AIV(A/turtledove/ Guangxi/49B6/2013(H9N2)) ;2:H1N1 亚型 AIV(A/Duck/Guangxi/030D/2009(H1N1)); 3 :H1N2 亚型 AIV(A/Sparrow/Guangxi/GXs-l/2012(HlN2)) ;4:H3N2 亚型 AIV(A/Duck/ Guangxi/N42/2009(H3N2)) ;5:H3N6 亚型 AIV(A/Pigeon/Guangxi/020P/2009(H3N6)); 6:H3N8 亚型 AIV(A/Goose/Guangxi/020G/2009(H3N8)) ;7:H4N2 亚型 AIV(A/duck/ Guangxi/12roi7/2012(H4N2)) ;8:H4N5 亚型 AIV(A/Duck/HK/668/79(H4N5)) ;9:H5N2 亚型 AIV(A/Turkey/GA/209092/02(H5N2)) ;10:H6N2 亚型 AIV(A/duck/Guangxi/ 6父(1-3/2009(册吧））；11:册呢亚型八1￥仏/(1以^/6皿即叉丨/6父(1-7/2011(册呢）） ；12:!17吧亚 型八1￥仏/〇1。1?511/附/273874/03〇17吧)）；13:新城疫病毒（1 &8(^&);14:传染性支气管炎 病毒（M41) ;15 :传染性喉气管炎病毒（AV1231) ;16 :鸡毒支原体（MG S6) ;17 :禽呼肠孤病 毒鸡毒（S1133) ; 18 :阴性对照。
[0068] 图1表明，H9N2亚型AIV扩增出现三条目的条带（667bp、451bp和313bp);对 H1N2、H3N2、H4N2、H5N2、H6N2、H7N2 亚型 AIV 的扩增出两条目的条带 ^67bp 和 451bp)，对 H1N1、H3N6、H3N8、H4N6、H6N6亚型AIV的扩增出现了 一条目的条带（667bp)，而对新城疫病 毒（lasota)、传染性支气管炎病毒（M41)、传染性喉气管炎病毒（AV1231)、鸡毒支原体（MG S6)及禽呼肠孤病毒鸡毒（S1133)及阴性对照扩增未出现任何目的条带。以上结果均与预 计结果相一致，说明所建立的三重RT-PCR方法具有良好的特异性。
[0069] 三、用步骤一和步骤二同样的方法对不同年份、不同宿主的H9N2亚型AIV (A/ Duck/Guangxi/1/00 (H9N2)、A/Duck/Guangxi/2/00 (H9N2)、A/Duck/Guangxi/3/00 (H9N2)、 A/chicken/China/Guangxil/2000 (H9N2) > A/chicken/China/Guangxi 14/2000 (H9N2) > A/chicken/China/Guangxi 17/2000 (H9N2)、A/duck/Guangxi/RX/09 (H9N2)、A/chicken/ Guangxi/067C4/2010 (H9N2)、A/turtledove/Guangxi/49B6/2013 (H9N2)、A/chicken/ Guangxi/LS/2013 (H9N2)等进行扩增后，得到PCR扩增产物，扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结 果如图2所示。
[0070] 图 2 中，Μ 为 DNA 标准 DL1000 ; 1-20 为 20 株 H9N2AIVs。
[0071] 图2表明，20株H9N2AIVS均出现三条与预期大小相符的目的条带^67bp、451bp 和313bp)，说明该三重RT-PCR方法的实用性好。
[0072] 实施例3、敏感性试验
[0073] -、按照实施例1中步骤二的方法提取H9N2亚型AIV(A/turtledove/ Guangxi/49B6/2013 (H9N2))的RNA并反转录为cDNA，测定cDNA模板的浓度，并用超纯水将 其倍比稀释成 lOOng/μ L、10ng/y LUng/μ LUOOpg/μ L、10pg/y LUpg/μ LUOOfg/μ L。
[0074] 二、利用实施例1中步骤三优化后的三重RT-PCR反应体系及程序，对步骤一得到 的各个浓度的cDNA进行RT-PCR扩增，同时ddH20代替模板作为阴性对照，进行上述反应， 得到各个PCR扩增产物，以此检测敏感性。
[0075] 将各个PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图3所示。
[0076] 图 3 中，M :DNA 标准 DL1000 ;1 :100ng/y L H9N2 ;2 :10ng/y L H9N2 ;3 dng/μ L H9N2;4:100pg/yL H9N2;5:10pg/yL H9N2;6:lpg/yL H9N2;7:100fg/yL H9N2;8:阴 性对照。
[0077] 表3表明，该三重RT-PCR最低能检出浓度为10pg/ μ L的H9N2亚型AIV cDNA模 板。
[0078] 实施例4、临床样品检测
[0079] -、对120份从广西南宁市活禽市场采集的咽喉和泄殖腔拭子进行无菌PBS缓冲 液冲洗溶解处理，得到各个拭子样品溶液。按照实施例1中步骤二的方法提取各个样品溶 液的RNA并反转录为cDNA。
[0080] 二、利用实施例1中步骤三优化后的三重RT-PCR反应体系及程序，对步 骤一得到的各个cDNA进行RT-PCR扩增，同时以H9N2亚型AIV(A/turtledove/ Guangxi/49B6/2013(H9N2))的cDNA为模板作为阳性对照，以ddH20代替模板作为阴性对 照，进行上述反应，得到各个PCR扩增产物。实验重复三次，保证实验的准确性。
[0081] 三、同时对这120份样品用传统鸡胚接种的方法进行病原分离，并用传统血清学 方法鉴定各个样品中所分离的病毒的亚型（具体可参考文献"殷震，刘景华.动物病毒学 [M].第2版.北京：科学出版社，1997:733-734.)，以验证本发明的方法的准确性。
