具有粘度改变表型的丝状真菌的制作方法

具有粘度改变表型的丝状真菌的制作方法
【专利摘要】本发明描述的是与具有改变的生长特性的变异丝状真菌相关的组合物和方法。这种变体非常适于在深层培养中生长，例如用于大规模生产用于商业应用的酶和其他蛋白质。
【专利说明】具有粘度改变表型的丝状真菌
[0001]优先权
[0002]本专利申请要求二者均于2011年4月22日提交的系列号为61/478，160和61/478，162的美国临时申请和各自于2011年4月29日提交的系列号为61/480,602、61/480，610和61/480,629的美国临时申请的优先权，特此这些申请案以引用的方式全文并入本文。
【技术领域】
[0003]本发明的菌株和方法涉及丝状真菌中的基因突变，该基因突变产生具有改变的生长特性的菌株变体。这种变体非常适于在深层培养中生长，例如用于大规模生产用于商业应用的酶和其他蛋白质或代谢物。
【背景技术】
[0004]丝状真菌能够高水平表达天然和异源蛋白质，从而使得它们非常适于大规模生产用于工业应用、医药应用、动物健康应用以及食品和饮料应用的酶和其他蛋白质。通常在生物反应器中在菌丝体深层培养中培养丝状真菌，所述生物反应器适于将氧气和营养物质引入和分布进培养基(即发酵液)中。菌丝体的形态特征影响发酵液的流变特性，从而影响生物反应器性能。
[0005]一般来讲，发酵液的粘度越高，氧气和营养物质的分布越不均匀，搅拌培养物所需的能量越高。在一些情况下，发酵液的粘度变得足够高而明显妨碍氧气和营养物质的溶解，从而不利地影响真菌的生长。另外，混合粘稠发酵液以及对粘稠发酵液进行充气所需的能量可大大增加生产成本，以 及招致在马达和电源供应方面的资本支出较高。

【发明内容】

[0006]本发明描述了涉及丝状真菌的菌株和方法，所述丝状真菌具有产生粘度改变表型的遗传变更。
[0007]在一个方面，提供衍生自亲本株的丝状真菌变异株，该变异株包含能使变异株的细胞与亲本株的细胞相比产生改变量的功能性GasI蛋白的遗传变更，其中变异株的细胞在深层培养有氧发酵过程中，(i)与亲本株的细胞相比，产生出需要改变的搅拌量来维持预选的溶氧量的细胞发酵液，和/或(ii)与亲本株的细胞相比，产生出在预选的搅拌量下维持改变的溶氧量的细胞发酵液。
[0008]在一些实施例中，功能性Gasl蛋白的改变量为减少量，并且变异株在深层培养有氧发酵过程中，(i)与亲本株的细胞相比，产生出需要减少的搅拌量来维持预选的溶氧量的细胞发酵液，和/或(ii)与亲本株的细胞相比，在预选的搅拌量下维持增加的溶氧量的细胞发酵液。
[0009]在一些实施例中，遗传变更包含亲本株中所存在的gasl基因的破坏。在一些实施例中，破坏gasl基因是缺失gasl基因的全部或部分所致。在一些实施例中，破坏gasl基因是缺失包含gasl基因的基因组DNA的一部分所致。在一些实施例中，破坏gasl基因是诱变gasl基因所致。
[0010]在一些实施例中，破坏gasl基因是用位点特异性重组进行。在一些实施例中，破坏gasl基因是与在gasl基因的遗传基因座处引入选择性标记相结合来进行。
[0011]在一些实施例中，变异株不产生功能性Gasl蛋白。在一些实施例中，变异株不产生Gasl蛋白。
[0012]在一些实施例中，变异株还包含编码所关注的蛋白质的基因。在一些实施例中，变异株还含sfb3基因的破坏。在一些实施例中，变异株还包含sebl基因的破坏。在一些实施例中，变异株还包含sfb3基因和sebl基因的破坏。在一些实施例中，变异株还包含至少一个选自如下的基因的破坏:sfb3基因、sebl基因、mpgl基因、crzl基因和tps2基因。在一些实施例中，变异株每单位量生物质产生与亲本株基本上相同量或更多的蛋白质。
