一种利用根瘤菌促进非豆科作物生长的方法与流程

本发明涉及农作物种植技术领域，具体涉及一种利用根瘤菌促进非豆科作物生长的方法。

背景技术：

根瘤菌剂是指以根瘤菌为生产菌种制成的微生物制剂产品，它能够固定空气中的氮元素，为宿主植物提供大量氮肥，从而达到增产的目的。根瘤菌产生的氨态氮没有环境污染，吸收率相当高，使用过程中没有氮流失，而人工施用化学氮肥流失率往往大于50％，且氮肥为产酸肥料，施用后会造成土壤酸化问题。因此使用了根瘤菌后可以不施或大量减少化学氮肥的用量，在显著提高亩产量的同时还能减少因使用化肥对土壤结构造成的破坏和对水源的污染，节省能源、改良土壤、实现可持续发展的目标。中国人民很早把瓜类和豆类轮作种植以提高产量，其内在的机理就是利用微生物的固氮作用来提高土壤肥效。而在欧美国家是在18世纪30年代之后采取轮作种植技术。近年来，人们把固氮的微生物进行人工培养获得大量的活菌体，然后用它们拌种或施播，发展成为细菌肥料。细菌肥料不仅能提高农作物产量，而且因为活的菌体能在土壤中继续生长繁殖，一年施加多年有效。目前，在农业生产上应用的固氮微生物肥料主要有共生根瘤菌肥、自生固氮菌肥和固氮蓝藻肥三类。而根瘤菌剂是种植豆科作物的主要菌性肥料，应用于非豆科作物的菌肥还非常少。

伴随着根瘤菌在表面消毒的非豆科植物组织中被分离和鉴定出来，以及随后的大田和实验室实验反复证明，根瘤菌定殖并促生植物的现象十分广泛，在美国、埃及、法国、意大利、肯尼亚、印度等的研究揭示了根瘤菌侵入非豆科植物根部，靠根系分泌物生存繁殖，部分可在皮层和维管束细胞及细胞间隙定殖。这种自由的弱共生，在根际不形成根瘤，也不参与固氮，主要表现出促生现象。根瘤菌还可以定殖在非豆科植物种子中，进行垂直传播。因此根瘤菌不仅可以与宿主豆科植物相互作用形成共生关系，将空气中的氮气转化为氨，为豆科植物提供氮源；根瘤菌还可以以内生菌的形式定殖在非豆科植物体内，作为植物与微生物互作过程中高度进化并对植物有益的内生菌范畴。目前已有关于根瘤菌以内生菌的形式与非豆科植物互作及促生机理的研究；但是还没有关于如何使根瘤菌促进非豆科作物生长的相关报道。

技术实现要素：

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种利用根瘤菌促进非豆科作物生长的方法，将根瘤菌培养收集后，接种于非豆科作物根部，以显著促进非豆科植物的生长，提高非豆科植物的产量。

为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种利用根瘤菌促进非豆科作物生长的方法，该方法是通过对根瘤菌的菌液体进行接种培养和离心处理等到的接种菌体稀释，然后将稀释的菌液接种于非豆科植物幼苗的根部。

作为具体的方案，本发明所述的利用根瘤菌促进非豆科作物生长的方法具体步骤如下：

1)接种菌培养：将根瘤菌种于TY液体培养基，置于25-30℃得培养箱培养40-55h，离心后收集菌体，用PBS对收集到的菌体进行悬浮，用分光光度计检测值OD₆₀₀＝0.8是作为接种菌备用；

2)非豆科植物幼苗培育：将非豆科植物的种子置于内含无菌滤纸和少量无菌水的灭菌培养皿中，于培养箱中催芽后已栽植含有蛭石和1/4浓度的木村营养液的培养瓶中，置于光照培养箱中培养至长出幼苗后移种至盛有已灭菌消毒的含水培养土介质的桶中；

3)根瘤菌菌液处理幼苗：将步骤1)所得到的用PBS悬浮的OD₆₀₀＝0.8的根瘤菌菌体接种于桶内的幼苗根部。

作为进一步的方案，本发明步骤2)非豆科植物幼苗培育过程中控制每天光照10-15小时；白天温度控制为28±1℃，晚上温度控制为25±1℃。

作为进一步的方案，本发明步骤3)根瘤菌菌液处理幼时，每7天接种一次。

作为进一步的方案，本发明所述的TY固体培养基由以质量浓计的以下组分组成：蛋白胨5.0g/L，酵母抽提物3.0g/L，CaCl₂·2H₂O 0.88g/L，琼脂粉15.0g/L；TY固体培养基pH值为7.4。

