°C保存。取血清转阳后滴度不再变化 的小鼠（第2只小鼠，1/4000稀释时，ELISA值大于1)停止免疫，隔日加强免疫，抗原剂量50μ g/只，3日后进行细胞融合。
[0043]三、杂交瘤融合筛选
[0044] 1.融合前饲养层细胞制备(包括巨噬细胞和胸腺细胞，制备在无菌环境中进行）
[0045] 1)采用脱颈法处死5周龄小鼠，浸入75%乙醇中。撕开小鼠腹部皮肤，用5ml注射器 吸取20%頂DMHT 5ml，灌洗小鼠腹腔(针头平刺，不可伤及内脏）。提住两腿上下摇晃小鼠， 将含有巨噬细胞的培养液抽回，置于50ml离心管中，尽量将腹腔中的液体全部吸出。
[0046] 2)处死两周龄小鼠，75%乙醇浸润。沿胸骨两侧呈倒三角形打开小鼠胸腔，取出胸 腺，放入BD公司的一次性筛网中，用2ml注射器的内管研磨研磨，将细胞匀浆吸入20 % 頂DMHT中。
[0047] 3)将含有腹腔巨噬细胞和胸腺细胞的混合培养液加入加样槽内，加入适量碳酸缓 冲液，混匀，以1.0 X 1〇4/孔的密度铺96孔板，100ul/孔，8块。铺好细胞的96孔细胞培养板放 入37°C、5%C0 2的培养箱内，观擦，如无污染，则放置培养箱内备用。
[0048] 2.融合前骨髓瘤细胞制备
[0049] 1)融合前5-7天，解冻骨髓瘤细胞，进行细胞维护扩大培养，调整细胞状态，使其达 到对数生长期，细胞活率在95 %以上。
[0050] 2)将对数生长期的骨髓瘤细胞从培养箱中取出，倒掉细胞培养液，加入3-5ml 頂DM培养液到培养皿中，轻摇培养皿，倒掉培养液。加入3ml新鲜頂DM培养液，用移液器将细 胞从培养皿上吹下，收集细胞悬液于50ml离心管，lOOOrpm离心5min，弃去培养液，再加入 20ml新鲜IMDM培养液重悬细胞，lOOOrpm离心5min，弃上清。
[0051 ] 3)用新鲜的頂DM培养液10ml重悬细胞，放置在超净台内备用。
[0052] 3.提取免疫成功的脾脏细胞
[0053] 1)融合前，将小鼠摘眼球取血，37°Clh后，以lOOOrpm 5min离心制备血清作为阳性 对照，-20 °C保存，处死的小鼠浸入75 %乙醇中5-1 Omin。
[0054] 2)将小鼠置入一个无菌培养皿中，腹部向上，无菌操作剪开并撕开皮肤，使后腹肌 肉层充分与皮肤剥离。换用新剪刀剪开腹腔膜，取出脾脏。
[0055] 3)在培养皿中用10ml已预热的頂DM培养液清洗脾脏2次，剔除脾脏表面黏连的脂 肪和结缔组织，然后转入另一含l〇ml HffiM培养液的无菌培养皿中。
[0056] 4)用lml注射器吸取培养液后选取不同的点注射到脾脏内部，使脾脏鼓起，利于细 胞释放。用lml注射器柄在培养皿中挤压脾，使细胞尽可能的分离出来。
[0057] 5)将挤压混合脾细胞的培养液用一次性无菌巴氏吸管吸取后，通过细胞筛网至 50ml离心管中，用新鲜的頂DM培养液冲洗筛网后，lOOOrpm离心10min，弃上清。加入新鲜的 頂DM培养液重悬脾细胞，lOOOrpm离心10min，弃上清。将脾细胞轻轻敲散，加入MDM培养液 重悬脾细胞，再将骨髓瘤细胞悬液加入至脾细胞悬液中，定容至30ml，混匀，lOOOrpm离心 10min，弃上清，用移液器将残留的液体吸尽，待下一步融合用。
[0058] 4.细胞融合
[0059] 1)轻轻敲散细胞，用2ml移液管缓慢加入lml 37°C预热的浓度为50%的PEG1500， 轻柔吹吸细胞100 s，使PEG(聚乙二醇)与细胞充分接触。
[0060] 2)迅速加入15ml 37°C预热的MDM培养液，混匀，终止PEG的反应，将细胞重悬，离 心管置于37°C水浴10min。
[0061] 3)1000rpm 离心 10min，弃上清。
[0062] 4)取10ml MDMHAT培养液重悬细胞，将细胞液转入加样槽中，加入80ml頂DMHAT 培养液重悬细胞，将细胞悬液混合均匀，加入已铺饲养层的96孔板，铺板8块，100μ1/孔，然 后将细胞板置于37 °C、5 % C02培养箱内培养。
[0063] 5)融合2-3天后观察是否污染，若无污染，用移液器小心悬空吸取96孔板内培养液 丢弃，换取新鲜20 % IMDMHT培养液进行培养，5-6天后观察克隆长势，进行ELISA检测。
[0064] 5 .ELISA 检测
[0065] 1)将PCT抗原按适当浓度溶解于包被液中；
[0066] 2)在对应的孔中加入100μΙ抗原，4°C过夜；
[0067] 3)倒空液体并拍干残留液体，洗涤液冲洗5次；
[0068] 4)每孔加200μ 1封闭液，37 °C孵育1小时或者4 °C过夜；
[0069] 5)倒空液体并拍干残留液体，洗涤液冲洗3次；
[0070] 6)每孔加100μ 1-抗，37 °C孵育1小时；