[0013]在一些实施例中，丝状真菌为盘菌亚门(Pezizomycotina)物种。在一些实施例中，丝状真菌为木霉属(Trichoderma)物种、曲霉属(Aspergillus)物种、镰刀菌属(Fusarium)物种、足放线病菌属(Scedosporium)物种、青霉属(Penicillium)物种、金孢子菌属(Chrysosporium)物种、头抱霉属(Cephalosporium)物种、篮状菌属(Talaromyces)物种、Geosmithia属物种和链孢霉属(Neurospora)物种。在一些实施例中，丝状真菌可包括但不限于里氏木霉(Trichoderma reesei)(此前分类为长梗木霉(Trichoderma1ngibrachiatum)和红褐肉座菌(Hypocrea jecorina))、黑曲霉(Aspergillus niger) >烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、解乌头酸曲霉(Aspergillus itaconicus)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、土曲霉(Aspergillusterreus) > 酱油曲霉(Aspergillus sojae)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、多育赛多抱(Scedosporium pro lif icans)、粗糖脉抱霉(Neurospora crassa)、绳状青霉(Penicillium funiculosum) > 产黄青霉(Penicillium chrysogenum) > 埃默森篮状菌(Talaromyces (Geosmithia) emersonii)、腐皮键刀菌(Fusarium venenatum)和Chrysosporium lucknowense。在一些实施例中，丝状真菌为里氏木霉。
[0014]在另一方面，提供制备丝状真菌细胞的变异株的方法，该方法包括:将遗传变更引入丝状真菌细胞的亲本株中，与亲本株的细胞相比该遗传变更改变了功能性Gasl蛋白的产生，从而产生变异丝状真菌细胞，该变异丝状真菌细胞在深层培养有氧发酵过程中，(i)与亲本株的细胞相比，产生出需要改变的搅拌量来维持预选的溶氧量的细胞发酵液，和/或(ii)与亲本株的细胞相比，产生出在预选的搅拌量下维持改变的溶氧量的细胞发酵液。
[0015]在一些实施例中，遗传变更减少或防止功能性Gasl蛋白的产生，从而产生变异丝状真菌细胞，该变异丝状真菌细胞在深层培养有氧发酵过程中，(i)与亲本株的细胞相比，产生出需要减少的搅拌量来维持预选的溶氧量的细胞发酵液，和/或(ii)与亲本株的细胞相比，产生出在预选的搅拌量下维持增加的溶氧量的细胞发酵液。
[0016]在一些实施例中，遗传变更包括利用遗传操作破坏亲本丝状真菌细胞中的gasl基因。在一些实施例中，遗传变更包括利用遗传操作缺失亲本丝状真菌细胞中的gasl基因。在一些实施例中，遗传变更利用位点特异性遗传重组进行。
[0017]在一些实施例中，破坏gasl基因是与在gasl基因的遗传基因座处引入选择性标记相结合来进行。在一些实施例中，变异株每单位量生物质产生与亲本株基本上相同量或更多的蛋白。在一些实施例中，破坏gasl基因是与破坏sfb3基因相结合进行。在一些实施例中，破坏gasl基因是与破坏至少一个选自sfb3基因、sebl基因、mpgl基因、crzl基因和tps2基因的基因相结合进打。
[0018]在一些实施例中，变异株每单位量生物质产生与亲本株基本上相同量或更多的蛋白。
[0019]在一些实施例中，丝状真菌为盘菌亚门物种。在一些实施例中，丝状真菌为木霉属物种、曲霉属物种、镰刀菌属物种、足放线病菌属物种、青霉属物种、金孢子菌属物种、头孢霉属物种、篮状菌属物种、白乔史密斯霉属(Geosmithia)属物种和链孢霉属物种。在一些实施例中，丝状真菌可包括但不限于里氏木霉(此前分类为长梗木霉和红褐肉座菌)、黑曲霉、烟曲霉、解乌头酸曲霉、米曲霉、构巢曲霉、土曲霉、酱油曲霉、日本曲霉、多育赛多孢、粗糙脉孢霉、绳状青霉、产黄青霉、埃默森篮状菌、腐皮镰刀菌和勒克瑙金孢菌(Chrysosporium Iucknowense)。在一些实施例中，丝状真菌为里氏木霉。
[0020]在一些实施例中，亲本株还包含编码所关注的蛋白质的基因。在一些实施例中，在引入减少或防止功能性Gasl蛋白的产生的遗传变更之前，编码所关注的蛋白质的基因存在于亲本株中。在一些实施例中，亲本株内的所关注的蛋白质由内源基因或异源基因编码。
[0021]在另一方面，提供由上述变异株中任一者产生的所关注的蛋白质。
[0022]在又一方面，提供由上述方法中任一者产生的且具有上述特性中任一者的丝状真菌。
