一种玉米类芽胞杆菌及其应用的制作方法

本发明涉及玉米类芽胞杆菌(Paenibacillus mealiensis)技术领域。

背景技术：

内生菌(Endophyte)概念是在1866年首先由Barry提出的，是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的组织或器官内部的微生物(主要为真菌和细菌)。内生菌的菌丝生长于植物组织的细胞间，分布于叶鞘、种子、花、茎、叶片和根。目前农用内生菌的研究主要集中在内生菌对农作物本身的影响和从植物内生菌次生代谢产物中发现具有农用生物活性的新化合物两方面，这其中也包括内生菌的抗病原真菌作用。

真菌病害严重危及全球粮食安全，植物病害中有70％-80％是病原真菌的侵染所导致，例如，水稻纹枯病是水稻生产上的主要病害之一，甚至一些真菌类病害还导致了严重的动植物死亡和灭绝。化学防治是目前防治真菌病害最有效的措施，我国每年化学农药的使用量为50万吨-60万吨，对环境和生态带来了严重的污染和危害，在一些国家和地区化学杀菌剂已经被限制使用。而生物防治因其见效快、杀菌谱广、环境友好，并且不易产生抗性等特点，具有广阔的应用前景。

用于生物防治的微生物种类主要有细菌、真菌、放线菌和病毒。然而，近年来，随着生防细菌的发掘和研究，寻找新的具有病原真菌拮抗作用的细菌难度越来越大，但是筛选新的具有病原真菌拮抗作用的细菌仍然具有重要的科学价值的实用价值。

技术实现要素：

本发明针对现有技术的不足之处，结合我国的种植资源，从在中国水稻所富阳基地玉米种植区域内的玉米根中分离得到了众多玉米内生菌的细菌菌株，并对这些细菌的16S rDNA进行测序分析，以确定这些细菌种属分类关系。并利用其对病原真菌拮抗能力等进行检测分析，旨在获得高效广谱的生防菌，以期为植物真菌病害的防治提供材料。本发明首次发现了一种可以用于农作物病害防治，特别是水稻病害防治的类芽胞杆菌属的新的物种。

具体来讲，本发明提供了一种玉米类芽胞杆菌(Paenibacillus mealiensis)。

在一个具体实施方式中，所述玉米类芽胞杆菌为保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO.13158的菌株。

一种如本发明的玉米类芽胞杆菌，特别是保藏编号为CGMCC NO.13158的菌株的应用。

在一个具体实施方式中，所述应用为所述玉米类芽胞杆菌在防治水稻纹枯病中的应用。

在一个具体实施方式中，所述玉米类芽胞杆菌用于保护植物；所述植物主要指的是农作物；所述农作物可以为水稻。

一种对本发明的玉米类芽胞杆菌CGMCC NO.13158进行遗传改良后得到的工程菌。其中，由于该工程菌以本发明的玉米类芽胞杆菌CGMCC NO.13158为靶标，采取向其中转入和/或敲除特定的基因和/或序列等获得，因此，该工程菌仍然为玉米类芽胞杆菌。另外，该工程菌可以为提高了对上述病害活性的工程菌。还可以为兼具其他病虫害活性以及获得了其他特性的工程菌株。

一种如本发明的工程菌的应用。

在一个具体实施方式中，所述工程菌在用于防治水稻纹枯病中的应用。

在一个具体实施方式中，所述工程菌用于保护植物；所述植物主要指的是农作物；所述农作物可以为水稻。

一种包含如本发明的玉米类芽胞杆菌的组合物。其中的玉米类芽胞杆菌可以包括本发明的野生菌株CGMCC NO.13158，也可以包括对本发明的野生菌株CGMCC NO.13158进行遗传改良后得到的工程菌，或者野生菌株和工程菌株都包括在内。所述组合物可以为固态形式，也可以为液态形式。所述组合物还可以包含与本发明的玉米类芽胞杆菌具有增效作用的其他物质，所述其他物质可以是微生物来源抑菌活性物质，也可以是抑菌化合物。所述组合物进一步可以包括与本发明的玉米类芽胞杆菌相配合的辅剂、增稠剂和/或分散剂。

一种如本发明的组合物的应用。

一种如本发明所述的组合物在防治水稻纹枯病中的应用。

一种如本发明所述的组合物在保护植物中的应用；所述植物主要指的是农作物；所述农作物可以为水稻。

一种包含如本发明的玉米类芽胞杆菌的农药制剂。其中的玉米类芽胞杆菌可以包括本发明的野生菌株CGMCC NO.13158，也可以包括对本发明的野生菌株CGMCC NO.13158进行遗传改良后得到的工程菌，或者野生菌株和工程菌株都包括在内。所述农药制剂可以为固态形式，也可以为液态形式。所述农药制剂还可以包含与本发明的玉米类芽胞杆菌具有增效作用的其他物质，该物质可以是微生物来源抑菌活性物质，也可以是抑菌化合物。所述农药制剂进一步可以包括与本发明的玉米类芽胞杆菌相配合的辅剂、增稠剂和/或分散剂。

