值至6,用去离子水定容至1L ;121摄氏度下 灭菌15分钟。
[0076] (3)将德氏乳杆菌保加利亚亚种20089以3%的接种量接种于种子液培养基中，42 摄氏度活化培养24h，连续活化3代。
[0077] (4)将活化培养得到的种子液以2%的接种量接种于乳酸菌培养基中，40摄氏度 培养7h。
[0078] (5)将发酵培养得到的产物在11000r/min的转速下离心10min，取上清液，然后采 用孔径为0. 45 ym的滤膜进行过滤，以便得到待测样品。
[0079] (6)通过高效液相色谱法检测待测样品中叶酸含量，色谱条件为：Agilent XDB-C18柱（4. 6X250mm，5 ym);柱温：25摄氏度；流速：lmL/min ;紫外检测波长为254nm ; 流动相中甲醇：水的体积比为10 :90，用Na2HPOJP NaH 2P04调节pH值至7. 6 ;流动相经 0. 45 y m有机膜过滤后超声波脱气15min ;保留时间：20min ;进样量：20 y L。
[0080] 对比例1
[0081] 按照实施例1的方法制备叶酸，区别在于，在步骤（2)中，乳酸菌培养基中不含对 氨基苯甲酸。
[0082] 对比例2
[0083] 按照实施例1的方法制备叶酸，区别在于，在步骤（2)中，乳酸菌培养基中不含谷 氨酸。
[0084] 对比例3
[0085] 按照实施例1的方法制备叶酸，区别在于，在步骤（2)中，乳酸菌培养基中不含对 氨基苯甲酸和谷氨酸。
[0086] 实施例5
[0087] 按照实施例1~4以及对比例1~3的方法制备得到的叶酸的含量如表1所示。结 果表明，对比于乳酸菌在不含对氨基苯甲酸和谷氨酸的乳酸菌培养基中发酵得到的叶酸， 乳酸菌在含有对氨基苯甲酸和谷氨酸的乳酸菌培养基中能够得到较多的叶酸，充分说明对 氨基苯甲酸和谷氨酸对乳酸菌发酵产叶酸具有较大的促进作用。
[0088] 表1叶酸含量的测定
[0089]
[0090] 在本说明书的描述中，参考术语" 一个实施例"、"另一个实施例"、"一些实施例"、 "示例"、"具体示例"、或"一些示例"等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结 构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的 示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特 点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
[0091] 尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不 脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本 发明的范围由权利要求及其等同物限定。
【主权项】
1. 一种乳酸菌培养基，其特征在于，基于1升所述乳酸菌培养基，所述乳酸菌培养基包 括： IOg的蛋白胨； IOg的牛肉浸膏； 5g的酵母膏； 20g的葡萄糖； 2g 的 K2HPO4; 5g 的 CH3COONa ; Ig 的 Tween-80 ; 2g的柠檬酸二胺； 〇? 5g 的 MgSO4 ? 7H20 ; 0? 3g 的 MnSO4 ? 4H20 ; 400g的对氨基苯甲酸；以及 4g的谷氨酸， 所述乳酸菌培养基的pH值为7， 所述乳酸菌为保加利亚乳杆菌。2. -种制备叶酸及确定叶酸含量的方法，其特征在于，包括： (1) 制备种子培养基：称取蛋白胨l〇g、牛肉浸膏l〇g、酵母膏5g、葡萄糖20g、K2HP042g、 CH 3COONa 5g、Tween-801g、柠檬酸二胺 2g、MgSO4 .7H20 0.5g、MnSO4.4H20 0.3g，调节 pH 值 至7,用去离子水定容至IL ; 121摄氏度下灭菌15分钟； (2) 制备乳酸菌培养基：称取蛋白胨10g、牛肉浸膏10g、酵母膏5g、葡萄糖20g、 K2HP042g、CH 3COONa 5g、Tween-801g、柠檬酸二胺 2g、MgSO4 ? 7H20 0? 5g、MnSO4 ? 4H20 0? 3g、 对氨基苯甲酸400g、谷氨酸4g，调节pH值至7,用去离子水定容至IL ; 121摄氏度下灭菌15 分钟； (3) 将乳酸菌能以3 %的接种量接种于所述种子培养基中，42摄氏度活化培养24h，连 续活化3代，以便得到种子液； (4) 将所述种子液以3 %的接种量接种于所述乳酸菌培养基中，42摄氏度培养6h，以便 得到含有叶酸的发酵液； (5) 将所述含有叶酸的发酵液在10000r/min的转速下离心10min，取上清液，然后采用 孔径为0. 