[0023]在另一方面，提供衍生自亲本株的丝状真菌变异株，该变异株包含:(a)遗传变更，所述遗传变更使得(i)与亲本株的细胞相比，深层培养物中需要减少的搅拌量来维持预选的溶氧量，和/或(ii)与亲本株的细胞相比，在预选的搅拌量下维持深层培养物中增加的溶氧量；和(b)编码所关注的蛋白质的基因，其中所述编码所关注的蛋白质的基因在(a)中的遗传变更之前存在于变异株中。
[0024]在一些实施例中，导致变异株的遗传变更包含亲本株中所存在的gasl基因的破坏。在一些实施例中，破坏gasl基因是与在gasl基因的遗传基因座处引入选择性标记相结合进行。在一些实施例中，破坏gasl基因是与破坏sfb3基因相结合进行。在一些实施例中，破坏gasl基因是与破坏sebl基因相结合进行。在一些实施例中，破坏gasl基因是与破坏至少一个选自sfb3基因、sebl基因、mpgl基因、crzl基因和tps2基因的基因相结合进行。
[0025]根据本说明书(包括附图)，本发明的变异株和方法的这些及其他的方面和实施例将显而易见。
【专利附图】

【附图说明】
[0026]图1为如实例I中所述的gasl破坏载体pRATT247-gaslD_pyr2的图谱。
【具体实施方式】
[0027]1.综沭
[0028]本发明的菌株和方法涉及具有影响其形态和生长特性的遗传修饰的丝状真菌细胞变异株。当在深层培养中培养该变异细胞时，其产生与包含亲本株细胞的细胞发酵液相比具有不同流变特性的细胞发酵液。这些变异株中的一些非常适于大规模生产酶及其他在商业上重要的蛋白质。
[0029]IL 穿 SL
[0030]在详细描述本发明菌株和方法之前，为了清楚起见对如下术语进行定义。未定义的术语应该与它们在相关领域中所用的普通含义一致。
[0031]如本文所用，“里氏木霉”是指子囊菌门(Ascomycota)盘菌亚门的丝状真菌。该生物体此前被分类为长梗木霉或被分类为红褐肉座菌。
[0032]如本文所用，短语“丝状真菌细胞的变异株”或类似短语是指例如通过遗传操作，从属于盘菌亚门的亲本(或参照)株衍生(即从其获得或可从其获得)的丝状真菌细胞的株系。在本说明书中，亲本株和变异株可描述为具有某些特性，例如遗传修饰、表达表型、形态等等；然而，本领域技术人员将理解，在技术上其为具有这些特性的亲本株或变异株的细胞，并且为了方便而称为“菌株”。
[0033]如本文所用，术语“所关注的蛋白质”是指期望在丝状真菌中表达的多肽。这种蛋白质可以是酶、底物结合蛋白、表面活性蛋白、结构蛋白等等，并且可以高水平表达，且可用于商业化目的。所关注的蛋白质可由相对于变异株和/或亲本株的内源基因或异源基因编码。所关注的蛋白质可在细胞内表达或作为分泌性蛋白表达。
[0034]如本文所用，短语“基本上无活性”或类似短语，意指特定的活性在混合物中不能检测到或者其存在量不会干扰该混合物的预期目的。
[0035]如本文所用，术语“多肽”和“蛋白质”(和/或它们各自的复数形式)可互换使用来指包含肽键连接的氨基酸残基的任何长度的聚合物。本文中使用氨基酸残基的常规单字母或三字母代码。该聚合物可以是直连或支链的，其可包含经修饰的氨基酸，并且其可夹杂有非氨基酸。该术语还包含已经以天然方式或通过干预进行修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他的操作或修饰，例如与标记组分缀合。还包括在该定义中的是例如含有一个或多个氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)以及本领域已知的其他修饰的多肽。
[0036]如本文所用，在功能上和/或在结构上类似的蛋白质视为“相关蛋白”。这类蛋白质可衍生自不同属和/或种的生物体，或甚至不同纲的生物体(例如细菌和真菌)。相关蛋白还涵盖通过一级序列分析确定、通过二级或三级结构分析确定或通过免疫交叉反应确定的同源物。
[0037]如本文所用，术语“衍生的多肽/蛋白质”是指通过在N末端或C末端任一端或这两个末端添加一个或多个氨基酸、在氨基酸序列中的一个或多个不同位点置换一个或多个氨基酸、在蛋白质的任一端或两个末端或在氨基酸序列中的一个或多个位点缺失一个或多个氨基酸和/或在氨基酸序列中的一个或多个位点插入一个或多个氨基酸而衍生自或可衍生自蛋白质的蛋白质。可通过修饰编码天然蛋白质的DNA序列、将该DNA序列转化进合适的宿主中并使该经修饰的DNA序列表达而形成衍生的蛋白质来实现蛋白质衍生物的制备。