作为进一步的方案，本发明所述的木村营养液由大量元素和微量元素组成，其pH值为6.0；其中大量元素包括以质量浓度计的以下组分：(NH₄)₂SO₄48.20mg/L、KH₂PO₄24.80mg/L、KNO₃18.50mg/L、K₂SO₄15.90mg/L、Ca(NO₃)₂59.90mg/L、MgSO₄65.90mg/L；所述微量元素包括以质量浓度计的以下组分：ZNSO₄·7H2O0.22mg、H₃BO₃2.860mg、CuSO₄·5H₂O0.08mg、MnCl₂·4H₂O1.810mg、H₂MOO·4H₂O0.09mg、FeSO₄·7H₂O5.570mg、Na₂EDTA7.450mg。

作为进一步的方案，本发明所述的PBS的pH值为7.4，其包括以重量浓度计的以下组分：NaCl8g/L、KCl0.2g/L、KH₂PO₄0.24g/L、Na₂HPO₄1.44g/L。

作为进一步的方案，本发明所述的非豆科作物为水稻、玉米、高粱、小麦、黍米中的一种。

作为进一步的方案，本发明所述的根瘤菌选自苜蓿根瘤菌、豌豆根瘤菌、菜豆根瘤菌、大豆根瘤菌、羽扇豆根瘤菌中的一种。

作为进一步的方案，本发明所述的土介质由土和蛭石按照质量比为1：1的比例混合而成。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

1.本发明所述的利用根瘤菌促进非豆科作物生长的方法，将根瘤菌培养收集后，接种于非豆科作物根部，可以以显著促进非豆科植物的生长，提高非豆科植物的产量；

2.本发明所述的利用根瘤菌促进非豆科作物生长的方法为根瘤菌作为微生物菌肥应用于水稻大田生产提供了理论依据。

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。

附图说明

图1为水稻幼苗接种苜蓿中华根瘤菌1021六后天的生长状况；其中A表示对比例中接种苜蓿中华根瘤菌1021死菌的水稻幼苗长势,B表示实施例1接种苜蓿中华根瘤菌1021活菌的水稻幼苗的长势；

图2为接种苜蓿中华根瘤菌1021对水稻幼苗第4叶片第6、7、8天的生长状况；其中A表示对比例中接种苜蓿中华根瘤菌1021死菌的第4叶片的生长状况；B表示实施例1接种苜蓿中华根瘤菌1021活菌的第4叶片的生长状况；

图3为接种苜蓿中华根瘤菌1021对水稻幼苗第4叶片鲜重的影响；Control表示对比例的水稻幼苗第4叶片，Sm1021表示实施例1的水稻幼苗第4叶片；

图4为接种苜蓿中华根瘤菌1021对水稻幼苗第4叶鞘6、7、8天的生长状况生长状况；其中A表示对比例中接种苜蓿中华根瘤菌1021死菌的第4叶鞘的生长状况；B表示实施例1接种苜蓿中华根瘤菌1021活菌的第4叶鞘的生长状况；

图5为接种苜蓿中华根瘤菌1021对水稻幼苗第4叶鞘鲜重的影响；Control表示对比例的水稻幼苗第4叶鞘，Sm1021表示实施例1的水稻幼苗第4叶鞘；

图6为接种不同根瘤菌的水稻生长状况；Control表示对比例的水稻，Sm1021表示实施例1的水稻，E11表示实施例2接种三叶草根瘤菌E11活菌的水稻，ORS571表示实施例3的水稻；

图7为接种不同根瘤菌对水稻分蘖数量的影响，Control表示对比例的水稻，Sm1021表示实施例1的水稻，E11表示实施例2接种三叶草根瘤菌E11活菌的水稻，ORS 571表示实施例3的水稻；

图8为接种不同根瘤菌对水稻种子产量的影响，Control表示对比例的水稻，Sm1021表示实施例1的水稻，E11表示实施例2接种三叶草根瘤菌E11活菌的水稻，ORS 571表示实施例3的水稻。

