旋转依赖性转录测序系统及使用方法

旋转依赖性转录测序系统及使用方法
【专利摘要】本文中提供了旋转依赖性转录测序方法和系统。
【专利说明】旋转依赖性转录测序系统及使用方法
[0001]对相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2011年2月23日提交的美国申请N0.61/463，850和2011年7月30日提交的美国申请N0.61/574，270的优先权权益。
发明领域
[0003]一般而言，本公开内容涉及核酸测序系统和方法及可以在此类系统和方法中使用的组合物。
[0004]发明背景
[0005]几种技术目前可用于细菌性和病毒性病原体的检测和分型。这包括采用下列各项的方法:
[0006]I)遗传序列的间接测定，包括物种/菌株特异性PCR、基于重复序列的PCR(rep-PCR)、脉冲场凝胶电泳(PFGE)、和光学DNA定位，
[0007]2)通过多基因座序列分型(MLST)或全细菌基因组测序直接测定序列，或者
[0008]3)上述各项的组合，诸如通过质谱术测定PCR产物的碱基组成。
[0009]第一组技术(Cepheid,PathoGenetix, Inc., OpGen, Inc.)与第二组技术相比具有更低的分辨率和辨别力，而且受限于询问的少量保守基因组区。然而，第二组中的技术是昂贵得惊人的，并且仅提供低通量，尽管凭借引入第2(Life Technologies/1n Torrent 的 SOLiD 和 PGM, Illumina, Roche454, Complete Genomics)和第 3 (PacificBiosciences, Helicos)代高通量测序技术，每份样品的成本倾向低于10，000美元。然而，目前可用的测序技术遇到复杂的样品制备和DNA簇生成(Life Technologies的 SOLiD 和 1nTorrent, Roche454, Complete Genomics, Illumina)、短阅读长度(Helicos, SOLiD, Illumina)、或高错误率(Pacific Biosciences)。另外，目前可用的单分子测序仪(Pacific Biosciences and Helicos)是大体积的,非常昂贵,而且需要受过高度培训的人员来操作。第三组技术(Ibis Biosciences Inc.)能够测定仅相对较短的PCR产物序列的核苷酸组成，并且遇到常规PCR的所有限制。
[0010]与目前可用的单分子技术(Helicos, Pacific Biosciences)形成对比,本文中描述的旋转依赖性转录测序(旋转依赖性transcriptional sequencing)不需要开发能够掺入经修饰的核苷酸的突变体聚合酶、昂贵的标记核苷酸、或激光和昂贵的高速照相机。如此，本文中描述的旋转依赖性转录测序可以集成到便宜的便携式护理点系统中。
[0011]另外，本文中描述的旋转依赖性转录测序容许最终的灵活性和快速的再配置；容许对未预见到的地方性威胁、出现的疾病、大流行病和新的生物恐怖威胁的快速响应，其通过在没有任何试剂改变的情况下仅更新平台关联核酸数据库和软件进行。这与利用PCR的许多诊断性平台形成对比，其中在解决任何新目标的平台重新布署前测定法再配置和确认需要相当多的时间。这也与This is also in contrast to使用直接线性分析(DLA)技术的非测序单分子基因组序列扫描平台(PathoGenetiX)(其取决于以至少3kb分开的标签的空间样式，并且使此技术对亚kb插入或缺失以及单核苷酸变异不灵敏。[0012]此外,本文中描述的旋转依赖性转录测序容许最终的多路复用(multiplexing)能力。虽然基于PCR的和基于微阵列的方法受限于仅已知传染原的检测，并且不能鉴定突变或生物工程化改造的变体(即具有单核苷酸差异)，但是本文中描述的旋转依赖性转录测序在某种意义上是“靶物不可知论的(target agnostic) ”，因为该方法解码标本中或自标本提取的任何和所有DNA分子的一级结构，并且如此不能同时检测和鉴定几千种已知的或未知的(例如经遗传修饰的)靶物。通过本文中描述的系统和方法提供的此类继承的“宽带”多路复用能够与采用PCR的方法形成对比，所述采用PCR的方法需要特异性试剂组(引物和探针)来检测每种病原体。另外，基于PCR的技术受限于由于PCR的性质所致的在多重反应中仅容许的测定法数目，或者受限于需要在多次反应间分开样品(即其含有靶核酸)，由此损害检测的灵敏性和量化准确性。
[0013]发明概述[0014]旋转依赖性转录测序取决于相对于固体表面固定化的RNA聚合酶。由于转录。RNA聚合酶对核酸施加转矩，其继而自身表现为对核酸附接的标签的旋转。
[0015]在一个方面，提供了测定靶核酸分子序列的方法。一般地，此类方法包括在测定条件下使RNA聚合酶与靶核酸分子接触，检测旋转标签的旋转方式，并将接触和检测步骤重复多次。通常，测序条件包括至少一种核苷三磷酸的存在，并且在固体基片上固定化RNA聚合酶，其中靶核酸分子包含旋转标签。靶核酸分子的序列序贯基于在存在至少一种核苷三磷酸的情况中旋转方式变化的存在或缺乏。
[0016]在一些实施方案中，RNA聚合酶是噬菌体RNA聚合酶(例如T7RNA聚合酶、T3RNA聚合酶)。在一些实施方案中，RNA聚合酶是细菌RNA聚合酶(例如大肠杆菌RNA聚合酶)。在一些实施方案中，RNA聚合酶经由His标签在固体表面上固定化。代表性靶核酸分子可以是原核的、细菌的、古细菌的和真核的。靶核酸分子通常是双链的，并且可以包含于生物学样品内。靶核酸分子进一步可以包含RNA聚合酶启动子序列。
[0017]在一些实施方案中，旋转标签包含第一标签和第二标签。例如,在一些实施方案中，所述第一标签是磁性的。代表性固体基片由玻璃制成。其它代表性固体基片包括CMOS或CCD。在一些实施方案中，测序条件包括单一核苷三磷酸的存在；在一些实施方案中，测序条件包括四种核苷三磷酸的存在，而四种核苷三磷酸的第一核苷三磷酸以速率限制量存在。
[0018]在一些实施方案中，检测步骤包括将光投射到旋转标签上。在一些实施方案中，检测步骤进一步包括经由显微镜观察旋转方式。在一些实施方案中，检测步骤进一步包括在CMOS或C⑶上捕获旋转方式。在一些实施方案中，检测步骤包括以磁像捕获旋转方式。在一些实施方案中，在GMR传感器或MRAM阵列上捕获磁像。在一些实施方案中，检测步骤包括以电场捕获旋转方式。在一些实施方案中，在RAM传感器上捕获图像。
[0019]此类方法还可以包括对靶核酸分子应用定向力。例如，可以使用磁体，或使用流或压力产生定向力。
[0020]在另一个方面，提供了测定靶核酸分子序列的方法。此类方法通常包括提供固定化有RNA聚合酶的固体基片；在第一测序条件下使所述RNA聚合酶与所述靶核酸分子接触，其中所述靶核酸分子包含旋转标签，其中所述第一测序条件包括四种核苷三磷酸的存在，其中所述四种核苷三磷酸的第一核苷三磷酸以速率限制量存在；在所述第一测序条件下检测所述旋转标签的旋转方式；并基于所述旋转方式的变化沿着所述靶核酸分子测定所述第一核苷三磷酸的位置信息。
[0021]此类方法可以进一步包括提供固定化有RNA聚合酶的固体基片；在第二测序条件下使所述RNA聚合酶与包含所述旋转标签的所述靶核酸分子接触，其中所述第二测序条件包括四种核苷三磷酸的存在，其中所述四种核苷三磷酸的第二核苷三磷酸以速率限制量存在；在所述第二测序条件下检测所述旋转标签的旋转方式；并基于所述旋转方式的变化沿着所述靶核酸分子测定所述第二核苷三磷酸的位置信息。
[0022]在一些实施方案中，与在所述第一测序条件下的所述接触和检测步骤同时实施所述第二测序条件下的所述接触和检测步骤。在一些实施方案中，在所述第一测序条件下的所述接触和检测步骤之前或之后序贯实施所述第二测序条件中的所述接触和检测步骤。
[0023]此类方法还可以包括提供固定化有RNA聚合酶的固体基片；在第三测序条件下使所述RNA聚合酶与包含所述旋转标签的所述靶核酸分子接触，其中所述第三测序条件包括四种核苷三磷酸的存在，其中所述四种核苷三磷酸的第三核苷三磷酸以速率限制量存在；在所述第三测序条件下检测所述旋转标签的旋转方式；并基于所述旋转方式的变化沿着所述靶核酸分子测定所述第三核苷三磷酸的位置信息。此类方法可以进一步包括从所述靶核酸分子内所述第一、第二和第三核苷三磷酸的所述位置信息测定所述靶核酸分子的序列。
[0024]此类方法可以进一步包括提供固定化有RNA聚合酶的固体基片；在第四测序条件下使所述RNA聚合酶与包含所述旋转标签的所述靶核酸分子接触，其中所述第四测序条件包括四种核苷三磷酸的存在，其中所述四种核苷三磷酸的第四核苷三磷酸以速率限制量存在；在所述第四测序条件下检测所述旋转标签的旋转方式；并基于所述旋转方式的变化沿着所述靶核酸分子测定所述第四核苷三磷酸的位置信息。
[0025]在一些实施方 案中，固体表面是玻璃载玻片。此类玻璃载玻片可以用铜和PEG包被。在一些实施方案中，RNA聚合酶是T7RNA聚合酶。在一些实施方案中，经由His标签在固体基片上固定化T7RNA聚合酶。
[0026]在另一个方面，提供了测定靶核酸分子序列的方法。此类方法通常包括提供固定化有一个或多个RNA聚合酶的固体基片；在第一测序条件下使所述一个或多个RNA聚合酶与所述靶核酸分子接触，其中所述靶核酸分子包含旋转标签，其中所述第一测序条件包括四种中第一核苷三磷酸的存在；并在所述第一测序条件下检测是否发生所述旋转方式的变化。若发生所述旋转方式的变化，则所述方法进一步包括在所述第一测序条件下重复所述接触步骤和后续步骤，而若不发生所述旋转方式的变化，则所述方法进一步包括在第二测序条件下重复所述接触步骤和后续步骤，其中所述第二测序条件包括四种中第二核苷三磷酸的存在。类似地，若发生所述旋转方式的变化，则所述方法进一步包括在所述第一测序条件下重复所述接触步骤和后续步骤，而若不发生所述旋转方式的变化，则所述方法进一步包括在第三测序条件下重复所述接触步骤和后续步骤，其中所述第三测序条件包括四种中第三核苷三磷酸的存在。可以序贯基于在所述第一、第二或第三测序条件下所述旋转方式变化的发生获得所述靶核酸分子的序列。
[0027]在又一个方面,提供了制品(article)。制品通常包含固定化有多个酶RNA聚合酶的固体基片。在一些实施方案中，所述固体基片用铜和PEG包被；在另一个实施方案中，所述固体基片用镍和PEG包被。或者，所述固体基片可以用N1-NTA包被。在一些实施方案中，所述固体基片是CMOS或CCD。
[0028]在一些实施方案中，制品进一步包含旋转标签。旋转标签可以包含非球形标签,或具有可以光学区分的非一致表面的球形标签。制品还可以包含T7RNA聚合酶启动子序列和/或生物素化的核酸系链(tether)序列。如本文中描述的制品还可以包含一种或多种核苷
三磷酸。
[0029]在一些实施方案中，制品进一步包含关于下列各项的用法说明书:经由磁性参照标签鉴定所述旋转标签相对于轴的转动；基于核苷三磷酸的旋转和存在编译靶核酸分子序列；或应用磁力。所述用法说明书可以以电子形式提供。
[0030]在又一个方面，提供了用于靶核酸分子的单碱基测序的装置。此类装置通常包含测序模块，其中所述测序模块包含用于接收固体基片的接收器(receptacle)，其中所述固体基片包含其上固定化的多个RNA聚合酶；用于提供定向力的来源，其中所述定向力是足够的，且为如下的方向，使得对由所述固体表面上固定化的多个RNA聚合酶转录的靶核酸分子应用张力；和光源，用于将光投射至与靶核酸分子结合的旋转标签上，所述靶核酸分子由所述固体表面上固定化的多个RNA聚合酶转录；和光学器件，用于检测与靶核酸分子结合的旋转标签的旋转方式，所述靶核酸分子由所述固体表面上固定化的多个RNA聚合酶转录。