[0038]相关的(和衍生的)蛋白质包括“变体蛋白”。变体蛋白与参照/亲本蛋白(例如野生型蛋白)的差别在于少数氨基酸残基的置换、缺失和/或插入。变体蛋白与亲本蛋白质间的差异氨基酸残基的数目可以为一个或多个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40,50或更多个氨基酸残基。变体蛋白可与参照蛋白具有至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约91 %、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%或甚至至少约99或更多的氨基酸序列同一性。变体蛋白与参照蛋白的差别还可在于所选的基序、结构域、表位、保守区等等。
[0039]如本文所用，术语“类似序列”是指蛋白质内提供与所关注的蛋白质(即通常是所关注的起始蛋白质)类似的功能、三级结构和/或保守残基的序列。例如，在含有a-螺旋或片层结构的表位区域中，类似序列中的置换氨基酸优选维持相同的特异性结构。该术语还指核苷酸序列以及氨基酸序列。在一些实施例中，开发类似序列使得置换氨基酸导致显示类似或改善功能的变体酶。在一些实施例中，所关注蛋白质中的氨基酸的三级结构和/或保守残基位于或接近所关注的区段或片段。因而，若所关注的区段或片段含有例如a -螺旋或P -片层结构，则置换氨基酸优选维持该特异性结构。
[0040]如本文所用，术语“同源蛋白”是指具有与参照蛋白类似的活性和/或结构的蛋白质。同源物不一定是进化相关的。因而，意图是该术语涵盖从不同生物体获得的相同、类似或对应的酶(例如，就结构和功能而言)。在一些实施例中，希望鉴别具有与参照蛋白类似的四级、三级和/或一级结构的同源物。在一些实施例中，同源蛋白诱导与参照蛋白类似的免疫应答。在一些实施例中，同源蛋白经工程改造而产生具有所需活性的酶。
[0041]序列之间的同源程度可用本领域已知的任何合适方法测定(参见例如，Smith和Waterman (1981) Adv.Appl.Math.(《应用数学进展》)2:482 ;Needleman 和 Wunsch (1970)J.Mol.Biol.(《分子生物学杂志》)，48:443 ;Pearson 和 Lipman (1988) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA(《美国科学院院刊》)85:2444 ;诸如威斯康星遗传软件包(Wisconsin GeneticsSoftware Package)(威斯康星州麦迪逊的 GCG 公司(Genetics Computer Group,Madison,WI))中的 GAP、BESTFIT、FASTA 和 TFASTA 之类的程序；和 Devereux 等人(1984)NucleicAcids Res.(《核酸研究》)12:387-95)。
[0042]例如，PILEUP是测定序列同源性水平的有用程序。PILEUP利用渐进性双序列比对从一组相关序列产生多序列比对。其还可以绘出关系树，该关系树示出了用于产生比对的聚类关系。PILEUP 使用 Feng和 Doolittle (Feng和 Doolittle (1987) J.Mol.Evo1.(《分子进化杂志》)35 =351-60)的渐进比对方法的简化形式。该方法类似于Higgins和Sharp ((1989)CAB10S5:151-53)所描述的方法。可用的PILEUP参数包括:默认空位权重=3.00，默认空位长度权重=0.10，以及加权的末端空位。可用的算法的另一个例子为BLAST算法，该算法由Altschul等人((1990)J.Mol.Biol.(《分子生物学杂志》)215 =403-10)和Karlin等人((1993)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA(《美国科学院院刊》)90:5873-87)描述。一种特别有用的 BLAST 程序为 WU-BLAST-2 程序(参见例如，Altschul 等人(1996)Meth.Enzymol.(《酶学方法》)266:460-80)。参数“W”、“T”和“X”决定比对的灵敏度和速度。BLAST程序使用如下默认值:字长(W) = 11、BL0SUM62打分矩阵(参见例如，Henikoff和Henikoff (1989)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA (《美国科学院院刊》)89:10915)、比对(B) = 50，期望值(E)=