具体实施方式

本发明所述的利用根瘤菌促进非豆科作物生长的方法，该方法是通过对根瘤菌的菌液体进行接种培养和离心处理等到的接种菌体稀释，然后将稀释的菌液接种于非豆科植物幼苗的根部。该方法具体步骤如下：

1)接种菌培养：将根瘤菌种于TY液体培养基，置于25-30℃得培养箱培养40-55h，离心后收集菌体，用PBS对收集到的菌体进行悬浮，用分光光度计检测值OD₆₀₀＝0.8是作为接种菌备用；

2)非豆科植物幼苗培育：将非豆科植物的种子置于内含无菌滤纸和少量无菌水的灭菌培养皿中，于培养箱中催芽后已栽植含有蛭石和1/4浓度的木村营养液的培养瓶中，置于光照培养箱中培养至长出幼苗后移种至盛有已灭菌消毒的含水培养土介质的桶中；

3)根瘤菌菌液处理幼苗：将步骤1)所得到的用PBS悬浮的OD₆₀₀＝0.8的根瘤菌菌体接种于桶内的幼苗根部。

作为进一步的方案，本发明步骤2)非豆科植物幼苗培育过程中控制每天光照10-15小时；白天温度控制为28±1℃，晚上温度控制为25±1℃。

作为进一步的方案，本发明步骤3)根瘤菌菌液处理幼时，每7天接种一次。可分别选择在移种至盛有已灭菌消毒的含水培养土介质的桶中后的第8天、第15天、第22天在桶内的幼苗根部接种，以此类推。

作为进一步的方案，本发明所述的TY固体培养基由以质量浓计的以下组分组成：蛋白胨5.0g/L，酵母抽提物3.0g/L，CaCl₂·₂H₂O 0.88g/L，琼脂粉15.0g/L；TY固体培养基pH值为7.4。

作为进一步的方案，本发明所述的木村营养液由大量元素和微量元素组成，其pH值为6.0；其中大量元素包括以质量浓度计的以下组分：(NH₄)₂SO₄48.20mg/L、KH₂PO₄24.80mg/L、KNO₃18.50mg/L、K₂SO₄15.90mg/L、Ca(NO₃)₂59.90mg/L、MgSO₄65.90mg/L；所述微量元素包括以质量浓度计的以下组分：ZNSO₄·7H2O0.22mg、H₃BO₃2.860mg、CuSO₄·5H₂O0.08mg、MnCl₂·4H₂O1.810mg、H₂MOO·4H₂O0.09mg、FeSO₄·7H₂O5.570mg、Na₂EDTA7.450mg。其中木村营养液在使用时需稀释至原来浓度的1/4，所以在步骤2)中和是采用1/4浓度的木村营养液。

作为进一步的方案，本发明所述的PBS的pH值为7.4，其包括以重量浓度计的以下组分：NaCl8g/L、KCl0.2g/L、KH₂PO₄0.24g/L、Na₂HPO₄1.44g/L。

作为进一步的方案，本发明所述的非豆科作物为水稻、玉米、高粱、小麦、黍米等中的一种。当然除了上述这些非都可作物，根瘤菌明显可以促进豆科植物例如大豆、菜豆等的生长和产量。

作为进一步的方案，本发明所述的根瘤菌选自苜蓿根瘤菌、三叶草根瘤菌、豌豆根瘤菌、菜豆根瘤菌、大豆根瘤菌、羽扇豆根瘤菌中的一种。在本发明的研究中发现苜蓿中华根瘤菌1021对非豆科作物的幼苗生长的影响具有持续累积的作用特点，在旺盛生长的第3、4叶位响应最强烈，接菌后第6天的促生效果达到显著水平，尤其在分蘖期时，苜蓿中华根瘤菌1021的促生效果明显。因此，在本发明中，优选方案中采用的是苜蓿中华根瘤菌1021，该菌种为现有菌种，可以通过购买方式获得。此外，本发明所述的根瘤菌具体还可以选用三叶草根瘤菌E11、田菁茎瘤根瘤菌ORS571中的一种。