[0031]此类装置可以进 一步包括计算机处理器，和/或流质喷管(f luidics)，用于容纳和转运牵涉对核酸测序的试剂和缓冲液。代表性试剂盒核苷三磷酸和代表性缓冲液可以是清洗缓冲液。在一些实施方案中，所述用于提供定向力的来源可以是磁体或液体流。在一些实施方案中，光学器件包括显微镜，并且可以包含照相机。
[0032]此类装置可以进一步样品制备模块，其中所述样品制备模块包含用于接收生物学样品的接收器；和流质喷管，其用于容纳和转运牵涉分离和制备核酸以进行测序的试剂和缓冲液。代表性试剂包括细胞裂解试剂和/或切割酶，而代表性缓冲液包括裂解缓冲液和/或清洗缓冲液。
[0033]此类装置可以进一步包含模板完成模块，其中所述模板完成模块包含流质喷管，其用于容纳和转运牵涉将RNA聚合酶启动子序列和旋转标签附接于核酸分子的试剂和缓冲液。代表性试剂包括酶连接酶、分子发动机结合序列、磁性标签和/或系链，而代表性缓冲液包括连接酶缓冲液、磁性参照标签结合缓冲液、和/或旋转标签结合缓冲液。
[0034]在又一个方面，提供了测定靶核酸分子序列的方法，其中靶核酸分子包含旋转标签，且其中靶核酸分子的序列基于靶核酸分子的转录期间获得的数据。此类一般包括接收关于所述靶核酸分子的第一位置的第一数据，其中所述第一数据指示旋转的存在或缺乏和/或所述旋转标签的旋转间的时间长度；接收关于所述靶核酸分子的所述第一位置的第二数据，其中所述第二数据指示转录期间可用的一种或多种核苷三磷酸的存在和/或量；接收关于所述靶核酸分子的第二位置的另一第一数据和另一第二数据；接收关于所述靶核酸分子的第三位置的又一第一数据和又一第二数据；重复关于所述靶核酸分子的第四和后续位置的所述第一数据和所述第二数据的接收步骤；并基于对每个位置接收的所述第一数据和第二数据测定所述靶核酸分子的序列。在一些实施方案中，所述第一数据和所述第二数据以指定位置处的核苷酸记录。
[0035]除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语与主题系统、方法和组合物所属领域普通技术的通常理解具有相同的意义。虽然可以在主题系统、方法和组合物的实践或测试中使用与本文中描述的系统、方法和材料相似或等同的系统、方法和材料，下文描述了合适的系统、方法和材料。另外，系统、材料、方法和例子仅是例示性的，而并不意图为限制性的。下文提及的任何出版物、专利申请、专利、和其它参考文献通过提及完整并入。
[0036]附图简述
[0037]图1显示了单分子旋转依赖性转录测序复合物的一个实施方案(图1A)和芯片上(图1B)旋转依赖性转录测序复合物的实施方案，如本文中描述的。
[0038]图2A是使用20倍水物镜得到的磁性旋转标签图像。在此图像中，FOV受到检测仪而非物镜限制。在此图像中，磁性旋转标签具有2.7微米的直径。图2B是张力(在这里，在存在磁力的情况中)下的磁性旋转标签图像，其与图2A相比显示了磁性旋转标签由于应用磁体而“向上”移动。由于以两个不同角度从上方照明旋转标签的两个光源的存在而创建双重图像。因此，在旋转标签移出焦平面时，两个“阴影”分开。可以使用此方法来测定张力在样品的平面中及在平面外的不同z轴位置中多么一致。图2B中仍在焦点上的旋转标签可能在固体表面上成群。图2C是钝化固体表面上通过有His标签的RNA聚合酶拴系的旋转标签和5.1Kb DNA模板的阵列照片。[0039]图3是显示本文中描述的两种核酸测序模式的图:小图A显示了异步的实时“核苷酸方式”测序策略，其中有限浓度的单核苷三磷酸(在此小图中为鸟嘌呤(G))在将G核苷酸掺入初生链中时引起聚合酶停止。小图B显示了同步测序策略，其中核苷三磷酸的“碱基接碱基(base-by-base) ”引入导致核苷酸序列的连续解码。
[0040]图4是来自四个不同流动池的图，每个流动池含有有限量存在的不同核苷三磷酸。顶部小图显示了从四个流动池汇编的核酸序列。
[0041]图5是显示如本文中描述的流动池的一个实施方案的示意图。例如，流动池可以包含OmniVision传感器(0V14810 ;在除去窗并用SiN包被后)顶部放置的约50微米厚度的激光切割压力敏感性粘合剂(PSA)膜。此构造在CMOS芯片上形成流动池。然后，应用玻璃或聚合载玻片，其具有用于微流质喷管馈通管(microfluidic feed-through tube)的洞。
[0042]图6A是照片，而图6B是线条画，其显示了原型固体表面，其中使用光纤来投递光，并使用显微镜物镜进行成像。显示了位于光纤下且在物镜上含有有旋转标签的核酸和RNA聚合酶的固体表面载玻片。
[0043]图7显示了如本文中描述的旋转依赖性转录测序系统的一个实施方案。示意图显示了张力源、照明源、和具有入和出流质喷管的固体表面芯片上部的四个流动池。
[0044]图8A是照片，而图SB是线条画，其显示了旋转依赖性转录测序系统的一个实施方案。此实施方案使用20倍水物镜，即来自Olympus的“超级透镜”，其提供超过Imm FOV及NA=0.9，其是高分辨率及较大的视场。还显示了固体表面、光投递和张力来源(例如磁体)。
[0045]图9A是照片，而图9B是线条画，其显示了旋转依赖性转录测序系统的另一个实施方案。在此实施方案中，显示了紧凑的光学系统，其具有AF光学分辨率靶物、照明光纤、20倍Mitutoyo物镜、管式透镜和照相机。盘式磁体在靶物上方也是可见的，但是对于此图像是边远的。对于目标空间的I微米分辨率，可以使用一个或多个具有大于20微米的像素尺寸的照相机。[0046]图10显示了即使在使用低分辨率(即经由物镜或经由芯片上方法成像的每个珠为10x10像素)时可以检出旋转标签(例如包含第一标签和第二标签的双重物(doublet))的旋转。使用更先进的算法进一步降低至5x5像素是有可能的。此外，若使用锥形束，则分辨率对于位于束核心顶部的每个珠而言升高一定的倍数，该倍数与核心大小和该束另一侧的每个像素的大小，以及核心跨越的检测仪上的像素数目相关。
[0047]图1lA是显示旋转标签的旋转方式的例示性分子的流程图，而图1lB是显示用于测定靶核酸分子序列的例示性方法的流程图。
[0048]各图中相似的参照符号指示相似的元件。
[0049]发明详述
[0050]本公开内容描述了单分子测序系统，其中现有单分子系统的许多约束是放松的，包括复杂性、成本、可扩缩性及最终较长的阅读长度、较高的通量和增强的准确性。本文中描述的实时单分子测序方法和系统由于高度行进的转录机器和简单的光学和成像系统而可以以高准确性在非常短的时间中对数千个核苷酸测序。
[0051]本系统的优点是众多的。例如，使用双链核酸作为模板，这使对样品制备的需要最小化并限制该需要。另外，不需要经标记的核苷酸，因为可以使用非常简单的成像方法(例如CMOS)，这显著降低成本。还有，可以使用野生型酶RNA聚合酶；对酶的特殊修饰是没有必要的，并且表面化学和酶固定化技术是常规的。本系统和方法适合于同聚合序列，因为旋转对于每种核苷酸是相同的，并且如此，在多种核苷酸里是累积的。本系统和方法也容易适合于高通量测序。
[0052]旋转依赖性转录测序的概述
[0053]旋转依赖性转录测 序依赖于RNA聚合酶转录靶核酸分子。将RNA聚合酶在固体表面上固定化，并将旋转标签结合到靶核酸分子。在转录期间，RNA聚合酶在模板核酸中建立转录泡，该转录泡含有其内的约8个碱基的RNA = DNA杂合物。随着RNA聚合酶沿着双链核酸模板前进，它必须在所述泡的前缘解开螺旋，并在后缘再退火链。由于双链螺旋的解开产生的转矩导致掺入每个核苷酸的模板核酸相对于RNA聚合酶旋转约36°。因此，在将RNA聚合酶在固体表面上固定化并将旋转标签附接于模板核酸时，可以观察到模板核酸的旋转，并且其指示酶的转录活性(即，掺入核苷三磷酸)。
[0054]如本文中描述的，基于旋转标签的旋转方式变化测定或获得靶核酸分子的序列。如本文中还描述的，可以完成检测核酸旋转的存在或缺乏，例如，使用与靶核酸分子结合的旋转标签的照明进行。可以放大本文中描述的旋转测序方法以进行全基因组测序，其使用酶RNA聚合酶的阵列和许多适合于捕获旋转标签旋转的常规成像方法进行。
[0055]图1显示了本文中描述的旋转依赖性转录测序复合物的单分子测序实施方案(图1A)和芯片上阵列实施方案(图1B)。可以使用本文中描述的旋转依赖性转录测序复合物来测定靶核酸分子10的序列。在一些实施方案中，使固体表面30上或芯片80上固定化的RNA聚合酶20与靶核酸分子10 (即具有未知序列的核酸分子)接触。依照本文中描述的方法，靶核酸分子10包含旋转标签40。在特定的测序条件(其包含至少一种核苷三磷酸的存在)下，旋转标签40的运动和/或速度的变化创建旋转方式。将这些步骤重复多次，并且序贯基于特定测序条件下旋转方式变化的存在或缺乏测定靶核酸的序列。下文更为详细讨论了这些特征。[0056]固体表面
[0057]对于本文中描述的旋转依赖性转录测序，在固体表面上固定化RNA聚合酶。在本文中描述的实施方案中，固体表面通常由基于娃土的玻璃(例如硼娃酸玻璃、熔凝娃石、或石英)制成。用于单分子成像的固体表面材料是本领域中公知且常规使用的，并且用于单分子成像的相同固体表面材料也可以以阵列形式使用。然而，也可以使用其它材料(例如聚丙烯、聚苯乙烯、硅、氮化硅、和其它聚合物或其复合物)，只要它们适合于用于本文中描述的测序。图1B显示了一个“芯片上”实施方案，其中固体表面30还包含检测系统。这些类型的固体表面(例如CMOS和CCD)也是本领域中已知的，并且在下文更为详细讨论。
[0058]在将一种或多种生物学分子固定化到固体表面中前，一般将固体表面修饰(例如官能化)以接受和结合生物学分子。将固体表面官能化以固定化生物学酶的方法是本领域中已知的。在一些实施方案中，可以用铜或镍官能化固体表面，而在一些实施方案中，可以用 N1-NTA (参见例如 Paik et al.，2005, Chem.Commun.(Camb)，15:1956-8)或 Cu-NTA 官能化固体表面。或者，可以使用金属诸如钴等来修饰固体表面以进行固定化。
[0059]在修饰固体表面前,可以用例如PEG模块处理固体表面。可以使用此类策略来调节固体表面上RNA聚合酶的密度，而且还可以用于在固体表面上产生RNA聚合酶的样式，诸如RNA聚合酶的一致的、半有序的或随机的阵列。PEG环境导致酶和表面之间的最小程度相互作用(除了 N或C端的结合标签外)，最终对固定化酶的天然构象产生最小程度干扰。另外，表面钝化方法是本领域中公知的，并且可以包括例如用牛血清清蛋白(BSA)处理固体表面。
[0060]RNA聚合酶
[0061]本文中描述的旋转依赖性转录测序方法基于转录过程期间RNA聚合酶的作用和对转录的核酸产生的旋转力(参见例如US 2007/0077575)。虽然多亚基RNA聚合酶(例如大肠杆菌或其它原核RNA聚合酶或真核RNA聚合酶之一)可以在本文中描述的测序方法中使用，但是小的单亚基RNA聚合酶诸如那些来自噬菌体的RNA聚合酶是特别合适的。单亚基RNA聚合酶或编码此类酶的基因可以从T3、T7、SP6、或Kll噬菌体获得。
[0062]噬菌体RNA聚合酶与多种多亚基RNA聚合酶相比是非常进行性的且精确的，并且经常产生较少的缺失-插入误差。另外，来自噬菌体的RNA聚合酶与多亚基对应物诸如来自大肠杆菌的RNA聚合酶相比显著不太趋向于回溯。已经描述了来自几种不同噬菌体的RNA聚合酶。仅举例而言，T7RNA聚合酶由具有分子量99kDa的单一多肽构成，并且编码T7RNA聚合酶的基因的克隆和表达记载于美国专利N0.5，693，489。已经将T7RNA聚合酶的结构解析至3.3埃的水平，其中已经解析四种不同晶体结构:仅T7RNA聚合酶(未复合的)、与核酸启动子结合的T7RNA聚合酶、整个启动复合物(与核酸启动子和一种或多种转录因子结合的T7RNA聚合酶)、和由抑制剂结合的T7RNA聚合酶。
