降钙素原单克隆抗体对及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物领域，特别是涉及降钙素原(PCT)单克隆抗体对、其制备方法及其 在降钙素原检测中的应用。
【背景技术】
[0002] 降钙素原(PCT)是由116个氨基酸组成的激素原，是一种分子量约为13KD的糖蛋 白，在正常生理情况下，由甲状腺C细胞分泌产生，在体内半衰期为25~30个小时。PCT由神 经内分泌细胞(包括甲状腺、肺和胰腺组织的C细胞)表达，经酶切分解为(未成熟）降钙素、 羧基端肽和氨基端肽。健康人血液中的PCT浓度非常低，小于0.05ng/ml。在炎症刺激特别是 细菌感染/脓毒血症状态下，机体各个组织、多种细胞类型均可产生PCT，并释放进入血液循 环系统。因此通过测量人体血清中PCT的含量，可以鉴别细菌感染程度。
[0003] 动物模型试验显示机体发生脓毒血症时，多组织均能表达PCT。脓毒血症患者体内 的PCT只含有114个氨基酸，缺少氨基末端的Ala-Pro 1CT水平升高见于细菌性脓毒血症，尤 其是重症脓毒血症和感染性休克。PCT可作为脓毒血症的预后指标，也是急性重症胰腺炎及 其主要并发症的可靠指标。2012年9月发表的《降钙素原PCT急诊临床应用的专家共识》指 出：脓毒症患者的PCT水平明显高于非脓毒症患者。且PCT升高对细菌感染导致的脓毒症特 异性很高，可作为诊断脓毒症和鉴别严重细菌感染的生物标志物。同时，与单纯的临床检测 标准相比，PCT检测可显著提高SIRS/脓毒症诊断的敏感性(97% )和特异性(78% )。把PCT加 入诊断标准后，诊断准确率从0.77提高到0.94。
[0004] 对于社区获得性呼吸道感染和空调诱导性肺炎患者，PCT可作为抗生素选择以及 疗效判断的指标，因此发明降钙素原(PCT)体外诊断试剂配对抗体原料对于临床诊断具有 重大的社会价值和经济价值。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题之一是提供一对降钙素原单克隆抗体对，它可以提高降 钙素原体外检测的准确性。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明的降钙素原单克隆抗体对，包括检测抗体和捕获抗 体;所述检测抗体的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示； 所述捕获抗体的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.9 所示，轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO. 10所示，氨基酸序列如SEQ ID NO. 11所示。
[0007] 本发明要解决的技术问题之二是提供上述降钙素原单克隆抗体对的制备方法。
[0008] 为解决上述技术问题，本发明的降钙素原单克隆抗体对制备方法，步骤包括：
[0009] 1)制备降钙素原重组抗原；
[0010] 2)制备小鼠降钙素原单克隆抗体；
[0011] 3)高通量筛选降钙素原单克隆检测抗体和捕获抗体对。
[0012] 较佳的，步骤1)，采用293F真核表达系统获得降钙素原重组抗原。
[0013] 较佳的，步骤3)，采用酶联免疫化学发光检测方法筛选降钙素原单克隆抗体对。
[0014] 本发明要解决的技术问题之三是提供上述单克隆抗体对在降钙素原检测中的应 用。
[0015] 较佳的，可以采用酶联免疫化学发光检测方法进行降钙素原的检测。
[0016] 本发明通过建立酶联免疫化学发光检测(ELISA)平台，筛选降钙素原最佳配对抗 体，这种筛选方法不仅减少了后期纯化工作，而且提高了 PCT体外诊断试剂的产品质量，用 筛选得到的降钙素原最佳配对抗体对可以有效地体外检测人体血清或血浆中的PCT含量， 提高细菌感染诊断的准确性。
【附图说明】
[0017] 图1是蛋白纯化结果图。
[0018] 图2是3只小鼠免疫血清检测结果图。
[0019] 图3是阳性血清检测二次亚克隆结果。其中，第一次稀释倍数5倍，第二次稀释倍数 10000倍，暴露时间3分钟。孔板A-E排5个阳性PCT血清的浓度分别为:A:18.41ng/ml，B: 6 · 99ng/ml，C: 19 · 66ng/ml，D:0 · 829ng/ml，E: 1 · 5ng/ml。孔板F排为浓度0 ·82mg/ml的重组 PCT蛋白，G排为浓度100ng/ml的重组PCT蛋白，孔板Η排为PBS(磷酸盐缓冲液）。
[0020] 图4是l-d(l作为捕获抗体，d作为检测抗体)配对检测结果。最低检测限0.1ng/ml。 [0021 ]图5是使用最佳配对抗体对的酶联免疫ELISA检测方法的标准曲线。
【具体实施方式】