一种如本发明的农药制剂的应用。

一种如本发明所述的农药制剂在防治水稻纹枯病中的应用。

一种如本发明所述的农药制剂在保护植物中的应用；所述植物主要指的是农作物；所述农作物可以为水稻。

在本发明中，术语“保护”的意思是通过预防和/或治疗靶标生物产生的病虫害等，从而使靶标生物免于或减轻遭受所述病虫害的为害。例如通过使用所述玉米类芽胞杆菌预防和/或治疗水稻纹枯病。

在本发明中，术语“16S rDNA”是指16S rRNA的基因。

由于本发明的玉米类芽胞杆菌可以作为植物的内生菌，而内生细菌在植物体内具有稳定的生存空间，不易受环境条件的影响，其可以在植物体内独立的分裂繁殖和传递，因此，本发明的玉米类芽胞杆菌在生物防治中具有非常大的应用潜力。并且在本发明的玉米类芽胞杆菌进行遗传改造，可以使其作为生防载体菌和/或其他有益功能的载体菌而加以利用。

附图说明

图1为玉米类芽胞杆菌YMN-7对峙培养法抑制水稻纹枯病病原菌的效果图。其中，A为空白对照，B为YMN-7的抑菌实验。

图2为根据16S rDNA使用软件MEGA6.0构建的系统发育树。

具体实施方式

以下通过优选的实施例的形式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不构成对本发明的限制。

本发明筛选的一株类芽胞杆菌被定名为YMN-7，该菌株保藏于保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO.13158，保藏日期为2016年10月27日，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101。其系统分类为玉米类芽胞杆菌(Paenibacillus mealiensis)。

病原菌：供试病原真菌水稻纹枯病病原菌(Rhizoctonia solani Kühn)由本实验室保藏。

LB液体培养基配方：胰蛋白胨10g，酵母抽提5g，NaCl 10g，蒸馏水1000ml，pH7.2。常规灭菌后使用。若为固体培养基，在灭菌前向其中添加琼脂15g。

PDA固体培养基配方：马铃薯200克，葡萄糖20克，琼脂15克，蒸馏水1000毫升，自然pH。常规灭菌后使用。

相对抑菌率(％)＝(对照菌落半径－处理菌落半径)/对照菌落半

实施例1

1、菌株的分离

在中国水稻所富阳基地玉米种植区域内，随机选取5个点挖取玉米根，将根系上的土壤和附带物用流水冲洗干净。选取幼根作为分离材料，用剪刀剪成3-4cm小段放置于空培养皿中，在无菌条件下，先用75％洒精浸泡2min，然后用5％NaClO溶液浸泡15min，后用无菌水漂洗根段5-6次，用经过消毒的剪刀剪成0.5cm根段放置在含PDA固体培养基的培养皿上，每培养皿中放置6个根段。将培养皿置于恒温培养箱内，28℃培养。待根段两头周围长出菌落后，挑取不同形态菌落在新鲜PDA培养基平板上进行划线纯化，挑取单菌落保存于PDA固体斜面，4℃短期保存。单菌落接种LB液体，28℃过夜培养后，与40％甘油等体积混合后置－80℃长期保存。将其中分离到的一株玉米内生细菌命名为YMN-7。

2、菌株YMN-7的抑菌谱

1)采用平板对峙法：一方面，将病源真菌水稻纹枯病病原菌(Rhizoctonia solani Kühn)分别提前在25℃下在PDA固体培养基上活化，并分别用6mm打孔器沿着菌丝边缘打菌饼备用。另一方面，将供试菌株YMN-7于PDA平板上活化后，挑取单克隆接种3ml LB液体培养基，28℃200rpm震荡培养10-12小时，后取3μl培养液滴加于PDA培养基中心点两侧(距中心2.5cm)28℃培养24小时后，取上述制备的其中一个菌饼，菌丝面朝下，接种到已经接种供试菌YMN-7的PDA培养基中央。病原菌接种三个平板作为重复。同时以不接供试菌而只接种病原真菌(为水稻纹枯病病原菌(Rhizoctonia solani Kühn))的平板为对照。28℃进行对峙培养，在第3天和第5天后观察并记录，抑菌情况见图1。

