8.0,重复检测，如果结果一致，判断为H5 亚型禽流感病毒阳性，如无扩增信号，则判断为H5亚型禽流感病毒阴性。
[0033] HEX通道：1)阳性:待测样本检测结果Ct< 35.0,扩增曲线呈S型且有明显指数增长 期，判断为N6亚型禽流感病毒阳性;2)阴性:待测样本检测结果Ct>38.0,判断为N6亚型禽 流感病毒阴性;3)可疑:待测样本结果35.0<Ct<38.0,重复检测，如果结果一致，判断为N6 亚型禽流感病毒阳性，如无扩增信号，则判断为N6亚型禽流感病毒阴性。
[0034]本发明通过两对引物在同一管中进行扩增，实现了双重检测，大大缩短了检测时 间，操作简便，特异性引物和探针的设计包含了引物和探针的高度保守和特异性，避免了两 对引物和探针间无互补配对和交叉扩增的情况.本发明选用的两个荧光基团波长相差较大 且信号强度相近，避免了信号之间的相互干扰。
[0035] 发明人对利用上述试剂盒和方法进行H5N6亚型禽流感病毒基因实时荧光RT-PCR 扩增阳性的病例咽拭子标本进行病毒核苷酸测序，测序结果表明该病毒为H5N6亚型禽流感 病毒，显示了本发明的准确性。
[0036]本发明的检测试剂盒能够快速检测A型H5N6型禽流感病毒，具有操作简单、灵敏度 高、特异性好的优点，能为A型H5N6亚型禽流感病毒的监测和临床诊断提供一种高效的检测 手段.
【附图说明】
[0037]为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本 发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以 根据这些附图获得其他的附图.
[0038]图1本发明所述试剂盒及方法进行H5N6亚型禽流感病毒H5和N6基因实时荧光RT-PCR扩增后结果。
[0039] H5-基因阳性标准品：为H5基因阳性标准品扩增曲线;N6-基因阳性标准品：为N6基 因阳性标准品扩增曲线;H5-病例和N6病例分别为待检测样品咽拭子H5基因和N6基因检测 结果，从扩增结果显示，待检测样品为H5N6阳性病例.
[0040]图2本发明所述试剂盒及方法H5引物/探针检测H5基因片段的敏感度结果.
[0041 ] H5基因片段 10倍系列稀释(H5-2 · 5 X 107到H5-2 · 5 X 102)后扩增，H5-2 · 5 X 107到 H5-2.5 X 102拷贝/反应均出现阳性扩增结果，表明H5引物/探针检测H5基因片段的敏感度 结果为2.5X10 2拷贝/反应。
[0042]图3本发明所述试剂盒及方法N6引物/探针检测N6基因片段的敏感度结果。
[0043] N6 基因片段 10 倍系列稀释(N6-2.5X 107 到 N6-2.5X 101)后扩增，N6-2.5X 107 到 N6-2.5 X 101拷贝/反应均出现阳性扩增结果，表明N6引物/探针检测N6基因片段的敏感度 结果为2.5X10 1拷贝/反应·
【具体实施方式】
[0044] 下列实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内.