45 y m的滤膜进行过滤，以便得到待测样品； (6) 通过高效液相色谱法检测所述待测样品中叶酸含量，色谱条件为：色谱柱： Agilent XDB-C18柱；紫外可见吸收检测器：可见光检测器，其中紫外检测波长为254nm ;流 动相：甲醇；柱温：25摄氏度；流速：lmL/min ;进样量：20微升；保留时间：20分钟，其中，所 述甲醇预先与水按照10:90的体积比进行混合，并用Na2HPOdP NaH2PO4调节pH值至7. 6， 经过滤膜过滤，并进行超声脱气15分钟。3. -种乳酸菌培养基，其特征在于，基于1升的所述乳酸菌培养基，所述乳酸菌培养基 包括： 5~15g的蛋白胨； 5~15g的牛肉浸膏； 2~IOg的酵母膏； 10~30g的葡萄糖； 1 ~5g 的 K2HPO4; 2 ~IOg 的 CH3COONa ; 0? 5 ~2g 的 Tween-80 ; 1~5g的柠檬酸二胺； 0? 2 ~Ig 的 MgSO4 ? 7H20 ; 0? 1 ~0? 5g 的 MnSO4 ? 4H20 ; 100~1000 g的对氨基苯甲酸； 1~5g谷氨酸；以及 余量的去离子水， 任选地，所述乳酸菌培养基的pH值为5. 5~7. 5， 任选地，所述培养基作为用于制备叶酸的发酵培养基， 优选地，所述乳酸菌为保加利亚乳杆菌。4. 一种制备叶酸的方法，其特征在于，包括： 利用权利要求3所述的乳酸菌培养基，对乳酸菌进行发酵培养，以便获得含有叶酸的 发酵液。5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在进行所述发酵培养之前，预先利用种子 培养基对所述乳酸菌进行活化培养，以便得到种子液， 基于1升的所述种子培养基，所述种子培养基包括： 5~15g的蛋白胨； 5~15g的牛肉浸膏； 2~IOg的酵母膏； 10~30g的葡萄糖； 1 ~5g 的 K2HPO4; 2 ~IOg 的 CH3COONa ; 0? 5 ~2g 的 Tween-80 ; 1~5g的柠檬酸二胺； 0? 2 ~Ig 的 MgSO4 ? 7H20 ; 0? 1 ~0? 5g 的 MnSO4 ? 4H20 ;以及 余量的去离子水。6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于， 所述乳酸菌按照1~5%的接种量接入所述种子培养基中， 所述种子液按照1~5%的接种量接入所述乳酸菌培养基中。7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于， 所述活化培养是在42摄氏度的温度下进行24小时，所述活化培养次数为3次； 所述发酵培养是在30~45摄氏度的温度以及5. 5~7. 5的pH值下培养5. 5~7. 5 小时。8. -种确定发酵液中叶酸含量的方法，所述发酵液是根据权利要求4~7任一项所述 的方法获得的，其特征在于，所述确定发酵液中叶酸含量的方法包括： (1) 将所述发酵液在8000~12000r/min的转速下离心10分钟，取上清液，然后采用滤 膜进行过滤，以便得到待测样品； (2) 通过液相色谱法对所述待测样品进行检测，所述液相色谱法检测是按照下列条件 进行的： 色谱柱：Agilent XDB-C18 柱； 紫外可见吸收检测器：可见光检测器，其中紫外检测波长为254nm ; 流动相：甲醇； 柱温：25摄氏度； 流速：lmL/min ; 进样量：20微升； 保留时间：20分钟， 其中，所述甲醇预先与水按照10:90的体积比进行混合，并用Na2HPOjP NaH2PO4调节 pH值至7. 6,经过滤膜过滤，并进行超声脱气15分钟。
【专利摘要】本发明提出了乳酸菌培养基、制备叶酸的方法以及确定发酵液中叶酸含量的方法。根据本发明的实施例，基于1升所述乳酸菌培养基，所述乳酸菌培养基包括：10g的蛋白胨；10g的牛肉浸膏；5g的酵母膏；20g的葡萄糖；2g的K2HPO4；5g的CH3COONa；1g的Tween-80；2g的柠檬酸二胺；0.5g的MgSO4·7H2O；0.3g的MnSO4·4H2O；400g的对氨基苯甲酸；以及4g的谷氨酸。本发明的乳酸菌培养基具有下列优点的至少之一：含量高、安全性高、吸收效果好以及无毒副作用。
【IPC分类】C12R1/225, G01N30/02, C12P17/18
【公开号】CN105063123
【申请号】CN201510634606
【发明人】杨岚, 陈云, 史玉东, 李周勇, 赵晓慧
【申请人】内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2015年9月29日