能转化包括阿拉伯糖和木糖的糖的酵母细胞的制作方法
【专利摘要】一种酵母细胞，其属于Saccharomyces属、已在其基因组中引入至少一个xylA基因和每种araA、araB和araD基因的至少一个并且能消耗包含葡萄糖、木糖和阿拉伯糖的混合的糖混合物，其中，所述细胞共消耗葡萄糖和阿拉伯糖、具有在适应性进化期间获得的遗传变异并在存在葡萄糖的情况下具有为0.25g木糖/h,g?DM或更大的比木糖消耗速率。
【专利说明】能转化包括阿拉伯糖和木糖的糖的酵母细胞
【技术领域】[0001]本发明涉及能够转化包括阿拉伯糖和木糖的糖的细胞。本发明进一步涉及其中使用这类细胞生产发酵产物比如乙醇的方法。
[0002]发明背景
[0003]最近几十年，传统化石燃料(基于石油的燃料)的大规模消耗造成了高水平的污染。这与化石燃料的世界储备有限的认识以及增长的环境意识一起刺激了研究替代性燃料(如乙醇)可行性的新动机，所述替代性燃料是比无铅汽油释放更少CO2 (以每升为基础)的无粒子燃烧燃料来源。尽管生物质衍生的乙醇可以通过得自许多不同来源的己糖的发酵来生产，但是，典型地用于商业规模生产燃料醇的底物如甘蔗和玉米淀粉是昂贵的。因此，燃料乙醇生产的提高需要使用更低成本的原料。目前，只有衍生自植物生物质的木质纤维素原料能够足量获得，用于代替目前用于乙醇生产的作物。除了 C6糖之外，大部分木质纤维素材料中还包含相当大的量的C5糖(包括阿拉伯糖和木糖)。因此，对于经济上可行的燃料生产工艺而言，己糖和戍糖均必须被发酵形成乙醇。酵母Saccharomyces cerevisiae(酿酒酵母)是强健的并且经充分改造适合乙醇生产，但是不能够转化阿拉伯糖和木糖。另外，没有一种天然存在的生物是已知能够以高乙醇产量以及高乙醇生产力将木糖或阿拉伯糖发酵成乙醇的。因此，对下述生物存在需要，所述生物具有这些特性从而能够以商业可行的方法从木质纤维素原料生产乙醇。在本申请的递交日尚未公布的共同待决专利申请(EP10160647.3和要求其优先权的PCT申请)中，描述了菌株BIE252。该菌株能发酵包括葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖和甘露糖的混合的糖组合物并生产发酵产物。菌株BIE252能转化所有这些糖，但是大多数情况下，葡萄糖最先消耗，其他糖随后消耗，人们期望的是葡萄糖和包括阿拉伯糖和木糖的C5-糖的共消耗，因为可以预期更短的发酵时间。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供能够转化包含葡萄糖、木糖和阿拉伯糖的混合的糖组合物的细胞，特别是酵母细胞。另一目的是提供这样的细胞，所述细胞以高的产率转化包含葡萄糖、木糖和阿拉伯糖的混合的糖组合物。另一目的是提供能共消耗C5和C6糖的细胞。另一目的是提供遗传上稳定的这种细胞。根据本发明实现了这些目的的一个或多个，本发明提供了属于Saccharomyces属、已将至少一个xylA基因和每种araA、araB和araD基因的至少一个引入其基因组中且能消耗包含葡萄糖、木糖和阿拉伯糖的混合的糖混合物的酵母细胞，其中所述细胞对葡萄糖和阿拉伯糖进行共消耗、具有适应性进化期间获得的遗传变异和在葡萄糖存在的情况下，具有为0.25g木糖/h，g DM或更大的比木糖消耗速率。
[0005]本发明的酵母细胞能以高产率转化包含葡萄糖、木糖和阿拉伯糖的混合的糖组合物。进一步地，酵母细胞具有如后文所述定义的高的生产力。这使得发酵时间减少。另外，酵母细胞是遗传上稳定的。当酵母用在工业工艺中，后者是有利的。
[0006]在一种实施方式中，酵母细胞是Saccharomyces cerevisiae。
[0007]附图简沭[0008]图1展示了在菌株S.cerevisiae BIE252的改进的培养物的SBR培养体系中，每一周期后，在阿拉伯糖和木糖上的生长速率。
[0009]图2展示了在BAM体系中在合成培养基上菌株BIE252的糖转化和产物形成。持续测量C02生产。通过随后的培养物的光密度值监测生长。预培养物在2%葡萄糖上生长。