[0063]适合于用于本文中描述的方法的RNA聚合酶通常为掺入转录物中的每个核苷酸提供具有范围为亚微秒至100毫秒的持续时间的核酸旋转，但是也可以使用提供具有范围为每个核苷酸100毫秒多至几秒的持续时间的旋转的RNA聚合酶。本领域技术人员会理解，为了产生必需的旋转，RNA聚合酶必须转录双链核酸。
[0064]可以控制或操作固体表面上RNA聚合酶的密度和/或分布，例如以优选实施的特定测序反应。如本领域中已知的，可以以某种方式生成生物学分子的阵列。例如，可以将生物学分子的阵列在固体表面上随机分布，一致分布或以有序或半有序方式分布。在一些实施方案中，固体表面可以具有其上固定化的大于100个RNA聚合酶，或超过1000个RNA聚合酶(例如大于10，000个RNA聚合酶)。在一些实施方案中，固体表面每约5 μ m2可以具有固定化的至少一种RNA聚合酶(例如每约2.5 μ m2、约I μ m2、约0.5 μ m2、或约0.1 μ m2固定化的至少一种RNA聚合酶)。应当理解，固体表面上的RNA聚合酶密度可以至少部分取决于测序的靶核酸分子的大小及利用的特定旋转标签。
[0065]虽然本文中描述的测序方法依赖于RNA聚合酶转录期间产生的旋转，但是其它分子发动机可以与RNA聚合酶一起使用以产生旋转。分子发动机是消耗能量的生物学分子，其通常通过水解核苷酸三磷酸，并且将其转化成运动或机械功进行。分子发动机的例子包括但不限于解旋酶、拓扑异构酶、DNA聚合酶、肌球蛋白、ATP酶和GTP酶。在一些实施方案中，可以在固体表面上固定化分子发动机，并且可以靶核酸分子上在分子发动机和旋转标签之间的某个位置处发生RNA聚合酶的转录。在此类例子中，旋转方式会是分子发动机置于核酸分子上的任何旋转力及其组合的RNA聚合酶置于核酸分子上的旋转力的结果。作为酶促分子发动机的备选，例如可以与RNA聚合酶一起使用MS发动机，以产生旋转。
[0066]可以使用许多已 知手段在固体表面上固定化RNA聚合酶。例如，在一个实施方案中，RNA聚合酶含有His标签(例如具有4个His残基、6个His残基、或10个His残基的His标签)。可以使用His标签或其它合适的标签，只要它与上文讨论的表面化学(例如官能化)相容。
[0067]靶核酸分子
[0068]可以从实际上任何来源，包括真核生物、细菌和古细菌获得用于旋转依赖性转录测序的核酸分子。真核核酸可以来自人或其它哺乳动物(例如灵长类、马、牛、犬、猫、和啮齿类)或非哺乳动物(例如禽类、爬行动物(例如蛇、海龟、短吻鳄等)和鱼类)，而原核核酸可以来自细菌(例如病原性细菌，诸如但不限于链球菌属(streptococcus)、大肠杆菌(E.coli)、假单胞菌属(Pseudomonas)、和沙门氏菌属(Salmonella))或古细菌(例如泉古菌(Crenarchaeota)和广古菌(Euryarchaeota))。
[0069]许多生物学样品内可以含有用于旋转依赖性转录测序的核酸分子。代表性生物学样品包括但不限于流体(例如血液、尿液、精液)和组织(例如器官、皮肤、粘膜、和肿瘤)。
[0070]如本文中讨论的，本文中描述的旋转依赖性转录测序方法的优点之一是使用双链核酸作为模板。这降低对操作样品和核酸的需要，这特别在测序长度大于I千碱基(Kb ;例如大于2Kb、大于5Kb、大于10Kb、大于20Kb、或大于50Kb)的核酸时是相当大的优点，因为用于从生物学样品获得核酸的许多方法导致对核酸的不想要的切割、剪切或破坏。明显地，可以在本方法中使用单链核酸(或含有单链核酸的样品)。然而，必须将此类单链核酸转化成双链核酸以在转录期间展现出旋转。生成双链核酸的方法是本领域中公知的，并且会取决于单链核酸(例如DNA或RNA)的性质。此类方法通常包括使用公知的DNA聚合酶和/或逆转录酶。
[0071]样品制备会取决于来源，但是通常包括核酸分离，接着进行启动子连接。本文中描述的测序方法中使用的核酸模板不需要任何特殊的制备，如此可以使用标准的DNA分离方法。最终，必须将转录测序系统中使用的特定RNA聚合酶识别的启动子序列与靶核酸分子连接。众多RNA聚合酶识别的启动子序列是本领域中已知的且广泛使用的。另外，连接一种核酸分子(例如启动子序列)与另一种核酸分子(例如具有未知序列的祀核酸分子)的方法是本领域中公知的，并且许多酶连接酶是商品化的。
[0072]另外，任选地，分离的核酸可以是片段化的，并且若想要的话，可以将特定大小选择或分级。例如，可以使用超声处理将分离的核酸片段化，并且若想要的话，使用常规的凝胶电泳方法进行大小选择 。
[0073]另外，任选地，可以例如将靶核酸环化成质粒，从而可以以重复或循环方式对环状靶物实施测序。
[0074]旋转标签
[0075]对于本文中描述的旋转依赖性转录测序方法，测序的靶核酸分子包括与其结合的旋转标签。将此类标签固定于核酸，使得它在RNA聚合酶对核酸赋予的转矩下旋转。旋转标签可以大到多个微米(例如大于I微米、2微米、3微米或5微米)的直径且小到纳米(例如约50nm、100nm、250nm、500nm、750nm、850nm、或950nm)的直径。如本文中使用的，旋转标签可以是非球形的或球形的；然而，若旋转标签是单球，则它必须具有可以用于检测旋转的一些非一致特征。
[0076]非球形标签可以包括不是球形(例如锥形棒、三角形、圆锥、或蛋形)的单一模块。另外，非球形标签可以使用两个(或更多个)不同大小球形标签(例如附接于第二标签的第一标签)生成，所述不同大小球形标签一起提供容许检测旋转的不对称性。在一些实施方案中，第一和第二标签可以是相同的或基本上相同的大小。例如，可以认为与靶核酸分子拴系的第一标签是参照标签，而可以认为与第一标签附接的第二标签是旋转标签。在一些实施方案中，与靶核酸分子拴系的第一标签较大，而与第一标签附接的第二标签较小。此构造尽可能远离第一标签的旋转点放置第二标签，这增强光学检测下的旋转分辨率。如此，较小标签的大小对于检测目的必须足够大，但是小得足以使由于总体旋转标签大小所致的流体力学效应最小化。
[0077]例如，在一些实施方案中，旋转标签可以包括较大的珠(例如直径为约I微米多至约3微米)作为第一标签和较小的珠(例如直径为约0.5微米多至约I微米)作为第二标签。例如，较大的珠可以是0.75或I微米，而较小的珠可以是0.5微米。这些大小足够解析旋转(如下文更为详细描述的，使用例如光学系统进行，其包含具有与I倍管式透镜组合的0.75数值孔径的50倍放大率Mitutoyo物镜和6.5微米像素尺寸或更小的科学CMOS照相机)。在一些实施方案中，第一标签可以是直径0.75微米，而第二标签可以是直径0.35微米。这些大小也足以解析旋转(如下文更为详细描述的，使用例如具有0.9或更高的数值孔径的100倍物镜使用科学CMOS照相机进行)。
[0078]例如第一标签和第二标签之间的附接可以是机械系链或连接(例如链霉抗生物素蛋白-生物素键)、化学键(例如胺或羧基)、磁引力、或其任何组合。在一些实施方案中，可以经由例如聚合反应将第一标签和第二标签彼此互补附接。
[0079]另一个方面，旋转标签可以是球形的，只要可以检出其旋转。使用球形的旋转标签降低或消除通过非球形旋转标签创建的非线性动力学，并且球形旋转标签会比非球形旋转标签展现出更低的旋转期间的流体动力学阻力。可以用于检测旋转的具有非一致特征的球形标签的一个例子是Janus珠。参见例如Casagrande et al.(1989, Europhys.Lett.9:251)。Janus珠指如下的球形珠,其中由于球体的一半的镍包被,一个半球是疏水的，而另一个半球是亲水的。半球的不同特征容许检测旋转，即使在旋转标签是球形时。
[0080]在本文中讨论的一些实施方案中，旋转标签可以是磁性的。磁性标签(球形的或非球形的)是本领域中公知的，并且可以为磁性珠、棒、或其它磁性模块诸如但不限于超顺磁性颗粒的形式。整个旋转标签可以是磁性的，或者仅旋转标签的一部分可以是磁性的。例如，在一些实施方案中，仅旋转标签的第一标签可以是磁性的。磁性标签存在着许多商业来源。以下段落描述了可以生成磁性旋转标签以用于本文中描述的测序方法的许多方式。
[0081]在一些实施方案中，可以将纳米磁性溶液(例如具有钴的甲苯或二甲苯中的1%w/v，或甲苯或二甲苯中的Fe3o4或FePt)应用于普通的聚合珠以使它们变为磁性的。在一些实施方案中，可以将纳米磁性材料应用于聚合物珠表面的一半。这生成磁珠，其半部展现出不同折射率或其它光学特性(例如散射)。在一些实施方案中，可以用纳米银墨包被超顺磁性颗粒(或颗粒的一半)以创建光学发射的且完全超顺磁性珠。在这些实施方案中，可以与此类“墨”(例如PRIMAXX) —起使用沉积和蒸发过程以对磁性颗粒或磁性颗粒的部分赋予特定光学特性。在一些实施方案中，可以用量子点包被超顺磁性颗粒(或颗粒的一半)以对已经有磁性的颗粒赋予特定光学特性。在一些实施方案中，可以使用磁铬颗粒作为旋转标签。在磁铬颗粒内，纳米磁体形成聚合物内或碳壳中包囊的链。纳米颗粒的链使用外部磁场或电磁场相对于彼此对准。在光从颗粒散射时，对齐的链起布拉格衍射光栅作用，并且以合适的限定方向使光散射。磁铬颗粒粒在外部场内侧旋转，使得可以在所有链对齐的停止颗粒和链没有完全对齐的旋转颗粒之间监测强度调控，以测定从开始位置至静止或停止位置的旋转持续时间，直到下一次旋转。
[0082]在一些实施方案中，可以将第一磁性标签与可以将电场变化感应到检测仪上的第二标签组合。此类电标签是本领域中已知的，并且可以是聚合球，其包含金属元素，是带电荷的，或者是微米大小射频振荡器，该微米大小射频振荡器感应可以在仪器(下文更为详细描述)上捕获的磁场或电场变化。
[0083]仅提供空间透视图且不限于任何特定的大小或距离限制，旋转标签的底部表面即使在转录IOKb核酸分子时距离固体表面的顶部仍可以仅是3 μ m。也就是说，旋转标签即使在转录开始时非常接近固体表面。在转录结束时，旋转标签可以几乎接触酶RNA聚合酶，并且因此与固体表面顶部分开非常小的距离。换言之，具有2 μ m直径的旋转标签会与转录的核酸分子是大致相同大小的。本领域技术人员会理解，RNA聚合酶转录靶核酸分子可以以相反方向进行，由此使旋转标签在转录期间更快地远离固体表面移动。
[0084]可以使用系链(tether)将旋转标签与靶核酸分子附接。将旋转标签与靶核酸分子附接的系链是本领域中已知的，并且包括但不限于化学连接(例如交联、范德华(van derWalls)或氢键)或蛋白质连接(例如生物素-链霉抗生物素蛋白结合对、洋地黄毒苷和识别抗体、肼键合或加His标签)。例如，在一些实施方案中，可以至少部分用链霉抗生物素蛋白包被旋转标签，而可以将生物素化的核酸系链与靶核酸分子连接。在一些实施方案中，可以将经生物素标记的核酸(例如约500个碱基对(bp))与靶核酸分子的一端连接。然后，可以将具有经生物素标记的系链的靶核酸分子与经链霉抗生物素蛋白包被的旋转标签组合。存在有许多商品化标签，包括用多种化学包被或部分包被的磁性标签，其可以用于拴系靶核酸分子和 / 或结合第二标签(例如 Dynal, Invitrogen, Spherotech, Kisker Inc., BangsLaboratories Inc.)。[0085]对核酸分子的张力
[0086]在一些实施方案中，本文中描述的旋转依赖性转录测序方法包括对靶核酸分子应用定向力，这导致靶核酸分子置于某种量的张力下。对靶核酸分子的张力在较长靶核酸分子的情况中变得重要，因为较长的核酸分子可以自身折叠起来或折叠。靶核酸分子的任何类型的异常螺旋结构可以抑制或掩盖从RNA聚合酶转移至旋转标签的转矩。
