15sec，④ 55°C45sec，其中③-④循环40次.其中在④步骤收集荧光信号，其中FAM通道为H5，HEX通道 为N6.
[0074]当PCR结束后，在仪器正常，阳性标准品和阴性标准品均正常的情况下进行结果分 析(FAM通道为H5，HEX通道为N6).
[0075] FAM通道：1)阳性:待测样本检测结果Ct< 35.0,扩增曲线呈S型且有明显指数增长 期，判断为H5亚型禽流感病毒阳性;2)阴性:待测样本检测结果Ct>38.0,判断为H5亚型禽 流感病毒阴性;3)可疑:待测样本结果35.0<Ct<38.0,重复检测，如果结果一致，判断为H5 亚型禽流感病毒阳性，如无扩增信号，则判断为H5亚型禽流感病毒阴性。
[0076] HEX通道：1)阳性:待测样本检测结果Ct< 35.0,扩增曲线呈S型且有明显指数增长 期，判断为N6亚型禽流感病毒阳性;2)阴性:待测样本检测结果Ct>38.0,判断为N6亚型禽 流感病毒阴性;3)可疑:待测样本结果35.0<Ct<38.0,重复检测，如果结果一致，判断为N6 亚型禽流感病毒阳性，如无扩增信号，则判断为N6亚型禽流感病毒阴性。
[0077]扩增结果参见附图1，图1中H5-基因阳性标准品：为H5基因阳性标准品扩增曲线； N6-基因阳性标准品：为N6基因阳性标准品扩增曲线;H5-病例和N6病例分别为待检测样品 咽拭子H5基因和N6基因检测结果，从扩增结果显示，待检测样品为H5N6阳性病例.
[0078] 结果显示，疑似人感染H5N6亚型禽流感病例咽拭子标本H5和N6均出现阳性扩增结 果，而选取的8份流感病毒毒株和样本，其中包括A型季节性流感毒株3株，B型季节性流感病 毒2株，H5N1亚型禽流感病毒样本1份，H9N2亚型禽流感病毒样本1份，H7N9亚型禽流感病毒 样本1份均未有阳性扩增，表明本试剂盒具有良好的特异性.
[0079] 实施例4: H5N6亚型禽流感病毒H5和N6基因的双通道核酸检测试剂盒灵敏度检测 [0080]以人工合成的H5N6亚型禽流感病毒H5和N6基因特异性扩增区域片段质粒DNA为检 测模板，将2.5 X 108拷贝ΛΛ的H5片段和2.5 X 108拷贝ΛΛ的N6基因片段质粒DNA分别进行系 列10倍稀释，利用本试剂盒和上述检测方法同时进行实时荧光RT-PCR方法检测.
[0081] 两种基因检测模板梯度稀释后进行的扩增曲线如图2、图3所示，检测结果表明本 试剂盒H5引物/探针检测H5基因片段的敏感度为2.5X10 2拷贝/反应，N6引物/探针检测N6 基因片段的敏感度为2.5X101拷贝/反应，显示了良好的敏感度。
[0082] 最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明， 尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可 以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换. 凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的 保护范围之内。
【主权项】
1. 一种A型H5N6亚型禽流感病毒双通道实时荧光PCR检测试剂盒，主要由以下组分组 成： (1)RT-PCR反应液：含有50mMMgS〇4、0.4mMdNTPs; (2) 引物和探针混合液:含扩增H5基因的引物对1、N6基因的特异性引物对2及分别对应 的特异性探针； 所述引物对1为扩增H5基因的引物对，其上游引物H5-F为SeqIDNo.l所示序列，下游 引物!15-1?为569 10如.2所示序列： SeqIDNo.1：5-ATTGCTCCAGAATATGCATA-3； SeqIDNo.2:5-AGARTTTATCGCCCCTATTG-3; 所述引物对2为扩增N6基因的引物对，其上游引物N6-F为SeqIDNo.3所示序列，下游 引物N6-R为SeqIDNo.4所示序列： SeqIDNo.3：5-GGGTCGARTGCAYAGGATG-3； SeqIDNo.4:5-TACCACACYACTRCCGATG-3; 所述115基因对应的探针!15-?