[0082] 将各个拭子样品的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，部分结果如图4所示。
[0083] 图4中，M :DNA标准DL1000 ;1 :H9N2亚型AIV阳性对照；2-20为标号为2-20的各 个拭子样品；21 :阴性对照。
[0084] 图 4 表明，阳性对照 H9N2 亚型 AIV(A/turtledove/Guangxi/49B6/2013(H9N2))扩 增出现三条目的条带（667bp、451bp和313bp);标号为4, 20的拭子样品扩增出667bp的 目的条带，并且标号为4, 20的拭子样品含有的AIV经血清学鉴定均为非H9亚型、非N2亚 型的AIV ;标号为7, 13, 18的拭子样品扩增出667bp和451bp的目的条带，并且上述标号为 7, 13, 18的拭子样品含有的AIV经血清学鉴定为非H9亚型的N2亚型AIV ;标号为8, 15的 拭子样品扩增出现三条目的条带（667bp、451bp和313bp)，并且标号为8, 15的拭子样品含 有的AIV经血清学鉴定为H9N2亚型的AIV ;标号为2, 3, 5, 6, 9, 10, 11，12, 14, 16, 17, 19的 拭子样品没有目的条带产生，经鉴定不含有AIV，阴性对照也无目的条带产生。
[0085] 120份从广西南宁市活禽市场采集的口腔和粪便拭子样品，经三重RT-PCR检测， 有9份呈H9N2亚型AIV阳性，阳性率为7. 50%;14份呈N2亚型（非H9亚型）AIV阳性，阳 性率为11. 67% ;22份呈其它亚型（非H9亚型、非N2亚型）AIV阳性，阳性率为18. 33% ; 75份呈AIV阴性，该结果与用传统血清学方法鉴定的各个样品含有的病毒的亚型鉴定结果 一致，说明本方法可以应用于临床样品检测。
【主权项】
1. 一组引物，由如下（1)-(6)所示的DNA分子组成： (1) SEQIDNo. 1 所示的DNA分子； (2) SEQIDNo. 2 所示的DNA分子； (3) SEQIDNo. 3 所示的DNA分子； (4) SEQIDNo. 4 所示的DNA分子； (5) SEQIDNo. 5 所示的DNA分子； (6) SEQIDNo. 6 所示的DNA分子。2. -种鉴定或辅助鉴定待测样品中禽流感病毒及待测样品中H9亚型和/或N2亚型禽 流感病毒的试剂盒，该试剂盒包含权利要求1所述的引物。3. -种鉴定或辅助鉴定待测样品中禽流感病毒及待测样品中H9亚型和/或N2亚型禽 流感病毒的方法，包括如下步骤：以待测样品的cDNA为模板，以权利要求1所述的引物为引 物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；如果PCR扩增产物含有大小为667bp的条带，则待测样 品候选为含有禽流感病毒的样品；如果PCR扩增产物同时含有大小分别为667bp和313bp 的条带，则待测样品候选为含有H9亚型禽流感病毒的样品；如果PCR扩增产物同时含有大 小分别为667bp和451bp的条带，则待测样品候选为含有N2亚型禽流感病毒的样品；如果 PCR扩增产物同时含有大小分别为667bp、451bp和313bp的条带，则待测样品候选为含有 H9N2亚型禽流感病毒的样品。4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述PCR的反应体系如下：2XPCR扩增缓 冲液12. 5uL，浓度均为25pmol/uL的SEQIDNo. 1所示的DNA分子和SEQIDNo. 2所示的 DNA分子各0. 5μL，浓度均为25pmol/uL的SEQIDNo. 3所示的DNA分子和SEQIDNo. 4 所示的DNA分子各0. 7μL，浓度均为25pmol/uL的SEQIDNo. 5所示的DNA分子和SEQID No. 6所示的DNA分子各0. 4μL，模板cDNAluL，加ddH20补足体系至25uL。5. 根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述PCR的反应程序如下： 94°C5min;94°C40s，54°C40s，72°Clmin，35 个循环；72°C延伸lOmin，最后 4°C结束反应。6. 权利要求1所述的引物在制备鉴定或辅助鉴定待测样品中禽流感病毒及待测样品 中H9亚型和/或N2亚型禽流感病毒的产品中的应用。7. 权利要求2所述的试剂盒在制备鉴定或辅助鉴定待测样品中禽流感病毒及待测样 品中H9亚型和/或N2亚型禽流感病毒的产品中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种检测禽流感病毒及其H9、N2亚型的引物及其应用。本发明公开一组引物，由如下(1)-(6)所示的DNA分子组成：(1)SEQ？ID？No.1所示的DNA分子；(2)SEQ？ID？No.2所示的DNA分子；(3)SEQ？ID？No.3所示的DNA分子；(4)SEQ？ID？No.4所示的DNA分子；(5)SEQ？ID？No.5所示的DNA分子；(6)SEQ？ID？No.6所示的DNA分子。本发明公开的三重RT-PCR是一种简便、快速、有效的检测AIV且能同时进行H9、N2亚型AIV分型检测的技术，具有较好的应用前景。
【IPC分类】C12Q1/70, C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105441430
【申请号】CN201410408499
【发明人】谢芝勋, 徐倩, 谢丽基, 罗思思, 黄莉, 黄娇玲, 曾婷婷, 谢志勤, 邓显文
【申请人】广西壮族自治区兽医研究所
【公开日】2016年3月30日
【申请日】2014年8月19日