作为进一步的方案，本发明所述的土介质由土和蛭石按照质量比为1：1的比例混合而成。

以下是本发明具体的实施例，在下述实施例中所采用的原料、种子、菌种以及试剂除另有说明外均可以通过购买方式获得。

实施例1

采用苜蓿中华根瘤菌促进非豆科作物水稻的生长

原材料：粳稻日本晴(Oryza sativa L.japonica.cv.Nipponbare)；苜蓿中华根瘤菌1021(Sinorhizobium meliloti 1021)以下简写为Sm1021；

具体方法如下：

1)接种菌培养：将Sm1021接种于TY液体培养基，置于28℃培养箱，180g，培养48h；通过4500g，离心20min收集菌体；用PBS对收集到的菌体进行悬浮，并用分光光度计检测OD₆₀₀＝0.8(约等于10⁸个菌体)作为接种菌体备用；

2)水稻幼苗的培养：水稻种子置于内含无菌滤纸和少量无菌水的灭菌培养皿中，28℃培养箱中催芽两天后移栽至到含有175cm₃蛭石和100mL 1/4木村营养液的培养瓶中，置于光照培养箱中培养；光周期为14h光照，10h黑暗；白天温度为28℃，晚上温度为25℃；在培养箱内培养过程中，根据蒸发情况补充1/4木村B营养液，保持幼苗正常生长；待水稻长至第13天时，将水稻秧苗移种至盛有已灭菌消毒的含水培养土介质(土与蛭石为1：1)的桶中；

3)根瘤菌菌液处理幼苗：将水稻秧苗移种后的8天、15天和22天，分别用120mL OD₆₀₀值为0.8的菌液，接种每桶内的水稻幼苗根部，避免污染地上部分；每种处理的水稻为5桶，作为5个重复，每桶种水稻幼苗5株；盆栽水稻在室外生长，水稻生长至第152天时收获。

实施例2

采用三叶草根瘤菌E11促进非豆科作物水稻的生长

原材料：粳稻日本晴(Oryza sativa L.japonica.cv.Nipponbare)；三叶草根瘤菌(Rhizobium leguminosarumbv.trifolii)E11，以下简写为E11；

具体方法如下：

1)接种菌培养：将E11接种于TY液体培养基，置于28℃培养箱，180g，培养48h；通过4500g，离心20min收集菌体；用PBS对收集到的菌体进行悬浮，并用分光光度计检测OD₆₀₀＝0.8(约等于10⁸个菌体)作为接种菌体备用；

2)水稻幼苗的培养：水稻种子置于内含无菌滤纸和少量无菌水的灭菌培养皿中，28℃培养箱中催芽两天后移栽至到含有175cm₃蛭石和100mL 1/4木村营养液的培养瓶中，置于光照培养箱中培养；光周期为14h光照，10h黑暗；白天温度为28℃，晚上温度为25℃；在培养箱内培养过程中，根据蒸发情况补充1/4木村B营养液，保持幼苗正常生长；待水稻长至第13天时，将水稻秧苗移种至盛有已灭菌消毒的含水培养土介质(土与蛭石为1：1)的桶中；

3)根瘤菌菌液处理幼苗：将水稻秧苗移种后的8天、15天和22天，分别用120mL OD₆₀₀值为0.8的菌液，接种每桶内的水稻幼苗根部，避免污染地上部分；每种处理的水稻为5桶，作为5个重复，每桶种水稻幼苗5株；盆栽水稻在室外生长，水稻生长至第152天时收获。

实施例3

采用田菁茎瘤根瘤菌ORS571促进非豆科作物水稻的生长

原材料：粳稻日本晴(Oryza sativa L.japonica.cv.Nipponbare)；菁茎瘤根瘤菌(Azorhizobiumcaulinodans)ORS571，以下简写为ORS571；

具体方法如下：

1)接种菌培养：将ORS571接种于TY液体培养基，置于28℃培养箱，180g，培养48h；通过4500g，离心20min收集菌体；用PBS对收集到的菌体进行悬浮，并用分光光度计检测OD₆₀₀＝0.8(约等于10⁸个菌体)作为接种菌体备用；