[0010]图3展示了在BAM体系中在合成培养基上菌株BIE272的糖转化和产物形成。持续测量C02生产。通过随后的培养物的光密度值监测生长。预培养物在2%葡萄糖上生长。
[0011]图4展示了在AFM发酵中在10和20%干物质pCS下的实际水解产物中菌株BIE252和BIE272的木糖消耗。
[0012]图5展示了在AFM发酵中在10和20%干物质pCS下的实际水解产物中菌株BIE252和BIE272的阿拉伯糖消耗。
[0013]图6展示了在AFM发酵中在10和20%干物质pCS下的实际水解产物中菌株BIE252和BIE272产生的乙醇。
[0014]图7展示了在AFM发酵中在10和20%干物质pCS下的实际水解产物中菌株BIE252和BIE272产生的C02。
[0015]图8展示了在20%干物质下的预处理的、水解的玉米秸杆中菌株BIE272的性能。示出了乙醇生产和糖转化。
[0016]图9展示了菌株BI E272的稳定性性能。对直接分离自菌株BIE272的甘油菌(glycerol stock)的两个菌落和对在YEP2%葡萄糖中培养10、19、28、37和46代后的六个菌落测试其在补充有2%木糖的Verduyn培养基上生长的能力。柱的灰色部分表示展现木糖生长优于或等于参照菌株BIE272的菌落数目。柱的黑色部分表示落在后面的菌落的数目。实验一式两份进行。左图表示摇瓶I的结果，右图表示摇瓶2的结果。
[0017]图10展示了用溴化乙锭染色的CHEF凝胶。使用CHEF技术针对染色体大小分离染色体。分析的菌株是BIE104 ；BIE104A2Pla, (BIE104A2P1的同义词)；BIE104A2Plc ;菌株BIE201 ；BIE201X9 ;BIE252和BIE272。观察到染色体移动(见图文本)。菌株YNN295用作染色体大小的参照的标记菌株(Bio-Rad)。
[0018]图11展示了印迹到膜上并与PNCl探针杂交的CHEF凝胶的放射自显影。分析的菌株是 BIE104 ;BIE104A2Pla，(synonym of BIE104A2P1) ;BIE104A2Plc ;菌株 BIE201 ;BIE201X9 ；BIE252和BIE272。观察到染色体移动(见图文本)。
[0019]图12展示了印迹到膜上并与ACTl探针(左图，a)和xylA探针(右图，b)杂交的CHEF凝胶的放射自显影。分析的菌株是BIE104 ;BIE104A2Pla，(BIE104A2P1的同义词)；BIE104A2Plc ;菌株BIE201 ；BIE201X9 ;BIE252和BIE272。观察到染色体移动(见图文本)。
[0020]图13展示了菌株BIE104、BIE201、BIE252和BIE272的C02生产速率(以每分钟的ml CO2 表示)。
[0021]图14展示了菌株BIE104和BIE201的C02生产速率(以每分钟的ml CO2表示)。
[0022]图15展示了菌株BIE201和BIE252的C02生产速率(以每分钟的ml CO2表示)。
[0023]图16展示了菌株BIE252和BIE272的C02生产速率(以每分钟的ml CO2表示)。
[0024]图17展示了在BAM体系中在合成培养基上菌株BIE104的糖转化和产物形成。持续测量C02生产。通过随后的培养物的光密度值监测生长。
[0025]图18展示了在BAM体系中在合成培养基上菌株BIE201的糖转化和产物形成。持续测量C02生产。通过随后的培养物的光密度值监测生长。
[0026]图19展示了在BAM体系中在合成培养基上菌株BIE252的糖转化和产物形成。持续测量C02生产。通过随后的培养物的光密度值监测生长。
[0027]图20展示了在BAM体系中在合成培养基上菌株BIE272的糖转化和产物形成。持续测量C02生产。通过随后的培养物的光密度值监测生长。
[0028]图21展示了 PMAl-基因的标准化阅读深度(或覆盖度)。