[0087]对靶核酸分子应用的定向力需要是足够的，从而维持靶核酸分子(特别是在转录复合物的下游，且特别是在旋转标签远离RNA聚合酶为几千至几十万个核苷酸时)的双链螺旋性质。然而，对靶核酸分子应用的定向力不能那么强(即，应用那么多张力)，使得以任何方式阻碍旋转标签的旋转或者靶核酸分子的主链断裂。对靶核酸分子的此类张力还可以降低旋转标签的布朗运动或其它噪声效应(例如热流质喷管噪声效应)，由此提高检测旋转标签旋转方式的准确性。
[0088]张力意图在以力的规定量和三维空间中的规定位置向上提升核酸拴系的旋转标签且使其远离表面。张力的方向可以相对于固体表面的平面(即在X轴中)基本上以90°角(即在z轴中)延伸靶核酸，但是定向力还可以以相对于固体表面平面大于或小于90°的方向延伸靶核酸分子。然而，会理解旋转标签不能如此接近固体表面，使得表面(例如由于表面化学或表面流控现象所致)干扰(例如变化、改变、抑制、降低、消除)旋转标签运动的转矩概况和/或方式作为RNA聚合酶活性的信号。
[0089]在一些实施方案中，张力来源(或定向力来源)可以是磁体。在此类情况中，旋转标签或旋转标签的部分 可以是磁性的。如本文中指示的，磁性标签(例如珠、棒等)是本领域中公知的。例如，可以应用磁力，其以例如约IpN的量级在z轴方向中提供一致的空间力，以足够伸展靶核酸分子并避免任何成环。同时，此类磁体仅在X轴方向中产生微小的力。这些特征容许旋转标签自由旋转，而稳定化旋转标签的任何布朗运动。在一些实施方案中，张力来源可以是例如液体(例如水或缓冲液)或空气的定向流动的结果。
[0090]可以使用标准流控方法来校准对靶核酸分子应用的张力量，并将其并入数据获取和分析方法或碱基呼叫算法中。例如，此类校准可以包括在表面上的多个位置、以相对于表面平面的多个角度、和/或在不同流或磁场中监测与由RNA聚合酶(其在表面上固定化)转录的核酸分子附接的旋转标签的布朗运动。
[0091]仅提供空间透视图且不限于任何特定的大小或距离限制，在一个芯片上实施方案中，旋转标签在应用张力时可以为表面上的I微米级。例如，由于每个碱基与接着的碱基以
0.3nm分开，在表面上与RNA聚合酶附接的IKb核酸分子在距表面约300nm的距离处在另一端会具有旋转标签。可以使用但不限于RNA聚合酶对固体表面的不同固定化方法和不同长度的核酸(例如启动子序列、系链序列)改变此距离。本文中描述的旋转依赖性转录测序可以适应如下的情况，其中旋转标签距表面为IOnm至多微米。
[0092]图2显示了应用磁场之前(图2A)和之后(图2B)的2.7微米磁珠。
[0093]检测方法
[0094]在本文中描述的旋转依赖性转录测序方法中在多种测序条件下检测旋转标签的旋转方式需要光源(用于将光投射到旋转标签上)和光学器件(用于显现旋转标签，并观察旋转方式的变化)。虽然可以在本文中描述的旋转依赖性转录测序方法中使用许多合适的照明方法和光学器件，但是以下实施方案作为本系统和方法的简单性及缺乏检测元件的复杂且昂贵技术的任何需要的例子提供。
[0095]光源可以是LED，或者光源可以是白光或单或多光纤。光源可以是稳定照明或者可以以脉冲照明(在想要时)提供。可以从相同方向或从多个方向投射光。例如，光源可以是聚合物光纤或束，其可以是可调的(例如在强度和/或光谱方面)。可以基于旋转标签的大小及其与检测仪的距离使用菲涅耳衍射和/或FraunhofTer衍射，以鉴定旋转标签(例如旋转标签的形状)并鉴定其旋转。
[0096]光学器件可以是简单透镜和物镜(例如具有50倍物镜的显微镜透镜，例如具有数值孔径0.75的Mitutoyo 50x)和具有I倍放大率的管式透镜。光学器件还可以包含以每秒合适的帧运行的照相机(例如摄像机，例如科学CMOS)。或者，光学器件可以利用电流互补金属氧化物半导体(CMOS)或电荷耦合装置(CCD)技术，只要它们具有足够数据的像素(且只要光源提供足够的光子以对旋转标签的旋转成像)。目前使用的CMOS检测仪是非常快的(例如每秒1000或更多帧，其对应于Im或更小的暴露)。检测仪速度的此水平消除任何模糊度，这是由于困扰目前方法的快速核苷酸掺入的随机性质所致。例如，许多目前的方法(例如 Pacific Biosciences, Complete Genomics, Inc.)通常受限于 IOms 或更长的暴露，这是由于需要在照相机暴露窗内收集足够数目的荧光光子所致，这导致收集的序列数据中的错误。
[0097]与其它测序技术(例如Pacific Biosciences, Complete Genomics Inc.,和其它依赖于高通量图像捕获的单分子荧光或大体荧光的技术)相比，成像检测仪使用小像素尺寸的能力是本方法的另一个优点。与6.5微米相比(其在其它实时测序应用中使用的CMOS传感器的现有技术)，本文中描述的旋转依赖性转录测序可以使用较小的像素尺寸(例如
1.4微米，其是行动电话照相机的现有技术)。这主要是因为本测序方法可以比其它系统适应更多噪音。显著地，在本文中描述的旋转依赖性转录测序中，成像通量可以由于使用具有小像素(例如下一代行动电话中 常见的8-10M像素)的大传感器的能力以及通过对较大的表面积成像而可以是高得多的。与行业中的其它测序系统(其取决于专门的光学平台(例如ChemFet, 1n Torrent))相反,用于本文中描述的旋转依赖性转录测序方法的检测方法容许使用仅对软件具有改良的商业CMOS照相机硬件。
[0098]以视频模式自这些传感器的数据获取方法通常使用每个像素的强度数值(例如使用RAW形式数据进行)。在光源是白色LED或在颜色间具有合适平衡的RGB照明器，会在相邻像素中记录旋转标签的衍射和阴影方式，并且可以产生图像，就像传感器是黑白传感器。例如，例如可以在检测仪的像素上记录非球形旋转标签的直接阴影或衍射，并且由于对衍射的影响变化而检出旋转。
[0099]仅举例而言，可以如下发生旋转的检测(例如通过旋转标签检测旋转样式)。可以使用例如LED或光线偶联的LED或LED阵列从上方照明旋转标签。在固体表面流动池下，无限远校正的具有数值孔径0.75的Mitutoyo 50倍物镜可以与将视场成像到科学CMOS芯片(例如具有5.5MP，各约6.5微米大小的像素间有6.5微米中心间距离)上的管式透镜一起使用。将10x10像素归入每个旋转标签，此类像素尺寸足以检测I微米珠的旋转，所述I微米珠在整个CMOS表面上可以产生超过55，000个旋转标签。若每个旋转标签与5Kb靶核酸分子附接，则本文中描述的旋转依赖性转录测序可以在单一芯片上在每个运行中对超过275M碱基测序。作为比较，大肠杆菌基因组是4.5M碱基。若转录速率是每秒10个核苷酸(其是关于固定化RNA聚合酶的合理数目)，可以在500秒，即小于10分钟中对完整的大肠杆菌基因组测序，如本文中描述的。具有每秒记录多至100帧(即每个转录的核苷酸为10帧)的能力的检测仪对于本文中描述的测序系统和方法是足够的。上述计算不包括附接的任何效率。另外，在异步测序样式中，假设RNA聚合酶引起的暂停小于10帧，它没有将任何额外的反应时间添加至上述计算，然而异步测序样式在将速率限制核苷三磷酸调到低得多的水平(例如以提高精确性并使缺失误差最小化)时将时间添加至反应。
[0100]以下是检测旋转标签旋转方式的另一个例子。可以使用LED或光纤偶联的LED或LED阵列照明旋转标签，其中将旋转依赖性转录测序复合物置于锥形波导上，所述渐变波导具有一侧的350nm核心大小和另一侧的6.5微米核心大小(约1:19锥度)，其可以与科学CMOS芯片(例如Fairchild Imaging)的表面键合。此类芯片具有5.5M像素，各约6.5微米的像素间具有6.5微米中心间距离。在此情况中，将3x3像素归入每个旋转标签(其足以检测350nm核心上I微米珠的旋转)容许此类芯片上的超过610，000个旋转标签。若将每个旋转标签与5Kb靶核酸分子附接，则可以在单一芯片上在单次运行中测序总共超过3G碱基。这基本上是整个人基因组的单一覆盖。上述计算不考虑附接效率、信号从锥度的圆形核心至正方形像素的舍入效应(rounding effect)、或由于核心至像素的连接过程中的错配所致的像素损失。
[0101]以下是在高通量测序系统中检测旋转方式的例子。例如，替代使用上述例子中描述的渐变波导和科学CMOS传感器，可以在取出检测仪窗并在芯片的微型透镜阵列上直接附接旋转依赖性转录测序复合物的一种或多种组分后使用OmniVision Inc.芯片，其具有例如14.5MP和每个像素1.2微米。可以使用视频信号加工在2x2像素上检测使用2.8微米旋转标签的旋转样式。对于彼此相邻的旋转标签阵列容许每个方向中额外的2个像素，可以对每个旋转标签分配 总共8个像素。在此情况中，单一芯片可以具有超过180万个与测序的靶核酸分子附接的旋转标签。因此，这些中的三种芯片对于对完整的人基因组测序会是足够的，而四种芯片可以显著提高精确性。可以使用基于FPGA或其它DSP设计以足够的速度产生此传感器的读出(例如以匹配特定芯片的核苷酸掺入速率)的电子学和固态驱动器阵列的直接存储，并且其组件是本领域中已知的。
[0102]仅举例而言，可以如下发生旋转的检测。可以使用LED结构的照明(例如具有4倍透镜的Lightspeed基因组模块，其适合于无斑点激发)来在SciCMOS照相机(例如每秒100帧的5.5MP)的表面上创建旋转标签的衍射窗。干扰样式可以利用每个图像5帧，以将分辨率增强9倍，这有效创建20fps的49MP传感器。可以将每个单分子归入例如5x5像素，其容许每个芯片约200万个旋转标签。假设标签间偶联方面的泊松效率，660，000个各转录5Kb核酸分子的可用单一 RNA聚合酶分子导致单次运行中可测序的3.3G碱基。在异步测序方法中，可以实施四种反应(虽然在一些实施方案中，实施三种反应，并且从用其它三种核苷三磷酸获得的测序信息推断第四种核苷酸)。考虑到每次酶暂停的5帧，每次暂停总共250ms，虽然聚合酶在其它情况中每秒掺入15nt，但是通量是每小时的极限值18Gb。此测序速率显著高于任何目前的技术，即使用于短阅读长度。如本文中指示的，目前的行动电话照相机技术(10MP，1.2 μ m像素尺寸)满足此系统的要求。
[0103]类似地，颜色(例如用传感器上的RGB滤光涂层(filter coating)得到)或单色行动电话或数字照相机传感器满足在本文中描述的测序方法和系统中使用的要求(例如14.5MP和1.25微米像素传感器)。即使RGB传感器的每个像素以某种样式用红色或绿色或蓝色滤器包被，那些传感器可以在本文中描述的测序系统和方法中使用，因为本文中描述的测序系统和方法中使用的光源可以具有宽的光谱(例如白色LED)，并且对照相机芯片的检测仪部分(例如硅)提供散射的、反射的、衍射的或透射的光学信号。
[0104]在此例子中，可以通过旋转标签的阴影或衍射评估用于检测每个旋转标签的像素数目。在使用直接光照明替代荧光激发时，阻断激发光和/或具有荧光通带的厚光学滤器不是必要的。这些滤器可以厚几百微米，其可以使在芯片上检测仪上少量像素上收集荧光需要的光学设计复杂化。在少量像素上收集光是重要的，因为测序系统通量的一个方面通过用检测仪上的像素总数除以归入每个位置或事件的像素数目限定。例如，凭借1-Phone型8MP CMOS传感器，假设每个位置10个像素，容许总共800，000个位置。若每个位置每次运行平均测序IKb核酸,则通量至多是每次运行800M碱基。使用Fraunhoffer衍射和距离I微米的3微米珠，则可以在不需要具有复杂的光学设计的透镜的情况中使用每个位置小于10个像素。[0105]在一个实施方案中，可以提供张力来源，其容许旋转标签阵列从表面升高至例如大于4x4mm2的面积。本方法和系统不受限于视场(FOV)，特别是在芯片上实施测序时，其中有效FOV是芯片的整个面积。例如，Omnivision 14MP传感器的表面积是约6x4mm。