10、M' 5、N' -4以及对两条链均进行比较。
[0043]如本文所用，在至少两个核酸或多肽的情况下，短语“基本上相似”和“基本上相同”通常意指与参照(例如野生型)序列相比，多核苷酸或多肽包含具有至少约70%同一性、至少约75%同一‘丨生、至少约80%同一‘丨生、至少约85%同一‘丨生、至少约90%同一‘丨生、至少约91 %同一丨丨生、至少约92%同一丨丨生、至少约93%同一丨丨生、至少约94%同一丨丨生、至少约95%同一性、至少约96%同一性、至少约97%同一性、至少约98%同一性或甚至至少约99%同一性或更高同一性的序列。序列同一性可用已知的程序如BLAST、ALIGN和CLUSTAL，使用标准参数测定。(参见例如，Altschul等人，(1990) J.Mol.Biol.(《分子生物学杂志》)215:403-410 ;Henikoff 等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA(《美国科学院院刊》)89:10915 ；Karin 等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci USA(《美国科学院院刊》)90:5873 ;和 Higgins等人(1988)Gene(《基因》)73:237-244)。用于进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)公开获得。另外，可用FASTA(Pearson 等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA(《(美国科学院院刊》)85 =2444-48)搜索数据库。两个多肽基本上相同的一个指示是第一多肽与第二多肽是免疫交叉反应性的。通常，差别在于保守氨基酸置换的多肽是免疫交叉反应性的。因而，例如，若两个肽差别仅在于保守置换，则多肽基本上与第二多肽相同。两条核酸序列基本上相同的另一个指示是，两个分子在严格条件(例如在中到高的一系列严格性内)彼此杂交。
[0044]如本文所用，术语“基因”与术语“等位基因”在关于编码和引导蛋白质或RNA表达的核酸时是同义的。丝状真菌的营养体形式通常是单倍体，因而单拷贝的指定基因(即单个等位基因)足以赋予指定表型。
[0045]如本文所用，术语“野生型的”和“天然的”可互换使用并且是指自然中存在的基因、蛋白质或株系。
[0046]如本文所用，“缺失基因”是指从宿主细胞的基因组移除基因。若基因包括未紧邻基因的编码序列的控制元件(例如，增强子元件)，则缺失基因是指缺失该编码序列，以及任选缺失相邻的增强子元件，包括但不限于例如启动子和/或终止子序列。
[0047]如本文所用，“破坏基因”广义地指基本上在宿主细胞中防止细胞产生功能基因产物，例如蛋白质的任何遗传或化学操作，即突变。破坏方法的例子包括完全或部分缺失基因的任何部分，包括多肽编码序列 、启动子、增强子或另一调控元件，或者诱变上述者，其中诱变涵盖置换、插入、缺失、倒位以及它们的组合和变型形式，上述突变中的任一者基本上防止功能基因产物的产生。基因还可以利用RNA1、反义或废止基因表达的任何其他方法来破坏。
[0048]如本文所用，术语“遗传操作”和“遗传变更”可交换使用并且是指核酸序列的变更/改变。该变更可包括但不限于核酸序列中的至少一个核酸的置换、缺失、插入或化学修饰。
[0049]如本文所用，“有氧发酵”是指在存在氧气的情况下的生长。
[0050]如本文所用，术语“细胞发酵液”统指液体/深层培养物中的培养基和细胞。
[0051]如本文所用，术语“细胞群”是指液体/深层培养物中存在的细胞组分(包括完整的和溶解的细胞)。细胞群可以干重或湿重表示。
[0052]如本文所用，术语“流变学”是指研究物质形变和流动的物理学分支。