[0029]图22展示了 xylA基因的标准化阅读深度(或覆盖度)。
[0030]序列表简沭
[0031 ] SEQ ID NO:1:合成 DNA，正向引物 xy 1A，CACCGTTAGCCTTGGCGTAAGC
[0032]SEQ ID NO: 2 合成 DNA，反向引物 xylA，CACTTTCGAACACGAATTGGC
[0033]SEQ ID NO: 3 合成 DNA，正向引物 ACTl，GTTACGTCGCCTTGGACTTCG
[0034]SEQ ID NO:4 合成 DNA，反向引物 ACTl，CGGCAATACCTGGGAACATGG
[0035]SEQ ID NO: 5 合成 DNA，正向引物 PNCl，GATAGAGACTGGCACAGGATTG
[0036]SEQ ID NO:6 合成 DNA，反向引物 PNCl，ACAATACTCCAAAGCTACACC [0037]SEQ ID NO:7野生型PMRl蛋白序列
[0038]SEQ ID NO:8酵母菌株BIE272的PMRl蛋白序列。
[0039]发明详沭
[0040]在本说明书和附带的权利要求书中，词语“包含”和“包括”及其语法变体如“包含”("comprises", 〃comprising〃)、“包括”("includes"和"including")应被解释为包含在内。也就是说，在上下文允许时，这些词语旨在传达可能包括未明确指出的其它元素或整数。
[0041]冠词“一”(“a”和“an”)在本文中被用于表示一个或多于一个(即一个或至少一个)所述冠词的语法客体。例如，“一元件”可表示一个元件或多于一个元件。
[0042]本文中，酵母细胞(单数或复数)也称为酵母菌株。
[0043]本文所述的本发明的多个实施方式可以交叉组合。
[0044]本发明涉及酵母细胞,其属于Saccharomyces属、已在其基因组中引入至少一个xylA基因和每种araA、araB、araD基因的至少一个并且能消耗包含葡萄糖、木糖和阿拉伯糖的混合的糖混合物，其中，所述细胞共消耗葡萄糖和阿拉伯糖并且在存在葡萄糖的情况下具有为0.25g木糖/h，g DM或更大的比木糖消耗速率。本文中DM是干的酵母生物质。
[0045]在一种实施方式中，在葡萄糖存在下比木糖消耗速率为0.25或更大，0.30或更大，0.35或更大，0.40或更大，或约0.41g木糖/h，g DM。在一种实施方式中，在葡萄糖存在下比木糖消耗速率为0.25至0.60g阿拉伯糖/h/gDM。在一种实施方式中，酵母细胞中araA>araB和araD基因的拷贝数目为每种三个或四个。在另一种实施方式中,酵母细胞具有约9或10个xylA的拷贝数目。
[0046]在另一种实施方式中，酵母细胞具有选自由下述突变组成的组的一种或更多种单核苷酸多态性:SSY1基因中的G1363T，YJR154w基因中的A512T，CEP3基因中的A1186G，GAL80基因中的A436C和PMRl基因中的A113G。
[0047]在一种实施方式中，酵母细胞具有GAL80基因中的A436C的单核苷酸多态性。任选地，其还具有CEP3基因中的A1186G的单核苷酸多态性或PMRl基因中的A113G的单核苷酸多态性。
[0048]在一种实施方式中，酵母细胞具有0.40g乙醇/g糖或更大或约0.42的产量。在另一种实施方式中，酵母细胞具有1.20或更大g EtOH/l，h的生产力。在一种实施方式中，酵母细胞具有1.25或更大，1.30或更大，1.35或更大，1.40或更大，1.45或更大，1.50或更大，1.55或更大，1.60或更大或1.65或更大g EtOH/l，h的生产力。在一种实施方式中，酵母细胞具有约1.69gEt0H/l，h的生产力。在本文中，生产力在发酵开始之后以0-24h的时间间隔测量。以其他时间间隔的酵母细胞的生产力也是高的。见表11。