[0106]如本文中指示的，通过本文中描述的旋转依赖性转录测序方法提供的许多优点之一是由于RNA聚合酶的随机性质所致的其极快的核苷酸掺入。然而，高掺入速率及所致的旋转速度可以使数据捕获变为考验性的。本领域技术人员应当理解，在目前描述的异步测序方法中，例如，仅“端点”信息需要记录，例如，仅发生暂停前的总旋转数目。也就是说，不需要捕获个别掺入步骤，其对于简单检测仪有效成像可以是非常快速且困难的。因此，只要以足够高的帧率记录测序反应以检测由RNA聚合酶引起的暂停(由于核苷三磷酸以速率限制量存在所致)间的旋转总量，可以测定精确的核酸序列。
[0107]在一些实施方案中，可以使用GMR(:巨磁电阻)阵列作为传感器捕获磁性旋转标签的旋转方式。在一些实施方案中，可以使用自旋阀阵列或MRAM来检测磁性旋转标签的旋转方式。例如，可以将计算机存储器阵列(例如RAM，例如DRAM)修改(例如抛光(polish)以从表面除去可以屏蔽磁场效应的层)，从而接受接近存储单元电容元件的表面修改。可以通过RAM的存储单元(cell)/电容器的二维阵列感测磁性旋转标签的感应电场。然后，可以在将存储器安装到计算机中后使用存储器阅读软件直接读取RAM阵列的存储单元。在使用MRAM作为传感器的情况中，可以在没有使用磁场的情况中使用流来对靶核酸提供张力来源。或者，在修改MRAM单元的感测信号的情况中可以使用磁场作为场中的张力来源。
[0108]测序备件
[0109]再次参照图1A，可以以许多不同方式生成旋转依赖性转录复合物100。例如，可以对具有其上固定化的RNA聚合酶20的固体表面30提供启动子结合的靶核酸分子10。在此实施方案中，可以在将靶核酸分子10与固定化RNA聚合酶20复合之前或之后将旋转标签40结合到靶核酸分子10。在另一个例子中，可以将RNA聚合酶20和启动子结合的靶核酸分子10组合，然后在固体表面30上沉积。如指示的，可以在将复合物在固体表面30上沉积之前或之后将旋转标签40结合到启动子结合的靶核酸分子10。在另一个例子中，可以将旋转标签40与启动子结合的靶核酸分子10附接，并与RNA聚合酶20接触。可以在引入加旋转标签的靶核酸分子10前在固体基片30上沉积RNA聚合酶20，或者将整个复合物在固体基片30上沉积并固定化。
[0110]可以以异步(即速率限制)模式(图3A)或同步(即碱基接碱基)模式，或其任何组合实施本文中描述的旋转依赖性转录测序以测定靶核酸分子的序列(图3B)。如本文中使用的，“测序条件”至少指存在至少一种核苷三磷酸，其可以如下文描述的那样使用以测定靶核酸分子的序列。
[0111]在如本文中更为详细讨论的存在至少一种核苷三磷酸外，实施测序反应的条件是本领域中公知的。例如，可以使用合适的缓冲液组分(例如KC1、TriS-HCl, MgCl2, DTT、Tween-20、BSA)来提供适合于酶的环境。
[0112]a)异步测序
[0113]可以使用本文中描述的旋转依赖性转录测序方法基于核苷酸的异步掺入来对核酸测序。对于异步实施方案，发生初始反应的测序条件(即第一测序条件)包括存在四种核苷三磷酸，其中核苷三磷酸以不同量存在，至少一种所述量是速率限制的，且至少一种所述量不是速率限制的。例如，四种核苷三磷酸之一以速率限制量提供(例如以小于其它三种核苷三磷酸量的量)。在此类反应中，RNA聚合酶在每次它设法将以速率限制量提供的核苷三磷酸掺入转录物中会有效暂停，并且此类暂停可以在旋转标签的旋转方式中观察到，如本文中描述的。
[0114]显著地，可以通过检测暂停间的旋转累积量精确测定每次暂停间的碱基数目。如此，在以速率限制量提供G核苷三磷酸时由于旋转方式的变化可以精确测定例如每个鸟嘌呤(G)核苷酸沿着靶核酸分子序列的精确位置。可以在第二、第三和在想要时第四测序条件下实施类似的反应，其中四种核苷三磷酸的第二、第三和第四核苷三磷酸分别以速率限制量存在。如图4中显示的， 来自四种反应(无论它们彼此同时或彼此之后序贯实施)的组合信息提供靶核酸分子的完整序列。
[0115]可以将即使来自产生四种核苷酸之一的位置序列的单一结果的样式与核酸数据库比较，并用于鉴定具有高水平置信度的核酸分子。另外，本领域技术人员应当领会，可以使用从四种核苷三磷酸之三种产生的位置信息汇编靶核酸分子的序列，因为序列中第四种核苷酸的位置信息在知道其它三种核苷酸后可以推断。
[0116]b)同步或碱基接碱基测序
[0117]可以使用本文中描述的旋转依赖性转录测序方法来以同步样式(其在其它情况中可以称为喊基接喊基测序)对核酸测序。对于同步或喊基接喊基实施方案，发生初始反应的测序条件(即第一测序条件)包括存在单一核苷三磷酸。在此类反应中，RNA聚合酶的转录仅会在靶核酸含有所述位置处的互补碱基时进行，这可以以旋转标签的旋转方式变化观察到，如本文中描述的。基于双螺旋的结构特征，RNA聚合酶掺入I个核苷酸导致约36旋转。继续此类反应条件，直到旋转标签的旋转方式不改变。应当理解，可以使用旋转方式的累积变化来精确测定第一核苷三磷酸序贯掺入转录物中(例如在靶核酸分子的同聚合区中)的次数。
[0118]在第一测序条件(即存在四种核苷三磷酸的第一核苷三磷酸)下对旋转标签的旋转方式不再观察到变化时，或者若在第一测序条件下没有观察到旋转方式变化，在第二测序条件下实施反应。第二测序条件包括存在四种核苷三磷酸的第二核苷三磷酸。旋转标签的旋转方式变化指示转录(即RNA聚合酶将存在的一种或多种特定核苷三磷酸掺入转录物中)，而缺乏旋转标签的旋转方式变化指示不发生转录。
[0119] 可以以如下的方式实施第一测序条件、第二测序条件、第三测序条件(即存在四种核苷三磷酸的第三核苷三磷酸)或第四测序条件(即存在四种核苷三磷酸的第四核苷三磷酸)下的此类反应，使得基于每种相应测序条件下旋转标签旋转的旋转方式和/或积累角度变化序贯测定靶核酸分子的序列。本领域技术人员会理解，可以在引入不同测序条件前采取步骤来除去一种测序条件下的残留核苷三磷酸。例如，可以在引入不同测序条件前将固定化有RNA聚合酶的表面清洗或冲洗。虽然此类清洗步骤不是需要的，但是应当理解，此类捕捉会提高所得序列信息的准确度。
[0120]c)别的测序方法
[0121]本文中描述的旋转依赖性转录测序方法适合于许多不同变化及常规修改，其可以例如用于例如但不限于提高测序信息的准确度并提高测序反应中获得的信息量。
[0122]例如，许多RNA聚合酶拥有“链转换”或“回转转录”能力。此特征可以在本文中描述的方法中有利使用以提高所得序列信息的准确度。例如，在RNA聚合酶达到靶核酸末端时，RNA聚合酶可以“跳跃”到相反链，并继续转录。参见例如McAllister atal.(US 2007/0077575)和 Rong et al.(1998，“Template Strand Switching by T7RNAPolymerase”，J.Biol..Chem.，273 (17): 10253-60)。另外，某些 RNA 聚合酶可以从双链的DNA模板“跳跃”到杂合DNA-RNA转录物，并恢复DNA链的转录。另外，靶核酸分子的此类循环测序可以通过将RNA聚合酶启动子引入(例如连接)到靶核酸分子的每个末端上，从而RNA聚合酶结合并转录相反链来遗传工程化改造。
[0123]另外，可以将一个或多个不同RNA聚合酶(例如来自不同生物体的RNA聚合酶或来自相同生物体的不同RNA聚合酶)固定化到固体表面上。如本领域中已知的，不同RNA聚合酶识别并结合不同启动子序列。因此，可以将一个或多个不同RNA聚合酶启动子与不同靶核酸分子群体连接，并且使用固体表面上固定化的一个或多个不同RNA聚合酶，基于旋转标签的旋转方式测序组合的靶核酸分子群体。通过差别标记例如不同RNA聚合酶或不同靶核酸分子群体(使用例如发射不同波长的珠、荧光标签、或经荧光标记的抗体)，可以将一个靶核酸分子群体的序列与另一个靶核酸分子群体的序列区别。使用此类方法，对不同靶核酸分子群体的测序反应可以同时发生。
[0124]在一些实施方案中，可以将RNA聚合酶和靶核酸分子群体两者差别标记。应当理解，可以直接经由核酸或者例如经由旋转标签发生对靶核酸分子标记。可以使用在多个测序反应水平差别标记的此能力，例如以比较不同RNA聚合酶在具有相同序列的靶核酸分子上的持续合成能力(processivity),其可以鉴定例如同聚合区或甲基化区，或者比较超过一种RNA聚合酶对具有不同序列的祀核酸分子的转录。
[0125]仅举例而言，与合适的核酸启动子序列一起的酶RNA聚合酶(例如来自T7、T3、SP6或Kll噬菌体中的一种或多种)的任何组合可以在本文中描述的旋转依赖性转录测序方法中使用。如本文中讨论的，此特征容许测序反应的多路复用。本文中涵盖利用与其特定启动子序列引起的不同RNA聚合酶以及不同标记技术的其它变型。
[0126]在一些实施方案中，可以在相同测序条件(例如第一测序条件)下实施两种异步旋转依赖性转录测序反应。一旦测序已经进行足够数目的核苷酸(例如至少IOOnt, 500nt, I, OOOnt, 5，OOOnt,或10，OOOnt)，可以改变反应之一的测序条件(例如改变
为第二测序条件)，并继续旋转依赖性转录测序。可以使用第一测序条件下获得的所得序列信息来将第一反应中的特定靶核酸分子与第二反应中相同特定靶核酸分子比对，所述第二反应在改变测序条件时容许对特定靶核酸分子内的两个核苷酸获得位置序列信息。
[0127]本领域技术人员会理解，由于RNA聚合酶对核酸分子的扭转位置，旋转标签可以产生“载荷”，这有可能减速RNA聚合酶。这可以得到阻止或降低，例如，通过使用具有不同形状的旋转标签(例如两个长方形珠或珠-棒组合)进行，其可以比简单球形珠在流体介质中产生更多摩擦。另一方面，可以有RNA聚合酶和/或测序条件，其中可以使用RNA聚合酶的机械载荷来有利影响测序速率。
[0128]制品/试剂盒
[0129]本文中提供了制品(例如试剂盒)。制品可以包含如本文中讨论的固体基片，其上固定有多个酶RNA聚合酶。多个酶RNA聚合酶指至少10个RNA聚合酶(例如至少20、
50、75、或100个酶)、至少100个RNA聚合酶(例如至少200、500、或I, 000个酶)或至少
I,000个RNA聚合酶(例如至少约2，500,5, 000、10，000、或50，000个酶)。
[0130]制品是本领域中公知的，并且可以包含包装材料(例如泡罩包装、瓶、管、管形瓶或容器)，并且在具有其上固定化的RNA聚合酶的固体表面外，可以包含一种或多种别的组分。
[0131]在一些实施方案中，制品可以包含旋转标签。如本文中描述的，旋转标签可以是非球形标签或球形标签，其 具有可以用于检测旋转的非一致特征。
[0132]在一些实施方案中，制品可以包含与RNA聚合酶启动子对应的核酸序列。如本文中讨论的，指导RNA聚合酶转录的启动子是本领域中公知且常规使用的。
[0133]在一些实施方案中，制品可以包含系链。如本文中讨论的，可以将系链将靶核酸分子与旋转标签附接。在一些实施方案中，系链包含核酸序列，其例如可以生物素化，使得它们结合经链霉抗生物素蛋白标记的珠。
[0134]在一些实施方案中，制品可以包含一种或多种核苷三磷酸。在提供超过一种核苷三磷酸时，它们可以组合(例如在单一容器中)或分开(例如在不同容器中)提供。
[0135]在一些实施方案中，制品进一步包含用法说明书。用法说明书可以以纸形式或者以多种电子形式(例如例如CD或闪盘驱动器上的电子文件，或指向因特网上的位置(例如链接)提供。可以使用此类用法说明书经由磁性参照标签鉴定旋转标签相对于轴的旋转，基于旋转方式和核苷三磷酸的存在汇编靶核酸分子的序列；和/或对核酸应用合适的张力。
[0136]旋转依赖性转录测序系统