[0053]如本文所用，“粘度”是流体对机械应力(如剪切应力或拉伸应力)引起的形变的抗性的量度。在本发明语境中，粘度还可以指包含丝状真菌细胞的细胞发酵液对机械应力(例如通过转子/叶轮所提供的机械应力)的抗性。由于细胞发酵液的粘度可能难以直接测量，可使用粘度的间接量度，如在预选搅拌量下培养物发酵液的溶氧量、维持预选溶氧量所需的搅拌量、搅拌细胞发酵液以维持所选溶氧量所需的能量量或甚至是固体培养基上的集落形态。
[0054]如本文所用，丝状真菌细胞的“粘度改变”变异株是指产生这样的细胞发酵液的变异株，该细胞发酵液与亲本株产生的等价细胞发酵液相比具有减少的或增加的粘度(即，减少的或增加的对剪切或拉伸应力的抗性)。一般来讲，相当的细胞发酵液或等价的细胞发酵液具有相当的细胞群。优选地，关于粘度的任何直接或间接量度，粘度改变的变异株与亲本株之间的差别为至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、或甚至至少50%或更多。本发明描述了用于比较丝状真菌细胞发酵液的粘度的方法。
[0055]如本文所用，丝状真菌细胞的“粘度降低”变异株是指产生这样的细胞发酵液的变异株，该细胞发酵液与亲本株产生的等价细胞发酵液相比具有减少的粘度(即减少的对剪切或拉伸应力的抗性)。优选地，关于粘度的任何直接或间接量度，粘度改变的变异株与亲本株之间的差别为至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、或甚至至少50%或更多。
[0056]如本文所用，“溶氧”(DO)是指以体积/体积单位测量的液体培养基中存在的氧
(O2)量。在整个发酵过程中，溶氧水平可维持在高的水平，例如170-100%至20%之间、100-80%至20%之间、70%至20%之间、65%至20%之间、60%至20%之间、55%至20%之间、50%至20%之间、45%至20%之间、44%至20%之间、43%至20%之间、42%至20%之间、41%至20%之间、40%至20%之间、35%至20%之间、30%至20%之间以及25%至20%之间。具体地讲，溶氧可在发酵开始时高并且允许随着发酵进行而下降。溶氧水平可通过搅拌(例如搅动)发酵物的速率和/或通过添加空气或氧气的速率来控制。可以400-700rpm搅拌(如搅动)培养物并且通过改变空气或氧气流量和叶轮速度将溶氧水平维持在闻于20*%、闻于25*%、闻于30*%、闻于35*%、闻于40*%、闻于45*%、闻于50%和闻于55%或更高。
[0057]如本文所用，“主要遗传定子”是指基因或其遗传操作，该基因或其遗传操作是在缺少其他基因或其他基因的遗传操作的情况下赋予指定表型所必要且充分的。然而，特定基因是赋予指定表型所必要且充分 的并不排除可通过进一步的遗传操作实现对表型的附加影响的可能性。
[0058]如本文所用，“功能性多肽/蛋白质”为具有活性，例如酶活性、结合活性、表面活性性质等，并且尚未被诱变、截短或以其他方式修饰来废止或降低该活性的蛋白质。如所指定的，功能性多肽可以是热稳定性的或不耐热的。
[0059]如本文所用，“功能性基因”为能够被细胞组分用于产生活性基因产物、通常是蛋白质的基因。功能性基因是被破坏的基因的对立物，被破坏的基因被修饰而使得它们不能被细胞组分用于产生活性基因产物，或者具有降低的被细胞组分用于产生活性基因产物的能力。
[0060]如本文所用，如果变异株与亲本株之间蛋白质的表达差异小于约20%、小于约15 %、小于约10 %、小于约7 %、小于约5 %、或甚至小于约3 %，则相比于亲本株，变异细胞“维持或保持高的蛋白质表达和/或分泌水平”。
[0061]如本文所用，如果宿主细胞已通过遗传方式或化学方式改变而防止产生表现具有野生型蛋白质的特征性活性、尤其是促进菌丝伸长或以其他方式增加液体培养物中丝状真菌的粘度的活性的功能性蛋白质/多肽，则宿主细胞已经“经过修饰而防止产生规定的蛋白质”。这类修饰包括但不限于缺失或破坏编码该蛋白质的基因、修饰该基因而使得所编码的多肽缺少上述活性、修饰该基因以影响翻译后加工或稳定性、以及它们的组合。
[0062]如本文所用，“所关注的蛋白质”为期望在丝状真菌细胞的深层培养中产生的蛋白质。一般来讲，所关注的蛋白质在商业上对于工业用途、医药用途、动物健康用途以及食品和饮料用途而言是重要的，从而使得期望它们大量产生。所关注的蛋白质应区别于丝状真菌细胞表达的无数其他蛋白质，这些其他蛋白质通常不是所关注的产品并且主要视为本底蛋白质污染物。