[0045]实施例1: H5N6亚型禽流感病毒双通道实时荧光PCR检测试剂盒中引物对、探针的 设计和合成
[0046]针对H5N6病毒的HA基因和NA基因，寻找其保守序列位点，设计特异性扩增H5基因、 N6基因的引物对和探针。
[0047] H5探针的5'标记有FAM荧光基团，3'标记有BHQ1猝灭基因；
[0048] N6探针的5'标记有HEX荧光基团，3'标记有BHQ1猝灭基团；
[0049]所述的引物对1为扩增H5基因的引物对，其上游引物H5-F为Seq ID No.l所示序 列，下游引物耶_1?为369 10如.2所示序列；
[0050] Seq ID No.l:5-ATTGCTCCAGAATATGCATA-3;
[0051] Seq ID No.2:5-AGARTTTATCGCCCCTATTG-3;
[0052] 所述的引物对2为扩增N6基因的引物对，其上游引物N6-F为Seq ID No. 3所示序 列，
[0053] 下游引物N6-R为Seq ID No .4所示序列；
[0054] Seq ID No.3:5-GGGTCGARTGCAYAGGATG-3;
[0055] Seq ID No.4:5-TACCACACYACTRCCGATG-3;
[0056] 所述引物对1对应的探针!1511(*6为56110如.5所示的序列，
[0057] Seq ID No.5:5-FAM-CAAAATWGTCAAGAAAGGGG-BHQl-3;
[0058] 所述的引物对2对应的探针N6_probe为Seq ID No.6所示的序列；
[0059] Seq ID No.6:5-Hex-AAGCACGYCATGCCAYGATG-BHQl-3;
[0060] 实施例2: H5N6亚型禽流感病毒双通道核酸检测试剂盒的制备
[0061 ] H5N6亚型禽流感病毒HA和NA基因的双通道核酸检测试剂盒反应体系由RT-PCR反 应液、引物和探针混合液、酶混合液、阳性标准品、阴性标准品组成.
[0062] RT-PCR反应液中：含有50mM MgS〇4、0.4mM dNTPs、ddH20;
[0063] 引物和探针混合液:将实施例1中H5及N6特异性引物、探针用水溶解，按照H5-F和 N6-F引物浓度均为20μΜ，H5-R和N6-R引物浓度均为40μΜ，H5和N6探针浓度为20μΜ混合，即为 引物和探针混合液；
[0064] 酶混合液:含有逆转录酶、Taq酶，浓度为2IU/yL;
[0065] 试剂盒每管20.0 yL，其中RT-PCR反应液16. OyL、引物和探针混合液3. OyL、酶混合 液1.OyL。
[0066] 使用时，加入5. OuL待检测样品提取的RNA模板即可。
[0067]实施例3 :H5N6亚型禽流感病毒双通道核酸检测试剂盒特异性检测
[0068] 诊断试剂性能评估中，灵敏度和特异性是两个关键的指标，能够反映试剂盒的诊 断能力。特异性是指诊断试剂能够将从阴性样品中准确判断出真阴性的能力。
[0069] 取9份流感病毒毒株或样本，其中包括A型季节性流感毒株3株，B型季节性流感病 毒2株，H5N1亚型禽流感病毒样本1份，H9N2亚型禽流感病毒样本1份，H7N9亚型禽流感病毒 样本1份，疑似人感染H5N6亚型禽流感病毒样本1份.
[0070] 该9份样品信息分别为疑似人感染H5N6亚型禽流感病毒标本（A/changsha/1/ 2014)、A型季节性流感病毒毒株（H1N1: A/Yuelu/314/2009，HlNlpdm09: A/changsha/78/ 2009，!13呢:4/湖南开福/1648/2015)，8型季节性流感病毒毒株(8￥ :8/0^即81^/138/2012， BV:B/Changsha/118/2012)，H5N1亚型禽流感病毒阳性样本(A/environment/Changsha/1/ 2009)、H9N2亚型禽流感病毒阳性样本(4/611￥；[1'0111116111:/01&1^811&/6/2009)和!17_亚型禽流 感病毒阳性样本(A/Changsha/2/2013)，上述供试毒株及阳性样本，由申请人保存。
[0071] 将上述9份流感病毒毒株或样本，提取病毒RNA的提取.具体为取200yL待测毒株及 样本，利用Qiagen公司的QIAamp Viral RNA Mini Kit提取RNA.
[0072] 实时荧光RT-PCR扩增，在标明编号的PCR反应管中加入扩增反应液16. OyL、引物混 合液3.0yL、待检模板5.0yL和酶混合液Ι.ΟμΜ并单独加入阳性标准品和阴性标准品，一同 进行PCR扩增。
[0073] 将上述PCR反应管混勾短暂离心后，置于AB7300real_time PCR system或Roche LightCycler?480II PCR仪内进行以下反应：①50°C30min，②95°C10min，③95°C