[0049]本发明还涉及多肽，其具有包括PMRl中的替换Tyr38Cys的SEQ IDN0:7，产生SEQID N0:8的氨基酸序列；和其变体多肽，其中一个或更多其他位置可具有用SPCA(SecretoryPathway calcium ATP_ase)家族中的存在的保守氨基酸对氨基酸的突变。本发明还涉及用于从包含葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖和甘露糖的糖组合物中生产一种或更多发酵产物的方法，并且其中所述糖组合物用根据本发明的酵母细胞发酵。在所述工艺的一种实施方式中，糖组合物通过下述步骤产自木质纤维素材料:对一种或更多种木质纤维素材料预处理以生产预处理的木质纤维素材料；对预处理的木质纤维素材料进行酶处理以生产糖组合物。
[0050]在另一种实施方式中，在工艺中，发酵厌氧地进行。发酵产物可选自由下述组成的组:乙醇；正丁醇；异丁醇；乳酸；3_羟基-丙酸；丙烯酸；乙酸；琥珀酸；延胡索酸；苹果酸；衣康酸；马来酸；柠檬酸；己二酸；氨基酸，比如赖氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、苏氨酸和天冬氨酸；1，3_丙二醇；乙烯；甘油；(6 -内酰胺抗生素和头孢菌素；维生素；药物制剂；动物饲料添加剂；专用化学品；化学原料；塑料；溶剂；燃料，包括生物燃料和生物气或有机聚合物；和工业酶，比如蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶、葡聚糖酶、乳糖酶、脂肪酶、裂解酶、氧化还原酶、转移酶或木聚糖酶。
[0051 ] 在一种实施方式中，酵母细胞具有较之宿主菌株而言扩增的染色体，其中扩增的染色体具有与其中araA、araB和araD基因被引入宿主菌株的染色体相同的数目。在一种实施方式中扩增的染色体是染色体 VII。在一种实施方式中，在酵母细胞中，(较之宿主菌株)扩增了着丝粒(centromere)周围的部分染色体VII。在一种实施方式中，染色体VII的部分右臂扩增了两次并且邻近部分扩增了三次。
[0052]扩增三次的染色体VII右臂上的部分含有在强构建型启动子控制下的阿拉伯糖表达盒，即基因araA、araB和araD。
[0053]除了酵母细胞BIE201外，本发明还涉及具有araA、araB和araD基因的酵母细胞，其中染色体VII具有如后文所述的测量的如通过电泳测定的从1300至1400Kb或1375Kb的大小。
[0054]在一种实施方式中，在酵母细胞中，araA、araB和araD基因的拷贝数是每种2至10个，在一种实施方式中，每种2至8个或3至5个。araA、araB和araD基因的拷贝数可以是2、3、4、5、6、7、8、9或10个。拷贝数可以用对技术人员而言已知的方法测定，合适的方法在实施例中阐释，并且结果在例如图5中示出。
[0055]在一种实施方式中，酵母细胞的单核苷酸多态性的两种或多种选自由下述突变组成的组:SSY1基因中的G1363T、YJR154w基因中的A512T、CEP3基因中的A1186G、GAL80基因中的A436C和PMRl中的A113G。在一种实施方式中，酵母细胞具有单多态性，GAL80基因中的A436C。在一种实施方式中，酵母细胞具有单多态性，CEP3基因中的A1186G。在一种实施方式中，酵母细胞具有单多态性，PMRl中的A113G。
[0056]话应(adaption)
[0057]适应是一种进化过程，藉此种群变得更加适合(适应)其一种或多种栖息地(栖息地)。该过程在若干代到许多代中发生，并且是生物学的基本现象之一。
[0058]术语适应也可以表示对生物存活而言特别重要的特征。此类适应在可变种群中通过自然选择由更成功地进行繁殖的、更好地适应的形式生产。
[0059]环境条件的改变改变了自然选择的结果，影响了随后的适应的选择性益处(selective benefits),改善了生物在新条件下的适合度(fitness)。在极端环境改变的情况下，有益适应的出现和固定对存活而言可以是至关重要的。大量不同的因素(例如养分可用度、温度、氧可用度等等)能够驱动适应性进化。