[0063]如本文所用，如果相比于亲本株产生的蛋白质的量，变异株产生的蛋白质的量减少不超过20 %、不超过15 %、不超过10 %、甚至不超过5 %，则变异株每单位量生物质产生与亲本株“基本上相同的量”的蛋白质，其中蛋白量被归一化至从中测定蛋白质产量的细胞的生物质总量，其中生物质可以湿重(如细胞团块)或干重表示。
[0064]如本文所用，如果相比于亲本株，变异株产生的蛋白质的量增加至少5 %、至少10%>至少15%或更多，则变异株每单位量生物质产生比亲本株“基本上更多的蛋白质”，其中蛋白量被归一化至从中测定蛋白质产量的细胞的生物质总量，其中生物质可以湿重(如细胞团块)或干重表示。
[0065]如本文所用，“荧光染料”为发荧光的染料。优选的荧光染料与真菌细胞壁中的纤维素和/或几丁质结合。
[0066]如本文所用，单数冠词“一个”、“一种”和“所述”涵盖多个指代物，除非上下文明确指明不是这样。特此以引用的方式将本文所引用的所有参考文献全文并入本文。如下缩写/首字母缩写具有如下含义，除非另外规定:
[0067]
【权利要求】
1.一种衍自亲本株的丝状真菌变异株，所述变异株包含使所述变异株的细胞与所述亲本株的细胞相比产生改变量的功能性Gasl蛋白的遗传变更，其中所述变异株的细胞在深层培养有氧发酵过程中，(i)与所述亲本株的细胞相比，产生出需要改变的搅拌量来维持预选的溶氧量的细胞发酵液，和/或(ii)与所述亲本株的细胞相比，产生出在预选的搅拌量下维持改变的溶氧量的细胞发酵液。
2.根据权利要求1所述的变异株，其中功能性Gasl蛋白的所述改变量为减少量，并且所述变异株在深层培养有氧发酵过程中，(i)与所述亲本株的细胞相比，产生出需要减少的搅拌量来维持预选的溶氧量的细胞发酵液，和/或(ii)与所述亲本株的细胞相比，产生出在预选的搅拌量下维持增加的溶氧量的细胞发酵液。
3.根据权利要求1或2所述的变异株，其中所述遗传变更包含所述亲本株中存在的gasl基因的破坏。
4.根据权利要求3所述的变异株，其中破坏所述gasl基因是缺失所述gasl基因的全部或部分所致。
5.根据权利要求3所述的变异株，其中破坏所述gasl基因是缺失包含所述gasl基因的基因组DNA的一部分所致。
6.根据权利要求3所述的变异株，其中破坏所述gasl基因是诱变所述gasl基因所致。
7.根据权利要求3-6中任一项所述的变异株，其中破坏所述gasl基因是使用位点特异性重组进行。
8.根据权利要求3-7中任一项所述的变异株，其中破坏所述gasl基因是与在所述gasl基因的遗传基因座处引入 可选择标记相结合进行。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的变异株，其中所述变异株不产生功能性Gasl蛋白。
10.根据权利要求1-8中任一项所述的变异株，其中所述变异株不产生Gasl蛋白。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的变异株，其中所述变异株还包含编码目的蛋白质的基因。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的变异株，还包含sfb3基因的破坏。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的变异株,还包含破坏至少一个选自sfb3基因、sebl基因、mpgl基因、crzl基因和tps2基因的基因。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的变异株，其中所述变异株每单位量生物质产生的蛋白质量与所述亲本株基本上相同或更多。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的变异株，其中所述丝状真菌是盘菌亚门(Pezizomycotina)物种。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的变异株，其中所述丝状真菌是木霉属(Trichoderma)物种。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的变异株，其中所述丝状真菌是里氏木霉(Trichoderma reesei)。