仰&6为369 10如.5所示的序列： SeqIDNo.5：5-CAAAATWGTCAAGAAAGGGG-3； 所述呢基因对应的探针呢11(^6为569 10如.6所示的序列： SeqIDNo.6：5-AAGCACGYCATGCCAYGATG-3； (3) 酶混合液:逆转录酶、Taq酶； (4) 含有H5N6亚型禽流感病毒特异性HA和ΝΑ基因片段DNA的阳性标准品。2. 权利要求1所述的A型H5N6亚型禽流感病毒双通道实时荧光PCR检测试剂盒，其特征 在于，所述引物对1、2中的H5和N6的上游引物浓度为20μΜ，H5和N6下游引物浓度均为40μΜ， Η5和Ν6探针浓度为20μΜ。3. 权利要求1所述的Α型Η5Ν6亚型禽流感病毒双通道实时荧光PCR检测试剂盒，其特征 在于，所述H5、N6对应的探针5'端含有焚光报告基因，3'端含有焚光猝灭基因，所述焚光报 告基团包括:MAR、JUP、URA、NEP、PLU、FAM、HEX、J0E、NED、TET、R0X或CY5;所述荧光猝灭基团 包括:TAMRA、BHQ1、BHQ2。4. 权利要求1所述的A型H5N6亚型禽流感病毒双通道实时荧光PCR检测试剂盒，其特征 在于，所述含有A型H5N6亚型禽流感病毒特异性HA和NA基因片段DNA的阳性标准品，HA片段 的DNA浓度为3 · 6ng/ul，NA片段的DNA浓度为3 · 3ng/ul。5. 权利要求1所述的A型H5N6亚型禽流感病毒双通道实时荧光PCR检测试剂盒，其特征 在于，所述含有H5N6亚型禽流感病毒特异性HA和NA基因片段DNA的阳性标准品，所述的DNA 片段可以为质粒、PCR扩增产物或人工合成基因。6. 权利要求1所述A型H5N6亚型禽流感病毒双通道实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在 于，试剂盒中反应体系组成为:扩增反应液每管20.OyL，包括RT-PCR反应液16.OyL、H5/N6反 应混合液3.OyL、酶混合液1.OyL。7. -种利用权利要求1所述的A型H5N6亚型禽流感病毒双通道核酸检测试剂盒进行检 测的方法，包括以下步骤： (1) 病毒RNA的提取:取待测样本，提取RNA; (2)A型H5N6亚型禽流感病毒的实时荧光RT-PCR扩增，利用SeqID如.1-6所述针对耶 基因和N6基因的扩增引物对和探针，在荧光定量PCR仪中对H5N6亚型禽流感病毒的HA和ΝΑ基因进行扩增： A. 在标明编号的PCR反应管中加入扩增反应液16.OyL、引物混合液3.OyL、待检模板5yL 和酶混合液l.OyL; B.将上述PCR反应管混匀离心后置于荧光定量PCR仪内进行以下反应:①50°C保温30分 钟，②95°C保温10分钟，③95°C变性15秒，④55°C退火45秒，其中③④循环40次； (3)结果判读:在仪器正常，阳性标准品和阴性标准品均正常的情况下进行结果分析： 阳性:待测样本检测结果Ct< 35.0,扩增曲线呈S型且有明显指数增长期，判断为H5N6 亚型禽流感病毒阳性； 阴性:待测样本检测结果Ct>38.0,判断为H5N6亚型禽流感病毒阴性； 可疑:待测样本结果35.0<Ct<38.0，重复检测，如果结果一致，判断为H5N6亚型禽流 感病毒阳性，如无扩增信号，则判断为H5N6亚型禽流感病毒阴性。
【专利摘要】本发明公开了一种利用双重荧光PCR检测A型H5N6亚型禽流感病毒的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括：扩增H5和N6基因的PCR引物及探针，其核苷酸序列如Seq？ID？No：1-6所示，探针5’端标记有荧光报告基团，3端标记有荧光猝灭基团；RT-PCR反应液、酶混合液、阳性标准品、阴性标准品。本发明还公开了利用该试剂盒进行检测的方法，包括：提取样品核酸、配置反应体系、通过荧光定量PCR进行扩增、结果判读等步骤.结果显示，本发明提供的检测试剂盒能够快速检测A型H5N6型禽流感病毒，具有操作简单、灵敏度高，特异性好等优点，能为A型H5N6亚型禽流感病毒的监测和临床诊断提供一种高效的检测手段。
【IPC分类】C12Q1/70, C12Q1/68
【公开号】CN105441586
【申请号】CN201510859561
【发明人】张如胜, 陈发明, 孙边成, 欧新华
【申请人】长沙市疾病预防控制中心
【公开日】2016年3月30日
【申请日】2015年11月28日