专利名称：增效蛋白工程菌株的构建的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种增效蛋白工程菌株及其用途和构建方法，该菌株含有昆虫病毒增效蛋白全长基因，能在原核生物中复制。本发明属于基因工程技术领域。
现在已知，昆虫病毒增效蛋白(enhancin)是由昆虫病毒基因编码能显著提高另一种病毒杀虫活性的一种功能性蛋白质。1998年，美国学者(Zhong，J.andR.R.Grandos 1998.VIIth International Colloguium on Invertebrate Pathology andMicrobial Control IVth Intematiol Conference on Bacillus thuringensis.Ausgust 23-28∶65)已将粉纹夜蛾颗粒体病毒(Trichoplusia ni granulosis virus简称TnGV)增效蛋白基因克隆于核型多角体病毒AcNPV，构建了重组病毒工程毒株，并用该毒株与野生型病毒混合使用，可显著提高Tn的杀虫效果。然而，这种工程病毒受到其宿主范围及其毒力的影响，因此在应用上有着局限。
本发明的目的是提供一种新型的含有昆虫病毒增效蛋白基因的重组质粒(工程菌株)，该质粒的构建方法、用途以及由此菌株来构建一系列高效表达载体生产昆虫病毒增效蛋白。
为实现上述目的，本发明所采取的技术方案如下一种工程菌株，含有粉纹夜蛾颗粒体增效蛋白基因并能在原核生物体内复制的重组质粒pGEM-T/En(寄存于原核生物-大肠杆菌TG1株)，该工程菌种命名为E-coli TG1(pGEM-T/En)，已于2000年5月17日保藏于湖北省武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心，登记入册号为CCTCC M20006。
该工程菌株由下列DNA元件组成(1).粉纹夜蛾颗粒体病毒增效蛋白全基因；(2).丝状噬菌体f1复制起始点；(3).大肠杆菌质粒复制起始点；(4).氨苄青霉素抗性基因。
用于构造TnGV增效蛋白重组载体的原始材料有如下几种(1)粉纹夜蛾颗粒体病毒(TnGV)，由美国汤姆·杰弗逊大学赠送；(2)受体大肠杆菌E.coli TG1菌株，购自QIA-GEN公司；(3)pGEM-T载体，购自Promega公司。
用来扩增TnGV增效蛋白基因的载体通过基因工程方法获得，其构建方法是根据已报道的粉纹夜颗粒体蛾病毒(TnGV)增效蛋白基因序列[Hashimoto，Y.et.al1991，J.Gen.Virol72(11)2645-2651]，以TnGV基因组DNA作模板，设计引物P15’TCCTCCAATGTTGCACGATT，P25’AACTGACTGTTGAACGTTAT，PCR法扩增增效蛋白基因，得到全长约2.9Kb的片段，与pGEM-T载体用T4DNA酶连接后，再转化至公众普遍易得的大肠杆菌E.coli TG1受体菌，经筛选获得含增效蛋白全长基因片段的克隆，定名为E.coli TG1(pGEM-T/En)，该工程菌株于2000年5月17日送交并保藏于中国湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心，登记号为CCTCC M20006。
图1为构建本发明的重组质粒pGEM-T/En示意图，图中KKpnl，BbamH I，SSal I，CCla I，阴影部分表示En-TnGV基因。
以下结合附图和具体的实施方案对本发明的技术方案作进一步的说明，这些实施方案无意于以任何方式限制本发明权利要求所要求的范围。(一)En-TnGV基因的PCR扩增1.TnGV-DNA的提取取TnGV悬液100μl，加等体积0.04mol/L NaOH碱解液及终浓度为1％的SDS，56℃水浴处理10分钟，待悬液半透明后，用碱性酚，酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1V∶V)混合液，氯仿∶异戊醇(24∶1V∶V)混合液抽提TnGV-DNA各一次，无水乙醇沉淀DNA，-20℃放置过夜，离心后用75％乙醇洗涤DNA沉淀，自然干燥，将DNA溶于TE(Tris·HCl 10mM，EDTA 1mM，pH8.0)缓冲液，于4℃保存。