18.—种制备丝状真菌细胞的变异株的方法，包括:将遗传变更引入丝状真菌细胞的亲本株中，与所述亲本株的细胞相比所述遗传变更改变了功能性Gasl蛋白的产生，从而产生变异丝状真菌细胞，所述变异丝状真菌细胞在深层培养有氧发酵过程中，(i)与所述亲本株的细胞相比，产生出需要改变的搅拌量来维持预选的溶氧量的细胞发酵液，和/或(ii)与所述亲本株的细胞相比，产生出在预选的搅拌量下维持改变的溶氧量的细胞发酵液。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述遗传变更减少或防止功能性Gasl蛋白的产生，从而产生变异丝状真菌细胞，所述变异丝状真菌细胞在深层培养有氧发酵过程中，(i)与所述亲本株的细胞相比，产生出需要减少的搅拌量来维持预选的溶氧量的细胞发酵液，和/或(ii)与所述亲本株的细胞相比，产生出在预选的搅拌量下维持增加的溶氧量的细胞发酵液。
20.根据权利要求18或19所述的方法，其中所述遗传变更包括利用遗传操作破坏亲本丝状真菌细胞中的gasl基因。
21.根据权利要求18-20中任一项所述的方法，其中所述遗传变更包括利用遗传操作缺失亲本丝状真菌细胞中的gasl基因。
22.根据权利要求18-21中任一项所述的方法，其中所述遗传变更是使用位点特异性遗传重组进行。
23.根据权利要求18-22中任一项所述的方法，其中破坏所述gasl基因是与在所述gasl基因的遗传基因座处引入可选择标记相结合进行。
24.根据权利要求18-23中任一项所述的方法，其中破坏gasl基因是与破坏sfb3基因相结合进行。
25.根据权利要求18-24中任一项所述的方法，其中破坏gasl基因是与破坏至少一个选自sfb3基因、sebl基因、mpgl基因、crzl基因和tps2基因的基因相结合进行。
26.根据权利要求18-25中任一项所述的方法，其中所述变异株每单位量生物质产生的蛋白质量与所述亲本株基本上相同`或更多。
27.根据权利要求18-26中任一项所述的方法，其中所述丝状真菌是盘菌亚门物种。
28.根据权利要求18-27中任一项所述的方法，其中所述丝状真菌是木霉属物种。
29.根据权利要求18-28中任一项所述的方法，其中所述丝状真菌是里氏木霉。
30.根据权利要求18-29中任一项所述的方法，其中所述亲本株还包含编码目的蛋白质的基因。
31.根据权利要求30所述的方法，其中在引入所述减少或防止功能性Gasl蛋白的产生的遗传变更之前，所述编码目的蛋白质的基因存在于所述亲本株中。
32.一种目的蛋白质，所述蛋白质由根据权利要求11所述的变异株产生。
33.一种丝状真菌变异株，所述丝状真菌变异株通过根据权利要求18-31中任一项所述的方法产生。
34.一种衍自亲本株的丝状真菌变异株，所述变异株包含: (a)遗传变更，所述遗传变更导致(i)与所述亲本株的细胞相比，在深层培养物中需要减少的搅拌来维持预选的溶氧量，和/或(ii)与所述亲本株的细胞相比，在预选的搅拌量下维持深层培养物中增加的溶氧量，和 (b)编码目的蛋白质的基因， 其中所述编码目的蛋白质的基因在(a)中的所述遗传变更之前存在于所述变异株中。
35.根据权利要求34所述的变异株，其中所述遗传变更包含所述亲本菌株中存在的gasl基因的破坏。
36.根据权利要求35所述的变异株，其中破坏所述gasl基因是与在所述gasl基因的遗传基因座处引入可选择标记相结合进行。
37.根据权利要求35或36所述的变异株，其中破坏所述gasl基因是与破坏至少一个选自sfb3基因、sebl基因、mpgl基因、crzl基因和tps2基因的基因相结合进行。
38.根据权利要求35-37中任一项所述的变异株，其中破坏所述gasl基因是与破坏sebl基因 相结合进行。
【文档编号】C12N1/14GK103502266SQ201280019710
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2012年4月20日 优先权日:2011年4月22日
【发明者】E·A·博迪, R·J·普莱特二世 申请人:丹尼斯科美国公司