[0137]如本文中描述的旋转依赖性转录测序系统至少包括测序模块。用于对靶核酸分子测序的测序模块通常包含用于接收固体基片的接收器(receptacle)、用于提供定向力的张力来源、用于将光投射至旋转标签上的光源、和用于检测旋转标签的旋转样式的光学器件。本文中讨论了张力来源、光源、和光学器件。可以将用于接收固体基片的接收器配置为例如凹进室。一般地，用于旋转依赖性转录测序系统中使用的固体基片会具有其上固定化的多个RNA聚合酶，并且对于高通量测序系统，固体表面可以是芯片上实施方案，如本文中描述的。测序模块还可以包含计算机处理器或与计算机处理器形成接口的手段。此外，可以提供主要分析软件作为测序模块的部分。
[0138]另外，测序模块可以进一步包含加热和冷却元件及温度控制系统，用于改变和调节测序反应的温度。另外，测序模块可以进一步包含流质喷管(例如一种或多种试剂或缓冲液储器和管道，用于将一种或多种试剂或缓冲液投递至反应室(例如芯片))。用于投递一种或多种试剂或缓冲液的流质喷管还可以包含但不限于至少一种泵。不作为限制，可以在测序反应中使用的例示性试剂可以包括例如核苷三磷酸、酶(RNA聚合酶)和旋转标签。也不作为限制，可以在测序反应中使用的例示性缓冲液可以包括例如清洗缓冲液、酶结合缓冲液和测序缓冲液。
[0139]图5是显示代表性流动池70的示意图。在显示的流动池70中，在OmniVision传感器(0V14810 ;在取出并用SiN包被窗后)的顶部放置厚约50微米的激光切割压力敏感性粘合剂(PSA)膜。此构造在CMOS芯片80顶部产生流动池。然后，应用玻璃或聚合载玻片，其具有用于微流质喷管馈通管90的洞。在场中显示了多个旋转依赖性转录复合物100。图6显示了代表性流动池70的照片(小图A)和线条画(小图B)，其中使用光纤60来投递光，并使用显微镜物镜200进行成像。还显示了固体表面30。
[0140]图7是显示旋转依赖性转录测序系统300的示意图。示意图显示了张力来源50、光源60、和具有进(in-)和出流质喷管(out-fluidics)90的流动池70。在芯片80(例如CMOS、(XD、或其改良型式)上显示图7中的流动池70。
[0141]图8A和9A显示了如本文中描述的旋转依赖性转录测序系统300的不同实施方案的照片，而图8B和9B是每幅照片中显示的实施方案的相应线条画。参照图SB和9B，旋转依赖性转录测序系统300都显示固体表面30、光源60、和流质喷管90，用于投递和除去多种试剂和/或缓冲液。在图8和9的每幅中显示了张力来源50 ;在图9中，将张力来源50移出较容易接近固体表面30 上的流动池的路线。图8和9中的旋转依赖性转录测序系统300都利用相似的光学器件200。图8中的系统300利用20倍水物镜200 (在这里，来自Olympus的“超级透镜(super-lens) ”,其提供超过Imm FOV及NA=0.9,即高分辨率及较大视场)，并且图9中的系统300利用20倍物镜管式透镜200。图8和9两者还包含照相机200。
[0142]在一个实施方案中，如下可以在旋转依赖性转录测序系统中使用结构化照明和频闪观测法。例如，可以将两个或更多个光纤各自与分开的LED偶联，并且相对于固体表面平面以不同角度指引其照明。可以在光强度(或“振幅”)、光谱含量(例如不同颜色LED或过滤的白色LED)和时间方面(例如，经由自单一触发器但是在触发器计时中并入的不同延迟后触发电子装置(electronics))中独立控制光源。但是，同一触发器例如在不同延迟或振幅或形状时可以启动照相机的暴露。由于可以分开控制照相机的暴露持续时间，可行的是对第一光源(例如可以例如通过偶数帧捕获反射)和第二光源(例如可以例如通过奇数帧捕获反射)计时以照明旋转标签及其标记(signature)。由于照明为不同角度(例如一个从顶部，而一个从底部，即以某种表位(epiposition)，或者一个从顶部，而一个为相对于垂直线例如45°角)，可以在一幅图像而非另一图像中检测旋转标签。由于捕获一系列图像，且由于可以使用超过一个来源，有可能实际上再构建每帧中的旋转标签的三维形状。此检测水平在最终序列中导致较高的准确性和较少的删除误差。
[0143]基于以单核苷酸分辨率的整体平行单分子分析，本文中描述的旋转依赖性转录测序系统可以显著推动护理点诊断学和基因组学。系统本质上适合于高度多路复用的靶物鉴定，并且在能够再配置成同时或序贯询问不同核酸靶物，诸如病原体和人生物标志中具有无限的灵活性。另外，目前基于PCR的和基于微阵列的核酸测序方法由于阳性鉴定(positive identification)需要的特定试剂组(引物和探针)而受到仅能够检测已知序列或传染原为限制。
[0144]对于设计例如用于 高通量临床诊断学或用于护理点诊断学的系统，如本文中描述的旋转依赖性转录测序系统可以与样品制备模块和模板完成模块偶联。
[0145]样品制备模块可以配置为裂解细胞，由此释放核酸，并且样品制备模块还可以具有剪切/片段化核酸的能力。样品制备模块通常包含用于接收生物学样品的接收器，和用于将一种或多种试剂或缓冲液投递至生物学样品的流质喷管。样品制备模块可以配置为接收多种不同生物学样品或者样品制备模块可以配置为接收特定类型的生物学样品(例如拭样、组织样品、血液或血浆样品、唾液、或培养物的部分)或以特定形式提供的生物学样品(例如在小瓶或管中或在印迹纸上)。测序制备模块也可以配置为使用例如滤器、柱、磁体、免疫学方法或其组合(例如病原体捕获系统，NanoMR Inc.)从生物学样品(例如细菌细胞、病毒，等等)捕获某些分子。
[0146]样品制备模块可以包含试剂或缓冲液，其牵涉从生物学样品获得核酸及制备核酸进行测序。例如，牵涉获得核酸进行测序的试剂包括细胞裂解试剂、核酸切割酶、DNA聚合酶、寡核苷酸、和/或DNA结合剂(例如珠或固体基质以结合并清洗靶核酸分子)，而牵涉获得核酸进行测序的缓冲液包括裂解缓冲液、清洗缓冲液、洗脱缓冲液、或结合缓冲液。由于本文中描述的旋转依赖性转录测序需要双链核酸模板，样品制备模块可以包括必要的试剂和缓冲液以将单链DNA或RNA转化为双链核酸分子(例如PCR试剂)。
[0147]样品制备模块的许多功能性组件是商品化的(例如硅胶膜(Qiagen或Ambion试剂盒)或作为 Palladium 系统(Integrated Nano Technologies Inc.))的集成部分。另外，作为酶促切割核酸模板的备选，使核酸片段化的仪器是商品化的(例如Covaris)。
[0148]模板完成模块可以配置为将RNA聚合酶启动子序列和旋转标签与靶核酸分子附接。模板完成模块通常包含流质喷管，用于将一种或多种试剂或缓冲液投递至靶核酸分子。例如，为了连接RNA聚合酶启动子序列与靶核酸分子，模板完成模块可以包含试剂和缓冲液，并且模板完成模块还可以包含用于将旋转标签与靶核酸分子附接的试剂和缓冲液。例如，明显地，牵涉连接启动子序列或结合旋转标签与靶核酸分子的试剂包含启动子序列和旋转标签，而且还可以包含例如酶连接酶、系链或PCR试剂，而牵涉连接启动子序列或结合旋转标签与祀核酸分子的缓冲液包括连接缓冲液、旋转标签结合缓冲液、酶结合缓冲液、清洗缓冲液和测序缓冲液。
[0149]根据如本文中描述的旋转依赖性转录测序系统的构造，可以在引入启动子和旋转标签结合的靶核酸分子前在固体表面上固定化多个RNA聚合酶。或者，可以将多个RNA聚合酶与启动子和旋转标签结合的靶核酸分子组合，并且在固体表面上沉积整个复合物。后一种规程是可行的，因为RNA聚合酶及其相应启动子序列的结合动力学是非常快的、有效的且特异性的。
[0150]旋转依赖性转录测序后的序列测定
[0151]图10显示了旋转标签的旋转方式的视频屏幕截图和相应的数字化(顶部)，其然后在图形形式中显示(底部)。旋转标签是2.8微米经链霉抗生物素蛋白包被的珠及与其附接的I微米经生物素包被的珠。在存在所有四种核苷三磷酸的情况中通过有His标签的RNA聚合酶实施转录。图10表明可以从用检测仪捕获的图像清楚且可靠检测并测量旋转标签的旋转方式。
[0152]图1lA是例示旋转分析的流程图。可以从旋转分析测定多个度量，包括时间戳、位移(displacement)(从 n=l 和 n_l 起)、位移边界环(displacement bounding circle)、珠直径、双重物取向、积累的旋转、角速度、和椭圆离心率。使用图像分割来将每个像素分成两类，即前景(旋转标签)和背景。使用一种方法(Otsu方法)，可以计算每个强度水平的图像直方图和概率，然后可以测定使类内变化最小化的阈值。使用另一种方法(三角形方法)，在灰度级轴上的b与灰度级轴的最低数值a处的直方图最大值之间画线。对从a至b的所有数值计算与该线垂直且在线和直方图之间的距离L。直方图和线之间的距离是最大值的水平对应于阈值水平。使用又一个方法(自适应均值(Adaptive mean)或中值)，可以使用局部化窗(即5x5像素)来寻找最大值强度变化，然后使用它来计算所述框的均值或中值。
[0153]边界椭圆方法可以利用几种方法之任一种:形心方法，其相对于前景(旋转标签)区的二阶动差标准化；椭圆长轴方法，其在区域形心上到区域边缘的最大距离是长轴的第一点，而(自形心)反射是第2点；椭圆短轴方法，其在区域形心上是到区域边缘且与长轴垂直的最大距离；和椭圆取向方法，其是椭圆长轴和X轴之间的角度。
[0154]图1lB的流程图例示用于测定靶核酸分子序列的例示性方法1100。在一些例子中，可以使用一种或多种计算机程序应用实现方法1100，所述应用使用一种或多种计算装置执行。为了例示，提供了非限制性典型背景，其涉及基于在靶核酸分子转录期间获得的数据测定包含旋转标签的靶核酸分子的序列。
[0155]方法1100以将鉴定的位置设置为使用本文中描述的旋转依赖性转录测序测序的靶核酸分子(1110)中的目前核酸位置开始。鉴定的位置可以是例如转录的第一核苷酸，即自靶核酸分子转录的第一核苷酸(即在启动子序列后)，或沿靶核酸分子的任何核苷酸位置。
[0156]靶核酸分子中鉴定位置处的第一数据(即第一信息)自旋转依赖性转录测序系统接收(1120)或者基于来自旋转依赖性转录测序运行的信息提供，并且提供或接收(1120)靶核酸分子中鉴定位置处的第二信息(即第二数据)。例如，第一数据可以是关于旋转标签旋转的信息。例如，第一数据可以是旋转速率(即旋转度/时间)、选择存在或缺乏的测定、或建立的旋转方式的变化。例如，第二数据可以是关于测序反应中一种或多种核苷三磷酸的存在和/或利用度(例如浓度)的信息。
[0157]然后，可以基于第一和第二数据测定鉴定位置处的核苷酸。例如，若第一数据指示旋转方式的变化，而第二数据指示反应中鸟嘌呤核苷三磷酸的存在，则可以将靶核酸分子中鉴定位置处的核苷酸测定为胞嘧啶。类似地，若第一数据指示旋转方式变化的缺乏，且第二数据指示反应中鸟嘌呤核苷三磷酸的存在，则靶核酸分子中指定位置处的核苷酸测定为是非鸟嘌呤(即腺嘌呤、鸟嘌呤、和胸腺嘧啶)。
[0158]若测定可以将鉴定的位置推定到接着的位置(1140)，则鉴定的位置设置为等于靶核酸分子(1150)中接着的核酸位置，并且继续(1120)方法1100。若测定不能将鉴定的位置推进到接着的位置(1140)，则将基于在每个鉴定的位置处接受的第一信息和第二信息的靶核酸分子序列汇编(1160)，并停止方法1100。在转录由于例如完成靶核酸分子的转录或RNA聚合酶活性终止(例如由于酶活性衰退)而不再能发生时，鉴定的位置不能推定到接着的位置。
[0159]主题的实施方案和本说明书中描述的运行可以在数字电子电路学中，或在计算机软件、固件、或硬件中，或在其中一种或多种的组合中实现。本文中描述的主题的实施方案可以以一种或多种计算机程序，即一种或多种计算机程序指令模块实现，由计算机存储介质上编码以通过数据处理装置执行，或者以控制数据处理装置的运行。或者/另外，可以对人工产生的传播信号，例如为了编码传输到合适的接收器装置以通过数据处理装置执行的信息而生成的机器产生的电、光学或电磁信号编码程序指令。计算机存储介质可以是计算机可读的存储装置、计算机可读的存储基片、随机或串行存取存储器阵列或装置、移动通信装置、或其中一种或多种的组合，或者包含在上述各项之中。此外，虽然计算机存储介质不是传播信号，但是计算机存储介质可以是人工产生的传播信号中编码的计算机程序指令的来源或目的地。计算机存储介质也可以是一种或多种分开的物理组件或介质(例如多⑶、磁盘、或其它存储装置)，或者可以包含在上述各项之中。
