机械方法的化学方法使用例如酸、碱、去污剂、溶剂、离液试剂等。尤其地，使用去污剂的化学方法被广泛使用。去污剂破坏脂质双膜以释放细胞内容物且裂解膜蛋白质。去污剂最常用于裂解动物细胞。大多数去污剂使蛋白质变性。然而，用于细胞裂解的试剂是分开添加的，并且因此需要去除试剂的后续过程。可以发生PCR抑制，并且该过程花费长时间。
[0008]酶促方法使用溶菌酶、蛋白酶等。
[0009]热方法包括冻融、加热、渗透冲击、电冲击等。例如，细胞裂解通过使细胞与热物体例如热板接触或通过重复冷冻至-70°C和解冻至室温的循环来实现。
[0010]在US 2006/0141556中，通过将微波辐射到样品上升高样品的温度来执行细胞裂解。蒸气压中的增加通过将两性离子化合物或离子液体加入样品得到预防。
[0011]仍存在快速和有效裂解方法的需要。
[0012]发明概沭
已发现细胞尤其是细菌细胞可以通过下述有效裂解:向样品中加入包含水不混溶的液体的裂解溶液，加热混合物且在冷却后加入水或含水缓冲液以生成两相系统。核酸可在水相中找到，并且可直接转移至进一步的下游操作如PCR。
[0013]因此，本发明涉及通过下述用于裂解细胞的方法
a)提供包含细胞的样品
b )向样品中加入至少包含水不混溶的液体的裂解溶液
c)将步骤b)中获得的混合物加热至高于80°C的温度d)在步骤c)中的温度高于100°C的情况下，将样品冷却至低于100°C的温度
e)将水或含水缓冲溶液加入混合物中，从而生成水不混溶的液相和水相。
[0014]在优选实施方案中，细胞是细菌细胞。
[0015]在优选实施方案中，将混合物加热至100 - 150°C。
[0016]在优选实施方案中，在步骤d)中，将样品冷却至20 - 40°C。
[0017]在优选实施方案中，在步骤b)中加入的裂解溶液包含至少一种油或至少一种离子液体。在非常优选的实施方案中，它包含至少一种离子液体。
[0018]在优选实施方案中，在步骤b)中加入的裂解溶液包含至少一种基于双(三氟甲基磺酰基)酰亚胺[Ntf2]的离子液体。这意指离子液体的阴离子是双(三氟甲基磺酰基)酰亚胺[Ntf2]。
[0019]在优选实施方案中，在步骤b)中加入的裂解溶液包含三己基(十四烷基)鱗三(五氟乙基)三氟磷酸酯[Ttp] [Fap]和/或1-丁基-1-甲基吡咯烷双(三氟甲基磺酰基)酰亚胺[bmpyrr] [Ntf2]。
[0020]在对于革兰氏阳性细胞尤其优选的一个实施方案中，在步骤bl)中加入裂解溶液前，使样品与至少一种基于N，N-二甲基乙醇铵[DMAE]的离子液体预温育。这意指离子液体的阳离子是N，N- 二甲基乙醇铵[DMAE]。
[0021]在一个实施方案中，在步骤e)后，使所得到的混合物与蛋白酶温育。
[0022]在一个实施方案中，在步骤e )和与蛋白酶的任选温育后，通过PCR方法特别是通过实时PCR、电泳(琼脂糖或聚丙烯酰胺)或克隆技术如连接或限制性酶消化，直接分析水相中的核酸。
[0023]本发明还涉及包含具有水不混溶的液体的一个容器和具有蛋白酶的一个容器的试剂盒。
[0024]发明详沭
如本文使用的术语“核酸”指本领域技术人员已知的任何类型的DNA或RNA。例子是基因组DNA、信使RNA、质粒DNA。
