o Liu,et al.A multiplex RT-PCR for detection of type A influenza virus and differentiation of avian H5, H7, and H9hemagglutinin subtypes[J]. Molecular and Cellular Probes, 2006, 20(3-4) :245-249. "中公开过，公众可从广西壮族自治区兽医 研究所获得。
[0042] H5N2 亚型 AIV(A/Turkey/GA/209092/02(H5N2))在文献"彭宜，谢芝勋，刘 加波，等.H5亚型禽流感病毒RT-LAMP可视化检测技术的建立[J].南方农业学报， 2013, 02:323-327. "中公开过，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。
[0043] H6N2 亚型 AIV(A/duck/Guangxi/GXd-3/2009(H6N2))在文献"Peng Y，Xie Z, Liu J，et al. Epidemiological Surveillance of Low Pathogenic Avian Influenza Virus (LPAIV)from Poultry in Guangxi Province,Southern China. [J].PL0S ONE，2013, 8 (10) : 1-6. "中公开过，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。
[0044] H6N6 亚型 AIV(A/duck/Guangxi/GXd-7/2011(H6N6))在文献"Peng Y，Xie Z, Liu J,et al.Epidemiological Surveillance of Low Pathogenic Avian Influenza Virus(LPAIV)from Poultry in Guangxi Province, Southern China. [J]. PL0S ONE，2013, 8 (10) : 1-6. "中公开过，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。
[0045] H7N2 亚型 AIV(A/Chicken/NY/273874/03(H7N2))在文献"谢芝勋，庞耀珊，邓 显文，等.H5和H7亚型禽流感病毒多重反转录聚合酶链反应快速检测及鉴别方法的建立 [J]. "中公开过，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。
[0046] 新城疫病毒（lasota)、传染性支气管炎病毒（M41)、鸡毒支原体（MG S6)在文献 "彭宜，谢芝勋，郭捷，等.利用RT-LAMP可视化检测技术检测H1亚型禽流感病毒及N1、 N2亚型的分型"，病毒学报，2013, 29 (2) : 154-159. "中公开过，公众可从广西壮族自治区兽 医研究所获得。
[0047] 鸡传染性喉气管炎病毒（AV1231)、禽呼肠孤病毒鸡毒（S1133)在文献"Xie Z，Luo S, Xie L, et al. Simultaneous typing of nine avian respiratory pathogens using a novel GeXP analyzer-based multiplex PCR assay[J]. J Virol Methods. 201412 ； 207C: 188-195. "中公开过，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。
[0048] A/Duck/Guangxi/1/00(H9N2)、A/Duck/Guangxi/2/00(H9N2)、A/Duck/ Guangxi/3/00(H9N2)在文献"Zhixun Xie, Yao-shan Pang, Jiabo Liu, et al.A multiplex RT-PCR for detection of type A influenza virus and differentiation of avian H5, H7,and H9hemagglutinin subtypes[J]. Molecular and Cellular Probes, 2006, 20(3-4) :245-249. "中公开过，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。
[0049] A/chicken/China/Guangxil/2000(H9N2)、A/chicken/China/ Guangxi 14/2000 (H9N2)、A/chicken/China/Guangxi 17/2000 (H9N2)在文献 "Xie Z X，Dong J B, Tang X F, et al. Sequence and phylogenetic Analysis of Three Isolates of Avian Influenza H9N2from Chickens in Southern China[J]. Scholarly Research Exchange. Volume 2008. 1-7, Article ID 802317. doi :10. 3814/2008/802317." 中公开过，公众可从 广西壮族自治区兽医研究所获得。
[0050] A/duck/Guangxi/RX/09(H9N2)在文献"彭宜，谢芝勋，郭捷，等·利用 RT-LAMP可视化检测技术检测H1亚型禽流感病毒及Nl、N2亚型的分型"，病毒学 报，2013, 29 (2) : 154-159. "中公开过，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。