[0060]例如，通过称为适应性进化的方法强化用对增强发酵阿拉伯糖的能力而言必要的基因或增强发酵阿拉伯糖的能力的基因(一起称为ARA)转化的单倍体酵母菌株。在适应性进化过程期间，向基因组中引入三个突变，称为mutl、mut2和mut3。这种酵母菌株的基因型可写为 mutlmut2mut3ARA。
[0061]话合度(Fitness)
[0062]适应性(在给定栖息地集合中生物能够生活和繁殖的程度)和适合度之间存在清楚的联系。适合度是自然选择率的一种估计量和预测器。通过应用自然选择，替代性表型的相对频率可随着时间而变化，如果它们可以遗传的话。
_3] 遗传改变/变异
[0064]当自然选择作用于种群的遗传变异性时，遗传改变是潜在的机制。通过这种方式，种群遗传适应于其环境。遗传改变可导致可见的结构，或者以适应改变的栖息地的方式调节生物的生理活性。
[0065]栖息地有可能频繁变化。因此，接着适应的过程从不会最终结束。及时地，可能出现环境逐步变化并且物种越来越好地适应其环境。另一方面，可能出现环境变化相对迅速并且接着物种越来越不能良好适应。适应是遗传过程，其在某种程度上一直在进行，当种群不改变栖息地或环境时也在进行。
[0066]DNA序列中的单个核苷酸可改变(置换)、去除(缺失)或添加(插入)。插入或缺失SNP(InDel)可转变翻译框。
[0067]单核苷酸多态性可落入基因的编码序列(开放阅读框或0RF)内、基因的非编码区域(如启动子序列、终止子序列等等)或基因之间的基因间区域。由于遗传密码的兼并性，编码序列中的SNP未必改变在转录和翻译之后产生的相应的蛋白质的氨基酸序列。其中两种形式产生相同多肽序列的SNP称为同义的(同义突变)。如果产生不同的多肽序列，它们是非同义的。非同义的变化可以是错义的或无义的。错义变化在相应的多肽中产生不同的氨基酸，而无义变化产生过早的终止密码子，有时导致形成截短的蛋白质。
[0068]例如通过改变的转录因子结合或相应的mRNA稳定性，不在蛋白质-编码区域的SNP可仍影响基因表达的结果。
[0069]可在DNA中出现的变化不必限于单个核苷酸的变化(置换、缺失或插入)，而是也可包含两个或多个核苷酸的变化(小细胞核变异)。[0070]另外，可出现染色体易位。染色体易位是由非同源染色体之间的部分重排造成的染色体畸形。
[0071]尤其，在根据本发明的细胞中，在下述阅读框中产生SNP:SSYU CEP3、GAL80和PMRl0
[0072]SSYl在这里是SPS质膜氨基酸传感器系统(Ssylp-Ptr3p-Ssy5p)的组分，其感知外部的氨基酸浓度并传送导致调节氨基酸通透酶基因表达的细胞内信号。
[0073]CEP3在这里是必须的动粒(kinetochore)蛋白质，CBF3复合物的组分,其结合着丝粒的CDEIII区域；包含N-末端Zn2Cys6类型锌指结构域、C-末端酸性结构域和推测的卷曲螺旋二聚化结构域。
[0074]GAL80在这里是参与在缺少半乳糖的情况下抑制GAL基因的转录调节子。通常其通过Gal4p抑制转录活性并通过Gal3p或Gallp结合释放抑制。
[0075]本文中PMRl (系统名称YGL167C)是将Ca2+和Mn2+运输进高尔基体(Golgi)中所需要的高亲和性Ca2+/Mn2+P-型ATP酶；其参与Ca2+依赖型蛋白的分类和处理。Pmrlp是已知被称为SPCA(分泌途径Ca2+-ATP酶)的转运蛋白家族的原型，SPCA的成员在真菌、C.elegans、D.melanogaster 和哺乳动物中找到。
[0076]根据本发明，已经显示基因SSY1、CEP3、GAL80和PMRl中的SNP对于细胞能够发酵混合糖组合物而言是重要的。
[0077]进行BLAST搜索用于在这些基因中发现SNP。
[0078]经鉴定的SNP的概况在表1中给出:
[0079]表1:SNP的概况
基因 ORF中核苷酸突变位j蛋白质中氨基酸突变位j
【权利要求】