[0022]为对本发明的技术内容、特点与功效有更具体的了解，现结合附图及具体实施例， 对本发明详述如下：
[0023] 实施例1
[0024] 一、PCT抗原设计和表达
[0025] 1.PCT抗原氨基酸序列（SEQ ID N0.1):
[0026] APFRSALESSPADPATLSEDEARLLLAALVQNYVQMKASELEQEQEREGSSLDSPRSKRCGNLSTCMLGTYTQDFNK FHTFPQTAIGVGAPGKKRDMSSDLERDHRPHVSMPQNAN
[0027] 碱基序列（SEQ ID NO.2):
[0028] GCTCCTTTCCGCAGCGCTCTCGAATCTAGCCCCGCCGACCCAGCTACACTGTCCGAGGACGAGGCTAGACTGCTGCT GGCCGCCCTGGTGCAGAACTATGTACAGATGAAGGCTTCTGAGCTGGAGCAGGAACAAGAGCGGGAGGGGTCGAGCC TCGACTCTCCTAGATCGAAGCGGTGCGGAAACCTGTCTACCTGTATGCTCGGAACATACACCCAGGACTTCAACAAG TTCCACACATTCCCTCAGACAGCTATTGGCGTGGGCGCTCCCGGCAAGAAGCGCGACATGTCTTCTGACTTAGAAAG AGACCACCGGCCTCACGTTTCCATGCCACAGAACGCCAAC
[0029] 2.表达系统
[0030] 采用293F真核系统表达。
[0031] HEK 293细胞表达的重组蛋白具有准确的转录后修饰功能，表达的糖基化药物蛋 白在分子结构、理化特性和生物学功能方面接近于天然蛋白分子。293F现已可采用无血清 悬浮培养，无血清悬浮培养是用已知人源或动物来源的蛋白或激素代替动物血清的一种细 胞培养方式，它能减少后期纯化工作，提高产品质量。
[0032] 3.质粒构建
[0033] 合成基因序列:包括5 '端EcoRI，3 '端Xhol酶切位点，N端添加 Kozak(GCCGCCACC)以 及CD33信号肽序列（ATGCCGCTGCTGCTACTGCTGCCCCTGCTGTGGGCAGGGGCGCTAGCT)，C端添加 His Tag序列（CATCATCACCATCACCAT)以及终止密码（TGATAG)。并将此序列构建至pcDNA4.0To myc HisA载体。合成的基因序列如下（SEQ ID N0.3):
[0034] gaattcGCCGCCACCATGCCGCTGCTGCTACTGCTGCCCCTGCTGTGGGCAGGGGCGCTAGCTGCTCCTTTCCGCAG CGCTCTCGAATCTAGCCCCGCCGACCCAGCTACACTGTCCGAGGACGAGGCTAGACTGCTGCTGGCCGCCCTGGTGC AGAACTATGTACAGATGAAGGCTTCTGAGCTGGAGCAGGAACAAGAGCGGGAGGGGTCGAGCCTCGACTCTCCTAGA TCGAAGCGGTGCGGAAACCTGTCTACCTGTATGCTCGGAACATACACCCAGGACTTCAACAAGTTCCACACATTCCC TCAGACAGCTATTGGCGTGGGCGCTCCCGGCAAGAAGCGCGACATGTCTTCTGACTTAGAAAGAGACCACCGGCCTC ACGTTTCCATGCCACAGAACGCCAACCATCATCACCATCACCATTGATAGctcgag
[0035] 4.质粒提取、蛋白表达、蛋白纯化与检测
[0036]用真核表达载体大量提取无内毒素质粒(Max Extract)。将所提取的无内毒素质 粒进行细胞转染。收集细胞上清及细胞裂解液，采用Ni柱亲和层析，收集样品进行SDS-PAGE Westernblot检验，浓度检测，将合格样品（纯度>90%)透析至PBS(磷酸盐缓冲液），并将蛋 白浓缩至>1 .〇mg/ml，蛋白纯化结果如图1所示。
[0037]二、免疫与采血
[0038] 1)选取3只BALB/c小鼠（雌性，6周龄以上)进行免疫。
[0039] 2)第0周：免疫前，小鼠眼眶静脉采血50μ1/只，37°C放置lh后，以5000rpm离心 5min，制备阴性血清，-20°C保存。进行小鼠第一次免疫，抗原剂量为100yg/只，弗氏完全佐 剂(Sigma-F5881)，分多点皮下注射。
[0040] 3)第2周：小鼠第二次免疫，抗原剂量为50yg/只，不完全佐剂(Sigma-F5506)，注射 方式与剂量同初次免疫。
[0041 ] 4)第4周:小鼠第三次免疫，免疫剂量和免疫方法同第二次免疫。
[0042] 5)第5周：小鼠眼眶静脉采血50μ1/只，37°C放置lh后，以5000rpm离心5min，制备血 清，进行ELI SA检测，检测结果如图2所示。剩余血清-20