[0071] 7)倒空液体并拍干残留液体，洗涤液冲洗7次；
[0072] 8)每孔加100μ 1二抗，37 °C孵育1小时；
[0073] 9)倒空液体并拍干残留液体，洗涤液冲洗7次；
[0074] 10)拍干孔中残留液体，每孔加 100μΙ显色液，37°C避光显色10min;
[0075] 11)每孔加50μ1 2M H2S〇4终止显色，并立即读取450nm 0D值。挑选ELISA阳性、细胞 健康的克隆转至24孔板扩大培养(ELISA阳性挑选标准:ELISA 0D值大于1.0,或大于阴性 1000倍稀释值的3倍）。
[0076] 6.亚克隆筛选
[0077] 1)挑选10-20个多克隆，细胞活率90%以上、细胞密度60%-80% ;
[0078] 2)每个克隆进行细胞计数。将细胞按照梯度稀释法稀释，克隆前准备好1块24孔培 养板，每孔加入900μ1的頂DMHT培养液，将克隆细胞在原孔中混合均匀，吸取100μΙ的细胞悬 液至准备好的24孔板相应的克隆孔中，同时在克隆原液中取微量的细胞悬液至细胞计数板 上进行细胞计数，记录好每个克隆的细胞密度；
[0079] 3)根据稀释细胞的个数(3个细胞/孔)和克隆的板数，取一定量的细胞进行稀释， 直至稀释到需要的细胞个数，加入到加样槽中，加入12ml的頂DMHT培养液，混合均匀。Α和Β 排吸取200μ1/孔，在加样槽中加入6ml MDMHT培养液，混合均匀，取200μ1/孔加入至C、D、E 排。加样槽中加入6ml HffiMHT液，混合均匀，取200μ1/孔加入至F、G、H排，并在克隆板上做好 标记(克隆号、板号、日期、操作人、克隆次数)后放入二氧化碳培养箱内培养；
[0080] 4)克隆后要适时观察克隆的长势，一般在7-14天送样检测ELISA;
[0081] 5)将挑选的克隆转入24孔板中培养，进行第二次亚克隆筛选，克隆的操作方法同 第一次亚克隆筛选，克隆后适时做ELISA、We Stern Blot检测及亚型鉴定，在第二次亚克隆 筛选过程中，筛到9个克隆。将9个克隆用5个阳性PCT血清做DB检测，结果如图3所示，并将其 9个克隆生产抗体。
[0082]四、抗体配对检测
[0083] 1)需配对抗体HRP (辣根过氧化物酶)或b iot in (生物素)标记
[0084] HRP标记采用过碘酸钠法，生物素标记选用EZ-LinkTMSulf0-NHS-LC- Biotinylation Kit进行抗体标记。利用间接ELISA检测所标记抗体。将EZ-Link? Sulfo- 順5-1^013;[01:;[117131:;[011与12株抗?(71的11^413进行偶联，得到生物素-抗体(13;[01:;[11-]^6)，于- 20°C保存。
[0085] 2)配对抗体筛选
[0086] 按照棋盘滴定法进行抗体配对，取一系列浓度值（0 · lng/ml、0.25ng/ml、0· 5ng/ ml、0 · 75ng/ml、1 · 0ng/ml、2 · 0ng/ml、2 · 5ng/ml、5 · 0ng/ml、10 · 0ng/ml、100ng/ml)重组抗原 PCT筛选最佳配对生物素标记抗体。以经验浓度(200ng/孔、400ng/孔、500ng/孔、1000ng/孔 1200ng/孔)包被12种酶标抗体4°C过夜，PBST(抗体稀释液)洗涤3遍，加入封闭液350μ1/孔， 37°C封闭2h，TOST洗涤3遍，加入定值重组抗原，温育2h后TOST洗涤3遍;再加入1:1000、1: 1200倍稀释的12种生物素抗体，37 °C温育lh，PBST洗涤5遍;加入Streptavidin-HRP (辣根过 氧化物酶标记链霉亲和素），37 °C温育30min，TOST洗涤5遍;加底物TMB( 3，3'，5,5'_四甲基 联苯胺)37 °C显色10_15min后，终止液终止，双波长读取光密度值，结果如表1-4所示，分析 最佳配对结果。
[0087] 表1 HRP酶标记PCT抗体检测结果
[0088]
[0089] 表2生物素标记PCT抗体检测结果
[0090]
[0091 ]表3生物素标记PCT抗体检测结果 [0092]
[0093] 表4棋盘滴定法筛选的最优两对配对抗体检测结果
[0094]
[0095] 3)配对抗体的优化
[0096]获取最佳配对抗体后，在包被缓冲液(碳酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、pH7.4的磷酸 缓冲液）、捕获抗体包被浓度（l〇〇〇ng/孔、1200ng/孔）、检测抗体稀释度方面（1:1000、1: 1200)作系列优化，优化结果如图4所示，最终筛选得到最佳配对抗体l-d，l作为检测抗体，d 作为捕获抗体。
[0097]五、最佳配对抗体测序 [0098] 1.检测