YMN-7对水稻纹枯病病源真菌(Rhizoctonia solani Kühn)表现出明显抑制作用。在测定病原菌的菌落半径并根据相对抑菌率公式计算相对抑菌率之后，得到YMN-7对水稻纹枯病病源真菌(Rhizoctonia solani Kühn)的相对抑菌率为65％。

3、菌株YMN-7的16S rDNA测序及序列分析将供试菌株YMN-7在PDA平板活化后，挑取单菌落接种于LB液体培养基，28℃200rpm震荡培养12小时左右，收集菌体，使用DNAiso Reagent(Takara)进行基因组提取。用细菌16S rDNA通用引物：27F：5’－agagtttgatcctggctcag-3’(如SEQ ID No.1所示)和1492R：5’-cggttaccttgttacgactt-3’(如SEQ ID No.2所示)扩增YMN-7的16S rDNA序列。50μl的反应体系包括：10×PCR缓冲液5μl，dNTP(2.5mM)4μl，27F(20μm)1μl，1492R(20μm)1μl，TaqDNA聚合酶(5IU)0.25μl，DNA模板(50ng/μl)1μl，ddH₂O补充至50μl。PCR扩增条件：94度3min预变性，94度45sec，58度45sec，72度90sec，共30个循环，72度10min终延伸。得到的约1.5kp片段，经过切胶纯化后直接进行测序(由杭州擎科梓熙生物技术有限公司完成测定工作)，所得序列为1449bp(如SEQ ID No.3所示)。将SEQ ID No.3放在EzTaxon网站(http://www.ezbiocloud.net/eztaxon/identify)进行16S rDNA的比对，发现与SEQ ID No.3最为接近的16S rDNA为杰米拉类芽胞杆菌(Paenibacillus jamilae)的16S rDNA，两者的相似度为98.61％；另外，SEQ ID No.3与与胶冻样类芽胞杆菌(Paenibacillus kribbensis)的16S rDNA的相似度为97.93％。本领域的人员公认，在该网站中16S rDNA的比对结果可以作为物种分类的标准，特别是当最接近的两种16S rDNA序列的相似度低于99％的情况下，则认为该最接近的两种16S rDNA所属的物种不属于相同的物种。采用MEGA6.0构建系统发育树(见图2)。

综合16S rDNA的相似度分析以及图2的系统发育树结果，进一步确定本发明的YMN-7虽然与胶冻样类芽胞杆菌(Paenibacillus kribbensis)AM49^T的分类地位最为接近，但两者的16s rRNA相似度仅为97.93％；而其与分类地位较远的杰米拉类芽胞杆菌(Paenibacillus jamilae)CECT 5266^T的16s rRNA相似度可达到98.61％。由此可以确定本发明的YMN-7的系统分类为类芽胞杆菌中的新的物种，该新的物种定名为玉米类芽胞杆菌(Paenibacillus mealiensis)并将该菌株保藏于保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO.13158，保藏日期为2016年10月27日，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101。

YH1662428CN 核 苷 酸 序 列 表

<110> 中国水稻研究所

<120> 一种玉米类芽胞杆菌及其应用

<130> YH1662428CN

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>27F

<400> 1

agagtttgatcctggctcag；

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>1492R

<400> 2

cggttaccttgttacgactt；

<210>3

<211> 1449

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>玉米类芽胞杆菌（Paenibacillus mealiensis）的16S rDNA

<400>3

GGCTGCGCGTGCTATACTGCAGTCGAGCGGGGTTAGTTAGAAGCTTGCTTCTAACTAACCTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTAGGCAACCTGCCCACAAGACAGGGATAACTACCGGAAACGGTAGCTAATACCCGATACATCCTTTTCCTGCATGGGAGAAGGAGGAAAGGCGGAGCAATCTGTCACTTGTGGATGGGCCTGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGCCAGGGAAGAACGCTTGATAGAGTAACTGCTCTTGAAGTGACGGTACCTGAGAAGAAAGCCCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGCTCTTTAAGTCTGGTGTTTAATCCCGAGGCTCAACTTCGGGTCGCACTGGAAACTGGGGAGCTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGGCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATGCTAGGTGTTAGGGGTTTCGATACCCTTGGTGCCGAAGTTAACACATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCAGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCCTCTGACCGGTCTAGAGATAGATCTTTCCTTCGGGACAGAGGAGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATGCTTAGTTGCCAGCAGGTCAAGCTGGGCACTCTAAGCAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTACTACAATGGCCGGTACAACGGGAAGCGAAGGAGCGATGTGGAGCCAATCCTAGAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATTGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTACAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCGCAAGAGCCAGCCGCCGAAGTTGGTAA。