[0051] A/chicken/Guangxi/067C4/2010(H9N2)在文献"Peng Y，Xie Z X，Liu J B，etal. Epidemiological Surveillance of Low Pathogenic Avian Influenza Virus(LPAIV)from Poultry in Guangxi Province, Southern China[J]. PLoS ONE, 2013, 8 (10):e77132doi:10 .1371/journal. pone. 0077132. "中公开过，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。
[0052] A/chicken/Guangxi/LS/2013(H9N2)序列信息收录于NCBI基因库，登录号为 KM070507-KM070514。
[0053] 实施例1、三重RT-PCR条件的确定
[0054] -、引物的设计与合成
[0055] 设计并合成针对H9亚型、N2亚型AIV及各种不同亚型AIV Μ基因的3对特异性 引物，引物序列如表1所示，引物储存液浓度为25ρπι〇1/μ L，-30°C保存备用。
[0056] 表1 3对特异性引物的核苷酸序列
[0057]
[0058] 二、参照病毒DNA/RNA抽提试剂盒使用说明书对H9N2亚型AIV、H1N1亚型AIV、 H1N2 亚型 AIV、H3N2 亚型 AIV、H3N6 亚型 AIV、H3N8 亚型 AIV、H4N2 亚型 AIV、H4N5 亚型 AIV、H6N2亚型AIV、H6N6亚型AIV、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、禽呼肠孤病毒的RNA 以及对鸡传染性喉气管炎病毒和鸡毒支原体的DNA进行抽提，抽提后的RNA、DNA分别用 33μL、5〇μ? DEPC水溶解。向RNA抽提产物中加入500ng国际通用流感病毒反转录引物 Unil2primer (序列：5,-AGCAAAAGCAGG-3'（SEQ ID Νο·7))(参见文献"Hoffmann E，Stech J, Guan Y, Webster RG, Perez DR. 2001.Universal primer set for the full-length amplification of all influenza A viruses. Arch Virol. 146:2275-2289. ^),70^ lOmin ； 冰浴5min;加入反转录体系：10yL 5XAMV Buffer、4yL dNTP、0.5yL RNA酶抑制剂、lyL AMV反转录酶，瞬时离心，42°C放置90min，制备得到cDNA。所有抽提所得的DNA及反转录 所得的cDNA置-30°C保存备用。
[0059] 三、三重RT-PCR条件的优化
[0060] 通过对三重RT-PCR的引物浓度配比及反应参数（包括时间和温度）进行优化，筛 选出三重RT-PCR最佳反应体系及反应模式，最后确定三重RT-PCR条件如下：
[0061] PCR 反应体系（总体系为 25uL) :2XEasyTaq PCR SuperMix 12. 5μ L，步骤二得到 的模板DNA或cDNA 1 μ L，浓度为25pmol/ μ L的引物H9-F、H9-R各0. 5 μ L，浓度为25pmol/ μ L 的引物 N2-F、N2-R 各 0. 7 μ L、浓度为 25pmol/ μ L 的引物 M-F、M-R 各 0. 4 μ L，用 ddH20 补充体系至25 μ L。
[0062] PCR 反应程序：94°C预变性 5min ;94°C变性 40s，54°C退火 40s，72°C延伸 lmin，35 个循环；72°C延伸10min，4°C结束反应。
[0063] 实施例2、特异性试验
[0064] -、按照实施例1中步骤二的方法提取H9N2亚型AIV(A/turtledove/ Guangxi/49B6/2013(H9N2))、H1N1 亚型 AIV (A/Duck/Guangxi/030D/2009(H1N1))、H1N2 亚型 AIV(A/Sparrow/Guangxi/GXs-l/2012(HlN2))、H3N2 亚型 AIV(A/Duck/Guangxi/ N42/2009 (H3N2))、H3N6 亚型 AIV (A/Pigeon/Guangxi/020P/2009 (H3N6))、H3N8 亚型 AIV (A/ Goose/Guangxi/020G/2009 (H3N8))、H4N2 亚型 AIV (A/duck/Guangxi/12roi7/2012 (H4N2))、 H4N5 亚型 AIV(A/Duck/HK/668/79(H4N5))、H6N2 亚型 AIV(A/duck/Guangxi/ GXd-3/2009(H6N2))、H6N6 亚型 AIV(A/duck/Guangxi/GXd-7/2011(H6N6))、新城疫病 毒（lasota)、传染性支气管炎病毒（M41)、禽呼肠孤病毒鸡毒（S1133)的RNA，并反转录 为 cDNA ;H5N2 亚型 AIV(A/Turkey/GA/209092/02(H5N2))和 H7N2 亚型 AIV(A/Chicken/ NY/273874/03(H7N2))的RNA由为美国宾夕法尼亚州立大学禽病诊断研究室惠赠，直接反 转录为cDNA。提取鸡传染性喉气管炎病毒（AV1231)、鸡毒支原体（MG S6)的DNA。
[0065] 二、利用实施例1中步骤三优化后的三重RT-PCR反应体系及程序，对步骤一得到 的各个DNA进行RT-PCR扩增，同时以ddH20代替模板作为阴性对照，进行上述反应，得到各 个PCR扩增产物。
[0066] 将各个PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示。
[0067] 图 1 中，Μ 为 DNA 标准 DL1000 ;1 :H9N2 亚型