[0160]本文中描述的运行可以以如下的运行实现，所述运行通过数据处理装置对一个或多个计算机可读存储装置上存储或从其它来源接收的数据实施。术语“数据处理装置”涵盖用于处理数据的所有种类的装置、设备、和机器，包括举例而言可编程处理器、移动通信装置、计算机、芯片上的系统、或前述个性的多个或组合。装置可以包括特殊目的的逻辑电路，例如FPGA (现场可编程门阵列(field programmable gate array))或ASIC(专用集成电路(application specific integrated circuit))。在硬件外，装置还可以包括对所讨论的计算机程序创建执行环境的代码，例如构成处理器固件、协议栈、数据库管理系统、操作系统、交叉平台运行时间环境、虚拟机、或其中一项或多项的组合的代码。装置和执行环境可以实现各种不同计算模型基础结构，诸如网络服务、分布式计算和网格计算基础结构。
[0161]计算机程序(又称为 程序、软件、软件应用、脚本、或代码)可以以任何形式的编程语言，包括汇编或解释语言、说明性或过程语言书写，并且它可以以任何形式展开，包括作为独立程序或作为适合于计算环境中使用的模块、组件、子程序、对象、或其它单元。计算机程序可以但不需要对应于文件系统中的文件。程序可以存储于容纳其它程序或数据(例如置标语言文档中存储的一种或多种脚本)的文件的一部分中，在专用于所讨论程序的单一文件中，或者在多个协调文件(例如存储一种或多种模块、子程序、或代码的各部分的文件)中。计算机程序可以展开以在一台计算机上或在位于一个位置或在多个位置间分布且通过通信网络互连的台个计算机上执行。
[0162]可以通过执行一种或多种计算机程序的一个或多个可编程处理器实施本文中描述的方法和逻辑流以通过对输入数据运行并产生输出实施作用。方法和逻辑流也可以通过特殊目的的逻辑电路(例如FPGA或ASIC)实施，并且装置也可以以特殊目的的逻辑电路(例如FPGA或ASIC)执行。
[0163]举例而言，适合于执行计算机程序的处理器包括一般和特殊目的微处理器两者，和任何种类数字计算机的任何一种或多种处理器。一般地，处理器会从只读存储器或随机存取存储器或这两者接收指令和数据。计算机的必需元件是用于依照指令实施作用的处理器和一种或多种用于存储指令和数据的存储器装置。一般地，计算机还会包含一种或多种用于存储数据的海量存储器装置(例如磁盘、磁光盘、或光盘)，或者可操作偶联以从该海量存储器装置接受数据或者将数据转移至该海量存储器装置，或这两者。然而，计算机不需要具有此类装置。此外，计算机可以在另一种装置，例如移动通信装置、个人数字助理(PDA)、可移动音频或视频播放器、游戏控制台、全球定位系统(GPS)接收器、或便携式存储装置(例如通用串行总线(USB)闪盘驱动器)等中体现。适合于存储计算机程序指令和数据的装置包括所有形式的非易失性存储器、介质和存储装置，举例而言包括半导体存储器装置，例如EPROM、EEPROM、和闪盘驱动器装置；磁盘，例如内部硬盘或可移动盘(removabledisk);磁光盘；和⑶ROM和DVD-ROM盘。处理器和存储器可以补充有特殊目的逻辑电路或在特殊目的逻辑电路中并入。
[0164]为了提供与用户的交互，本说明书中描述的主题实施方案可以在具有显示器装置，例如CRT (阴极射线管)或LCD (液晶显示器)监视器(用于对用户显示信息)及用于可以对计算机提供输入的键盘和点击设备(例如鼠标或跟踪球)的计算机上执行。另外，计算机可以与用户交互，其通过对用户使用的装置发送文档或者从该装置接收文版来进行；例如通过响应自网络浏览器接收的请求而将网页发送至用户的客户装置上的网络浏览器进行。
[0165]本说明书中描述的主题实施方案可以在计算系统中执行，所述计算系统包含后端组件，例如作为数据服务器，或者包含中间件组件，例如应用服务器，或者包含前端组件，例如具有用户可以藉此与本说明书中描述的主题实现交互的图形用户界面或网络浏览器的客户计算机，或一种或多种此类后端、中间件或前端组件的任何组合。系统的组件可以通过数字数据通信的任何形式或介质，例如通信网络互连。通信网络的例子包括局域网络(“LAN”)和广域网络(“WAN”)、互联网络(例如因特网)、和对等网络(例如特别是对等网络)。
[0166]计算系统可以包括客户机和服务器。客户机和服务器一般是彼此远程的，并且通常经由通信网络交互。客户机和服务器的关系依靠计算机程序出现，所述计算机程序在相应的计算机上运行，并且彼此具有客户机-服务器关系。在一些实施方案中，服务器将数据(例如HTML页)传送至客户机装置(例如为了对与客户机装置交互的用户显示数据及从该用途接受用户输入)。在客户机装置产生的数据(例如用户交互结果)可以在服务器处自客户机装置接收。
[0167]依照本发明，可以采用本领域技术内的常规分子生物学、微生物学、生物化学、和重组DNA技术。此类技术在文献中充分解释。本发明会在以下实施例中进一步描述，所述实施例并不限制权利要求书中描述的主题方法和组合物的范围。
实施例
[0168]实施例1:固体表面制备
[0169]如描述的那样制备NTA单层(见Paik et al., 2005, Chem.Commun.，15:1956 - 58)。通过将 NTA 官能化基片浸没到含有 0.1M NiCl2 的 IOmM Tris-HCl缓冲液(PH8.0)中30分钟来获得N1-NTA表面。然后，将基片用Mill1-Q水漂洗几次，并在氮气流下干燥。[0170]将新清扫的基片在氩气下浸没到含有1%(ν/ν)3-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷的蒸馏甲苯溶液中2天。在从溶液取出基片后，将它们用蒸馏甲苯漂洗，并在氮气流下干燥。将用以环氧树脂为末端的SAM官能化的基片在IOmM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)含有
2.5mM N，N 二(羧甲基)-L-赖氨酸(NTA)中于60°C温育4小时。将基片用Mill1-Q水漂洗，并干燥，制备好进行微接触印刷(microcontact printing)。
[0171]观察到有His标签的蛋白质对NTA SAM的有限的非特异性结合效应，表明NTA SAM是适合于用微接触印刷和沾笔纳米石印术(dip-pen nanolithography)技术制造Ni (II)离子样式的表面。
[0172]实施例2:有His标签的RNA聚合酶的克隆和纯化
[0173]使用pTAGkl9作为模板和合成的DNA寡聚物RP46和RP47(见下文)作为引物通过PCR合成编码38个氨基酸SBP标签的DNA片段。将片段用NcoI消化，并连接到pBH16117中，生成PRP6。
[0174]如先前描述的那样表达并纯化SBP-His-RNA聚合酶和His-RNA聚合酶(He etal.,1997, J.Protein Expression Purif., 9:142-51;及 Keefe et al,2001,J.ProteinExpression Purif.，23:440-46)。
[0175]实施例3:RNA聚合酶的固定化
[0176]遵循以下反应方案来将RNA聚合酶分子在Si (111)上固定化:(a)40%NH4F，10分钟，25°C ; (b)Cl2 气 体，20 分钟，100°C ; (c)mPEG，过夜，真空，150°C ;(d)DSC、DEI DA、DMAP、DMF，过夜，25°C ； (f) ΒΒΤ0，二乙醚，6 小时，25°C ； (g) CuSO4,乙醇，20 分钟，25°C ； (h)有 6x His
标签的蛋白质温育。
[0177]实施例4:微接触印刷(μ CP)和复合体形成
[0178]将10:1 (ν/ν)聚(二甲基硅氧烷)(PDMS)和固化剂(Sylgardl84, Dow Corning)的混合物相对于有样式的硅母片(master)浇注以制备PDMS印章，其具有5微米线特征，具有3和10微米线特征的间隔和5微米的间隔。将非氧化的PDMS印章在含有0.1M NiCl2的IOmM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中温育约I小时，然后，用氮气流干燥。将印章以NTA为末端的基片接触3分钟。在剥离印章后，将经Ni (II)印刷的基片在含有IOOnM His_T7RNAP的约200yL25mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)中与ds_DNA、启动子和经由链霉抗生物素蛋白-生物素键附接的磁性标签一起温育30分钟，然后用IOmM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)和Mill1-Q水漂洗以除去过量蛋白质。
[0179]实施例5:拴系和旋转
[0180]将2.8微米缀合有SA的珠(Dynal)和1.0微米生物素化的珠在PBS中稀释(分别为1:20和1:200)，并于室温混合15分钟。将盖玻片用Ν?2+-ΝΤΑ HRP缀合物(Qiagen)包被，并通过将略微分开的盖玻片排列在一起装配流动室，如先前描述的(见Noji etal., 1997, Nature, 386:299-302)。
[0181]将在一个末端生物素化的4kb DNA模板与SA珠双重物混合物，并与20nMHis-T7RNAP、0.3mM GTP和0.1mM ATP —起温育2分钟以容许形成延长复合物。将样品(约30 μ I)注射到流动池中，温育5分钟，并应用0.1pN磁力。将流动池用TB清洗，接着添加
0.5mM NTP。
[0182]发现了定位与珠位置的磁体偏移，即不直接在顶部但相对于光源和物镜产生某个角度，容许较容易地校正位置变化和力。
[0183]实施例6:旋转依赖性转录测序复合物的形成
[0184]图2C显示了在钝化的经镍包被的玻璃载玻片上通过有His标签的RNA聚合酶拴系的旋转标签和5.1Kb DNA模板的阵列。经由磁场应用创建“半随机”阵列，所述磁场应用容许珠相对于彼此以有序距离自身定位。如下将单独、双重和三重-携带核酸的珠附着于表面，即将载玻片上部向下翻，使得圆锥形磁场将磁性标签以有序方式拉到玻璃表面上。二维空间中的磁珠渗滤主动创建图2C中显示的样式。随后，取出磁体，并将流动室再次上部向下翻，使磁体对核酸应用张力。然后，将测序反应混合物投递至流动室以平行启动所有分子的转录和测序。
[0185]实施例7:模板制备
[0186]通过将携带17启动子的4.6kb噬菌体I7DNA片段和0.5kb生物素化的Lambda DNA片段连接在一起制备转录测序的DNA模板。使用#T7pPK13正向引物和在3’端含有XbaI识别位点的#T7phil7REV引物通过PCR生成4.6kb片段。在存在生物素-16_dUTP (Roche)的情况中使用#F3和#R3引物通过PCR生成0.5kb PCR片段。在完成PCR后，将纯化的PCR产物用NheI消化,并用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)清洁。
[0187]在用XbaI消化PCR产物后，通过于15°C连接过夜将4.6kb部分与用NheI消化的0.5kb生物素化PCR片段连接。将5.1kb的使得连接产物使用0.7%琼脂糖凝胶电泳解析，并使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)从凝胶提取。在转录和测序实验中使用此DNA。