[0025]如本文使用的术语“缓冲液”指水溶液或组合物，当酸或碱加入该溶液或组合物中时，所述水溶液或组合物抵抗pH中的变化。这种对pH变化的抗性是由于此类溶液的缓冲性质。因此，显示出缓冲活性的溶液或组合物被称为缓冲液或缓冲溶液。缓冲液一般不具有无限的维持溶液或组合物的PH的能力。相反，它们一般能够维持在特定范围内的pH，例如pH7 - pH9。一般地，缓冲液能够维持在其pKa上和下一个对数内的pH (参见例如，Mohan，Buffers， A guide for the preparation and use of buffers in biological systems,CALB10CHEM, 1999)。缓冲液和缓冲溶液一般由缓冲盐或优选非离子缓冲液组分如TRIS和HEPES制备。可以在本发明的方法中使用的缓冲液优选选自磷酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲盐水缓冲液(PBS)、2-氨基-2羟甲基-1，3-丙二醇(TRIS)缓冲液、TRIS缓冲盐水溶液(TBS)和TRIS/EDTA (TE)。
[0026]待用根据本发明的方法裂解的细胞是所有类型的细胞，优选包含细胞壁的细胞，最优选细菌细胞、真菌细胞、古细菌细胞、藻类细胞或植物细胞。特别优选的细胞是革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌细胞，尤其是选自下述的那些:李斯特菌属物种(Zkteriaspp.)、金黄色葡萄球菌(51 aureus )、Ρ.para tuberculosis、沙门氏菌属物种 iSalmorwllaspp.)、空肠弯曲杆菌(C jejuni )、娄地青霉菌iPenicillum roquefortii )和大肠杆菌iE.Coli) 0
[0027]根据本发明，样品可以是包含细胞的任何样品。样品可以是例如食物样品，体液特别是血液、血浆或血清，水或组织样品。在优选实施方案中，样品已用包括下述步骤的方法由复杂样品生成:
a)提供复杂样品，
b)使所述样品与下述温育:
-至少一种离液剂，
-缓冲液和 -至少一种去污剂，
c)通过离心或过滤从所得到的混合物中分离所述细胞。关于这个从复杂样品中分离细胞的程序的细节公开于EP 2049677中。
[0028]根据本发明的样品还可以通过下述由复杂样品生成
a)提供复杂样品，
b)使所述样品与包含至少MgCI2和/或离子液体的提取溶液温育
c)优选通过离心、亲和结合和/或过滤，从步骤b)的混合物中分离所述细胞。
[0029]关于这个从复杂样品中分离细胞的程序的细节公开于WO 2010145754中。
[0030]根据本发明，复杂样品可以是例如食物样品，体液特别是血液、血浆或血清，水或组织样品。一般地，复杂样品具有复杂基质(即尤其其中包含蛋白质、脂质、碳水化合物等)和/或高粘度。
[0031]根据本发明，水不混溶的液体是水不混溶的油或水不混溶的离子液体。
[0032]适合于根据本发明的方法的油是任何油，其在室温是液体，并且具有高于150°C、更优选高于200°C的沸点以及闪点。此外，油必须是水不混溶的。这意指适合于根据本发明的方法的油当与水在20 - 80°C混合时形成两相系统。关于合适油的例子是有机油、矿物油、硅油或精油(essential oil)。
[0033]有机油是包含至少脂肪酸和/或甘油三酯的油。在室温是液体的有机油一般包含链长6 - 30个碳原子的单或多不饱和脂肪酸。合适的有机油的例子是菜籽油和蓖麻油。
[0034]矿物油是包含石蜡油和或环烷油的油和/或芳香油。优选的矿物油是包含较重烷烃的混合物的石蜡油，如重白油(CAS 8012-95-1)。
[0035]合适的硅油优选是通式R (R2SiO) nSiR3的线性硅油，R彼此独立的但优选在整个分子中等同的是直的或分支Cl - CS烷基残基。合适硅油的一个例子是聚(二甲基硅氧烷)(CAS 63148-62-9)。
[0036]关于精油的例子是萜烯或类萜。
[0037]如本发明中使用的离子液体或液体盐是由一般的有机阳离子和阴离子组成的离子种类。它们不含任何中性分子且通常具有低于373 K的熔点。