2)水稻幼苗的培养：水稻种子置于内含无菌滤纸和少量无菌水的灭菌培养皿中，28℃培养箱中催芽两天后移栽至到含有175cm₃蛭石和100mL 1/4木村营养液的培养瓶中，置于光照培养箱中培养；光周期为14h光照，10h黑暗；白天温度为28℃，晚上温度为25℃；在培养箱内培养过程中，根据蒸发情况补充1/4木村B营养液，保持幼苗正常生长；待水稻长至第13天时，将水稻秧苗移种至盛有已灭菌消毒的含水培养土介质(土与蛭石为1：1)的桶中；

3)根瘤菌菌液处理幼苗：将水稻秧苗移种后的8天、15天和22天，分别用120mL OD₆₀₀值为0.8的菌液，接种每桶内的水稻幼苗根部，避免污染地上部分；每种处理的水稻为5桶，作为5个重复，每桶种水稻幼苗5株；盆栽水稻在室外生长，水稻生长至第152天时收获。

对比例

按照实施例1的方法，与实施例1相比，差别仅仅在于以等量苜蓿中华根瘤菌SM1021死菌(无菌水重新悬浮的菌体于微波炉高温煮沸3次)处理的水稻为对照(control)。

效果检验

1.中苜蓿中华根瘤菌对水稻幼苗生长的分析

苜蓿中华根瘤菌1021处理水稻幼苗6天后，用蒸馏水冲洗幼苗，洗净后用吸水纸吸干表面水分，分别称量地上部分和根的鲜重和长度。每种处理水稻幼苗为3瓶，作为3个重复，每瓶6株水稻幼苗。为进一步分析苜蓿中华根瘤菌1021促进水稻幼苗生长的机制，接种根瘤菌后对水稻幼苗的叶鞘和叶片进行了分析。具体操作为：根瘤菌处理水稻幼苗3、4、5、6、7、8天后，取水稻地上部分，用蒸馏水冲洗干净，吸水纸吸干表面水分，分别测定第3叶鞘和叶片、第4叶鞘和叶片重量和长度。水稻接种根瘤菌后第68天时水稻处于分蘖期，测定分蘖数。水稻生长到152天时成熟，收获，测量水稻种子产量。利用SPSS 16.0软件和Excel软件(Microsoft Office Excel 2003,Microsoft Corporation)进行数据的统计分析。应用t检验(Student’s t test)分析数据之间的差异显著性(P＜0.01为极显著差异，0.01＜P＜0.05为显著性差异，P＞0.05差异不显著)。

与对比例1的比较结果显示：接种苜蓿中华根瘤菌1021水稻幼苗6天后，就显示了对水稻的促生作用，地上部分高度及鲜重增加十分显著(图1和表1)。通过对接种根瘤菌后的水稻幼苗外部特征进行观察，发现了水稻叶片和叶鞘的变化。第1、2和3叶片和叶鞘的长度促生现象不明显，但是第4叶片和叶鞘有明显差别。同对照相比，接种苜蓿中华根瘤菌1021的水稻幼苗接菌后第6、7、8天时，第4叶片鲜重分别提高21.0％、14.5％、11.4％(参见图2和图3)；叶鞘鲜重提高量更加显著，第6、7、8天时分别提高240.6％、92.2％、63.7％(图4和他5)。

表1：水稻幼苗接种苜蓿中华根瘤菌1021六天后的生长变化

2.不同根瘤菌对水稻生长及产量的影响

对生长至第68天(分蘖期)、152天(成熟期)时水稻的整体生长状况进行了观察和检测，结果表明接种根瘤菌的水稻比未接种的对照生长状况好(图6)。接种苜蓿中华根瘤菌1021、三叶草根瘤菌E11、田菁茎瘤根瘤菌ORS571的水稻同对照相比，有效分蘖数分别提高64.6％、31.7％和42.7％(图7)。分蘖数的增加进一步会提高水稻产量，测定水稻种子产量的结果表明，不同根瘤菌对水稻产量的影响不同(图8)，同对照相比，苜蓿中华根瘤菌1021、三叶草根瘤菌E11、田菁茎瘤根瘤菌ORS571接种的水稻的产量分别提高17.6％、14.9％、13.0％。由此可见，苜蓿中华根瘤菌1021、三叶草根瘤菌E11、田菁茎瘤根瘤菌ORS571等根瘤菌均能够促进非豆科作物水稻的生长并提高水稻的产量；其中以苜蓿中华根瘤菌1021的效果最好。

上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。