[0188]使用以下引物进行PCR:#I7pPK13:GCAGTA ATA CGA CTC ACTATA GGG AGA GGG AGGGAT GGA GCC TTT AAG GAG GTC AAA TGG CTA ACG(SEQ ID NO:1 ;!7启动子序列加下划线，粗体G是+1，而粗体C是位置+20处的暂停位点)；#T7phil7REV:GGC A-T CTA GA-TGC ATCCCT ATG CAG TCC TAA TGC (SEQ ID NO: 2; contains Xba site) ;#F3:GGC AGC标签CTA AACATG GCG CTG TAC GTT T CG C(SEQ ID NO:3;含有 5’ 端的 NheI 限制性位点);_R3:AGCCTT TCG GAT CGA ACA CGA TGA(SEQ ID NO:4)。
[0189]下表显示了用于制备含有17启动子的来自17噬菌体的4.6Kb片段的反应混合物。在以下循环条件下实施PCR扩增:94°C持续30”，于94°C持续10”，55°C持续30”，65°C持续4’ 10”的32个循环，65°C持续10’，接着是4°C保持。
[0190]
【权利要求】
1.一种测定靶核酸分子序列的方法，其包括: 提供固定化有RNA聚合酶的固体基片； 在第一测序条件下使所述RNA聚合酶与所述靶核酸分子接触，其中所述靶核酸分子包含旋转标签，其中所述第一测序条件包括四种核苷三磷酸的存在，其中所述四种核苷三磷酸的第一核苷三磷酸以速率限制量存在； 在所述第一测序条件下检测所述旋转标签的旋转方式；并 基于所述旋转方式的变化沿着所述靶核酸分子测定所述第一核苷三磷酸的位置信息。
2.权利要求1的方法，其中所述固体基片是玻璃。
3.权利要求1的方法，其中所述RNA聚合酶是噬菌体RNA聚合酶。
4.权利要求3的方法，其中所述噬菌体RNA聚合酶是T7RNA聚合酶。
5.权利要求3的方法，其中所述噬菌体RNA聚合酶是T3RNA聚合酶。
6.权利要求1的方法，其中所述RNA聚合酶是细菌RNA聚合酶。
7.权利要求6的方法，其中是细菌RNA聚合酶是大肠杆菌RNA聚合酶。
8.权利要求1的方法，其中经由His标签在所述固体表面上固定化所述RNA聚合酶。
9.权利要求1的方法，其中所述靶核酸分子是真核的。
10.权利要求1的方法`，其中所述靶核酸分子是双链的。
11.权利要求1的方法，其中所述靶核酸分子包含于生物学样品内。
12.权利要求1的方法，其中所述靶核酸分子包含RNA聚合酶启动子序列。
13.权利要求1的方法，其中所述旋转标签包含第一标签和第二标签。
14.权利要求1的方法，其中所述第一标签是磁性的。
15.权利要求1的方法，其中所述检测步骤包括将光投射至所述旋转标签上。
16.权利要求15的方法，其中所述检测步骤进一步包括经由显微镜观察所述旋转方式。
17.权利要求1的方法，其中所述检测步骤进一步包括在CMOS或CCD上捕获所述旋转方式。
18.权利要求1的方法，其中所述固体基片是CMOS或CCD。
19.权利要求1的方法，其中所述检测步骤包括以磁像捕获所述旋转方式。
20.权利要求19的方法，其中在GMR传感器或MRAM阵列上捕获所述磁像。
21.权利要求1的方法，其中所述检测步骤包括以电场捕获所述旋转方式。
22.权利要求21的方法，其中在RAM传感器上捕获所述图像。
23.权利要求1的方法，其进一步包括对所述靶核酸分子应用定向力。
24.权利要求23的方法，其中用磁体产生所述定向力。
25.权利要求23的方法，其中用流或压力产生所述定向力。
26.权利要求1的方法，其进一步包括: 提供固定化有RNA聚合酶的固体基片； 在第二测序条件下使所述RNA聚合酶与包含所述旋转标签的所述靶核酸分子接触，其中所述第二测序条件包括四种核苷三磷酸的存在，其中所述四种核苷三磷酸的第二核苷三磷酸以速率限制量存在； 在所述第二测序条件下检测所述旋转标签的旋转方式；并基于所述旋转方式的变化沿着所述靶核酸分子测定所述第二核苷三磷酸的位置信息。
27.权利要求26的方法，其中与在所述第一测序条件下的所述接触和检测步骤同时实施所述第二测序条件下的所述接触和检测步骤。
28.权利要求26的方法，其中在所述第一测序条件下的所述接触和检测步骤之前或之后序贯实施所述第二测序条件中的所述接触和检测步骤。
29.权利要求26的方法，其进一步包括: 提供固定化有RNA聚合酶的固体基片； 在第三测序条件下使所述RNA聚合酶与包含所述旋转标签的所述靶核酸分子接触，其中所述第三测序条件包括四种核苷三磷酸的存在，其中所述四种核苷三磷酸的第三核苷三磷酸以速率限制量存在； 在所述第三测序条件下检测所述旋转标签的旋转方式；并 基于所述旋转方式的变化沿着所述靶核酸分子测定所述第三核苷三磷酸的位置信息。
30.权利要求29的方法，其进一步包括: 从所述靶核酸分子内所述第一、第二和第三核苷三磷酸的所述位置信息测定所述靶核酸分子的序列。
31.权利要求29的方法，其进一步包括: 提供固定化有RNA聚合酶的固体基片；` 在第四测序条件下使所述RNA聚合酶与包含所述旋转标签的所述靶核酸分子接触，其中所述第四测序条件包括四种核苷三磷酸的存在，其中所述四种核苷三磷酸的第四核苷三磷酸以速率限制量存在； 在所述第四测序条件下检测所述旋转标签的旋转方式；并 基于所述旋转方式的变化沿着所述靶核酸分子测定所述第四核苷三磷酸的位置信息。
32.一种测定靶核酸分子序列的方法，其包括: 在测序条件下使RNA聚合酶与靶核酸分子接触，其中测序条件包括至少一种核苷三磷酸的存在，其中所述RNA聚合酶在固体基片上固定化，其中所述靶核酸分子包含旋转标签；检测所述旋转标签的旋转方式； 将所述接触和检测步骤重复多次；并 序贯基于在存在所述至少一种核苷三磷酸的情况中所述旋转方式变化的存在或缺乏测定所述靶核酸分子的序列。
33.权利要求32的方法，其中所述测序条件包括单一核苷三磷酸的存在。
34.权利要求32的方法，其中所述测序条件包括四种核苷三磷酸的存在，其中所述四种核苷三磷酸的第一核苷三磷酸以速率限制量存在。
35.一种测定靶核酸分子序列的方法，其包括: 提供固定化有一个或多个RNA聚合酶的固体基片； 在第一测序条件下使所述一个或多个RNA聚合酶与所述靶核酸分子接触，其中所述靶核酸分子包含旋转标签，其中所述第一测序条件包括四种中第一核苷三磷酸的存在；并在所述第一测序条件下检测是否发生所述旋转方式的变化， 其中若发生所述旋转方式的变化，则所述方法进一步包括在所述第一测序条件下重复所述接触步骤和后续步骤，其中若不发生所述旋转方式的变化，则所述方法进一步包括在第二测序条件下重复所述接触步骤和后续步骤，其中所述第二测序条件包括四种中第二核苷三磷酸的存在， 其中若发生所述旋转方式的变化，则所述方法进一步包括在所述第一测序条件下重复所述接触步骤和后续步骤， 其中若不发生所述旋转方式的变化，则所述方法进一步包括在第三测序条件下重复所述接触步骤和后续步骤，其中所述第三测序条件包括四种中第三核苷三磷酸的存在， 序贯基于在所述第一、第二或第三测序条件下所述旋转方式变化的发生测定所述靶核酸分子的序列。
36.一种制品,其包含: 固定化有多个RNA聚合酶的固体基片。
37.权利要求36的制品，其中所述固体基片用铜和PEG包被。
38.权利要求36的制品，其中所述固体基片用镍和PEG包被。
39.权利要求36的制品，其中所述固体基片用N1-NTA包被。
40.权利要求36的制品，其中所述固体基片是CMOS或(XD。
41.权利要求36的制品，其进一步包含旋转标签。
42.权利要求41的制品， 其中所述旋转标签包含非球形标签。
43.权利要求41的制品，其中所述旋转标签包含具有可以光学区分的非一致表面的球形标签。
44.权利要求36的制品，其进一步包含T7RNA聚合酶启动子序列。
45.权利要求36的制品，其进一步包含生物素化的核酸系链序列。
46.权利要求36的制品,其进一步包含一个或多个核苷三磷酸。
47.权利要求36的制品，其进一步包含关于下列各项的用法说明书: 经由磁性参照标签鉴定所述旋转标签相对于轴的转动； 基于核苷三磷酸的旋转和存在编译靶核酸分子序列；或 应用磁力。
48.权利要求47的制品，其中所述用法说明书以电子形式提供。
49.一种用于靶核酸分子的单碱基测序的装置，其包含: 测序模块，其中所述测序模块包含: 用于接收固体基片的接收器(rec印tacle)，其中所述固体基片包含其上固定化的多个RNA聚合酶； 用于提供定向力的来源，其中所述定向力是足够的，且为如下的方向，使得对由所述固体表面上固定化的多个RNA聚合酶转录的靶核酸分子应用张力；和 光源，用于将光投射至与靶核酸分子结合的旋转标签上，所述靶核酸分子由所述固体表面上固定化的多个RNA聚合酶转录；和 光学器件，用于检测与靶核酸分子结合的旋转标签的旋转方式，所述靶核酸分子由所述固体表面上固定化的多个RNA聚合酶转录。
50.权利要求49的装置，其进一步包含计算机处理器。
51.权利要求49的装置，其进一步包含 微流质喷管(microfIuidics),用于容纳和转运牵涉对核酸测序的试剂和缓冲液。
52.权利要求49的装置，其中所述试剂选自下组:核苷三磷酸。
53.权利要求49的装置，其中所述缓冲液选自下组:清洗缓冲液、酶结合缓冲液和测序缓冲液。
54.权利要求49的装置，其中所述用于提供定向力的来源包含磁体。
55.权利要求49的装置，其中所述用于提供定向力的来源包含液体流。
56.权利要求49的装置，其中所述光学器件包括显微镜。
57.权利要求49的装置，其中所述光学器件包括照相机。
58.权利要求49的装置，其进一步包含: 样品制备模块，其中所述样品制备模块包含: 用于接收生物学样品的接收器；和 流质喷管，其用于容纳和转运牵涉分离和制备核酸以进行测序的试剂和缓冲液。
59.权利要求58的装置，其中所述试剂选自下组:细胞裂解试剂和切割酶。
60.权利要求58的装置，其中所述缓冲液选自下组:裂解缓冲液和清洗缓冲液。
61.权利要求58的装置，其进一步包含: 模板完成模块，其中所述`模板完成模块包含: 流质喷管，其用于容纳和转运牵涉将RNA聚合酶启动子序列和旋转标签附着于核酸分子的试剂和缓冲液。
62.权利要求61的装置，其中所述试剂选自下组:酶连接酶、分子发动机结合序列、磁性标签和系链。
63.权利要求61的装置，其中所述缓冲液选自下组:连接酶缓冲液、磁性参照标签结合缓冲液、旋转标签结合缓冲液和酶结合缓冲液。
64.一种基于在靶核酸分子转录期间获得的数据测定包含旋转标签的所述靶核酸分子的序列的方法，其包括: 接收关于所述靶核酸分子的第一位置的第一数据，其中所述第一数据指示旋转的存在或缺乏和/或所述旋转标签的旋转间的时间长度； 接收关于所述靶核酸分子的所述第一位置的第二数据，其中所述第二数据指示转录期间可用的一种或多种核苷三磷酸的存在和/或量； 接收关于所述靶核酸分子的第二位置的另一第一数据和另一第二数据； 接收关于所述靶核酸分子的第三位置的又一第一数据和又一第二数据； 重复关于所述靶核酸分子的第四和后续位置的所述第一数据和所述第二数据的接收步骤；并 基于对每个位置接收的所述第一数据和第二数据测定所述靶核酸分子的序列。
65.权利要求64的方法，其中所述第一数据和所述第二数据以指定位置处的核苷酸记录。
【文档编号】C12Q1/68GK103534357SQ201280019968
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2012年2月23日 优先权日:2011年2月23日
【发明者】T.科茨罗格卢 申请人:伊芙生物医学股份有限公司