1.一种酵母细胞，其属于Saccharomyces属、已在其基因组中引入至少一个xylA基因和每种araA、araB、araD基因的至少一个并且能消耗包含葡萄糖、木糖和阿拉伯糖的混合的糖混合物，其中，所述细胞共消耗葡萄糖和阿拉伯糖、具有在适应性进化期间获得的遗传变异并且在存在葡萄糖的情况下具有为0.25g木糖/h，g DM或更大的比木糖消耗速率。
2.根据权利要求1所述的酵母细胞，其中所述酵母细胞是Saccharomycescerevisiae。
3.根据权利要求1或2所述的酵母细胞，其中，在存在葡萄糖的情况下比木糖消耗速率为0.35g木糖/h, g DM或更大。
4.根据权利要求1至3任一项所述的酵母细胞，其中，在存在葡萄糖的情况下比木糖消耗速率为0.25g-0.60木糖/h, g DM。
5.根据权利要求1至4任一项所述的酵母细胞,其中,所述每种araA、araB和araD基因的拷贝数目为3个或4个。
6.根据权利要求1至5任一项所述的酵母细胞，其中所述xylA的拷贝数目是约9个或10个。
7.根据权利要求1至6任一项所述的酵母细胞，其具有选自由下述突变组成的组的一种或多种单核苷酸多态性=SSYl基因中的G1363T、YJR154w基因中的A512T、CEP3基因中的A1186G、GAL80基因中的A436C和PMRl基因中的A113G。
8.根据权利要求6所述的酵母细胞，其具有GAL80基因中A436C的单多态性。
9.根据权利要求6所述的酵母细胞，其还具有CEP3基因中的A1186G的单核苷酸多态性。
10.根据权利要求6或7所述的酵母细胞，其具有PMRl基因中的A113G的单核苷酸多态性。
11.根据权利要求1-10任一项所述的酵母细胞，其中所述酵母细胞具有0.40g乙醇/g糖或更大或约0.42g乙醇/g糖的产量。
12.根据权利要求1-10任一项所述的酵母细胞，其中所述酵母细胞具有在发酵开始后以0-24h的时间间隔测量的1.20g EtOH/1, h或更大或1.69g EtOH/1, h的生产力。
13.具有序列SEQID N0:8的多肽及其变体多肽，其中一个或多个其他位置可具有用SPCA家族中的已有的保守氨基酸对氨基酸的突变。
14.从包含葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和木糖的糖组合物生产一种或多种发酵产物的方法，其中用根据权利要求1至8任一项所述的酵母细胞发酵所述糖组合物。
15.根据权利要求10所述的方法，其中所述糖组合物通过下述步骤从木质纤维素材料生产: a)预处理一种或多种木质纤维素材料以生产预处理的木质纤维素材料； b)酶处理所述预处理的木质纤维素材料以生产所述糖组合物。
16.根据权利要求10或11所述的方法，其中所述发酵是厌氧进行的。
17.根据权利要求10-12任一项的方法，其中所述发酵产物选自由下述产品组成的组:乙醇；正丁醇；异丁醇；乳酸；3_羟基-丙酸；丙烯酸；乙酸；琥珀酸；延胡索酸；苹果酸；衣康酸；马来酸；柠檬酸；己二酸；氨基酸，比如赖氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、苏氨酸和天冬氨酸；1，3_丙二醇；乙烯；甘油；(6-内酰胺抗生素和头孢菌素；维生素；药物制剂；动物饲料添加剂；专用化学品；化学原料；塑料；溶剂；燃料，包括生物燃料和生物气或有机聚合物；和工业酶，比如蛋白酶、纤维素酶、淀粉 酶、葡聚糖酶、乳糖酶、脂肪酶、裂解酶、氧化还原酶、转移酶或木聚糖酶。
【文档编号】C12N1/36GK103502267SQ201280019816
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2012年4月20日 优先权日:2011年4月22日
【发明者】保罗·克莱斯森, 比安卡·伊丽莎白·玛丽亚·吉勒森, 吉斯博蒂娜·皮特奈拉·范·苏勒库姆, 帕那吉帝斯·萨拉帝诺普罗斯, 威尔伯特·赫尔曼·马里·海涅, 艾尔杜·格里夫 申请人:帝斯曼知识产权资产管理有限公司