[0038]离子液体的领域目前被广泛研究，因为潜在应用是各种各样的。关于离子液体的综述文章是例如
【权利要求】
1.用于裂解细胞的方法，通过下述 a)提供包含细胞的样品 b)向所述样品中加入至少包含与水不混溶的液体的裂解溶液 c)将步骤b)中获得的混合物加热至高于80°C的温度 d)在步骤c)中的温度高于100°C的情况下，将所述样品冷却至低于100°C的温度 e)将水或含水缓冲溶液加入所述混合物中，由此获得与水不混溶的液相和水相。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于所述细胞是细菌细胞。
3.根据权利要求1或2的方法，其特征在于在步骤c)中，将所述混合物加热至100-150。。。
4.根据权利要求1- 3中任一项的方法，其特征在于在步骤d)中，将所述样品冷却至20 - 40。。。
5.根据权利要求1- 4中任一项的方法，其特征在于在步骤b)中加入的所述裂解溶液包含与水不混溶的离子液体。
6.根据权利要求5的方法，其特征在于所述离子液体的阴离子是双(三氟甲基磺酰基)酰亚胺[Ntf2]。
7.根据权利要求1- 5中任一项的方法，其特征在于在步骤b)中加入的所述裂解溶液包含三己基(十四烷基)鱗三(`五氟乙基)三氟磷酸酯[Ttp] [Fap]和/或1-丁基-1-甲基吡咯烷鎗盐双(三氟甲基磺酰基)酰亚胺[bmpyrr] [Ntf2]。
8.根据权利要求1- 7中任一项的方法，其特征在于加入所述裂解溶液前，在步骤bl)中使所述样品与至少一种包含铵阳离子[NR4]+的物质预温育 其中 在每种情况下，R彼此独立地指示
H, 具有1-20个C原子的直链或分支烷基， 具有2-20个C原子和一个或多个双键的直链或分支烯基， 具有2-20个C原子和一个或多个三键的直链或分支炔基， 具有3-7个C原子的饱和、部分或完全不饱和的环烷基，其可以通过具有1-6个C原子的烷基取代，其中一个或多个R可以部分或完全由卤素特别是-F和/或-Cl取代，或部分由-OH、-OR，、-CN、-C (O) OH、-C (O) NR，2、-SO2NRj 2、-C (O) X、-SO2OH, -SO2X, -NO2 取代，并且其中R中不处于α-位置中的一个或两个不邻近的碳原子可以替换为选自下述的原子和 / 或原子团:-0-、-S-、-S (O)-、-S02-、-S020-、-C (O)-、-C (O) O-、-N+R，2-、-P (O)R，O-、-C (O) NR，-、-SO2NRj -、-OP (0) R，0-、-P (0) (NR，2) NR，-、-PR，2=N_ 或-P (0)R’-，其中R’可以是=H，非、部分或全氟化的C1-至C6-烷基，C3-至C7-环烷基，未取代或取代的苯基，并且X可以是=卤素。
9.根据权利要求1- 8中任一项的方法，其特征在于加入所述裂解溶液前，在步骤bl)中使所述样品与至少一种基于N，N-二甲基-2-羟乙基铵[DMAE]的离子液体预温育。
10.根据权利要求1- 9中任一项的方法，其特征在于在步骤e)后，使所述所得到的混合物与蛋白酶温育。
11.根据权利要求1- 10中任一项的方法，其特征在于在步骤e)和与蛋白酶的任选温育后，通过实时PCR直接分析所述水相。
12.试剂盒，其包含具有与水不混溶的离子液体或与水不混溶的油的一个容器和具有蛋白酶的一个 容器。
【文档编号】C12N1/06GK103492550SQ201280020268
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2012年3月28日 优先权日:2011年4月27日
【发明者】J.斯拉格休斯, P.罗斯马尼特, S.富克斯, P.J.梅斯特, M.瓦格纳 申请人:默克专利股份公司