2.En-TnGV基因的PCR扩增取TnGV-DNA10μl，作10倍稀释，取2μl，100℃煮6min立即冰浴，按B.M.公司Taq DNA Polymerase试剂(从栖热水生菌YT-1中提纯得到的耐热的DNA多聚酶)操作手册，并参见Sambrook等在“分子克隆”(实验室手册，冷泉港，1989)的方法，加入(1)10×PCR反应缓冲液10μl，(2)两引物各2μl，(3)10mmol/L dNTPs(脱氧核苷三磷酸)2μl，(4)Taq DNA polymerase(5U/μl)1μl，(5)补去离子水至100μl反应体积，(6)加石蜡油覆盖液面，进行PCR扩增，反应条件93.5℃变性60s，50℃退火90s，72.5℃延伸180s，循环30次，最后一次循环在72.5延伸7min，经电泳检测，得到单一的长约2.9kb的En-TnGV基因全长DNA片段。
(二)En-TnGV基因PCR产物的回收低熔点琼脂糖回收PCR扩增的En-TnGV基因。用低熔点琼脂糖制备0.7％的凝胶，将DNA样品与加样缓冲液(滇酚蓝0.25％，蔗糖40％)混合，加入点样孔，电泳结束后，在长波(256nm)紫外灯确定并切下～2.96KbDNA带，放入1.5ml离心管中，加入约5倍体积的20mmol/L Tris·Cl(三羟甲基氨基甲烷的盐酸盐溶液)-1mmol/L EDTA(乙二胺四乙酸)(pH8.0)至琼脂糖块中，65℃温育至凝胶块熔化，加入等体积碱性酚，颠倒数次混匀后，8,000rpm离心10min，水相用酚∶氯仿∶异戊醇，氯仿∶异戊醇，氯仿∶异戊醇各抽提一次，再加入1/10体积3mol/LNaAc(pH5.2)及2倍体积无水乙醇，混匀后-20℃过夜，次日离心，弃上清，用75％乙醇洗涤DNA沉淀，室温干燥后溶于适量TE缓冲液中，-20℃保存。
(三)Dot blot验证En-TnGV基因(1)En-TnGV基因探针的制备按DIG标记及检测试剂盒操作手册进行，加1μg En-TnGV基因PCR产物，补加灭菌双蒸水至16μl，100℃煮沸10min，快速在冰NaCl冰浴，加4μl DIG-High Prime(地高辛标记引物)，混匀，37℃放置1-20hr，最后65℃加热10min终止反应。
(2)去除未结合的DIG-dUTP(地高辛标记的脱氧尿苷三磷酸)在上步处理样品中，加无水冷乙醇(-20℃)80μl，混匀，-20℃放置2hr，12,000rpm离心15min，去上清，加50μl 75％乙醇洗沉淀，自然干燥，加50μl TE缓冲液溶解探针DNA。
(3)预杂交将TnGV-DNA基因组1μl，点在硝酸纤维素膜上，室温干燥后，在变性液(1.5mol/L NaCl-0.5mol/L NaOH)中处理5min，水中漂洗2min，复性液[1mol/L Tris·Cl(pH7.4)1.5mol/L NaCl]中处理5min，2×SSC液中漂洗2min，室温晾干，80℃烘膜2hr备用，与探针DNA杂交。将干膜于5×SSC浸湿后，放到杂交袋中，按0.2ml/cm2的量加杂交液，封口并不留气泡，68℃水浴2hr。
(4)DNA杂交将标记好的探针DNA在沸水煮10min后，冰浴，加入杂交液(5×SSC1.5％Blocking reagent0.1％N-Laurol-sarco-sine0.02％SDS)中，混匀，剪开杂交袋，倒出杂交液，注入新的杂交液，重新封口并不留气泡在袋内，68℃保温8-24hr。
(5)显色从袋中取出膜，用洗涤液I(2×SSC0.1％SDS)洗10min后，重复3次→再用洗涤液II(0.1×SSC0.1％SDS)洗15min，重复2次→在bufl(0.1M马来酸0.15MnaCl pH7.5)中洗5min→在buf2(含1.5％Blocking reagent的bufl)中轻摇30min→在buf2*，27℃，轻摇30min→用bufl洗15min，重复2次→在buf3中洗2min，放入20ml新配buf4，避光放置1-8hr，观察结果，若出现合适的点就用TE缓冲液50ml冲洗5min。
(四)质粒DNA的制备及DNA的限制性内切酶消化使用常规技术(参见Sambrook等在“分子克隆”的方法，实验室手册，冷泉港，1989)培养细菌并分离质粒DNA。
(1)细菌的生长和质粒的扩增从平板上挑取单菌落接种到含有氨苄青霉素和卡那霉素抗生素的LB培养基中，37℃，200rpm培养过夜，至培养物OD600达到0.6以上。
(2)快速提取质粒DNA将培养物移至离心管中，8,000rpm离心5min弃上清，收集菌体，每5ml菌液的菌体加1ml STE(0.1MnaCl，10mM Tris·Cl pH8.0，1mMEDTApH8.0)重悬，8,000rpm离心5min，弃上清，将沉淀重悬于200μl冷溶液I(50mM葡萄糖，25mM Tris·Cl pH8.0，10mMEDTA pH8.0)，加入400μl新鲜配制的溶液II
，缓慢颠倒数次置冰浴几分钟，另入300μl冷溶液III(5M醋酸钾60ml，冰乙酸11.5ml加蒸馏水至100ml)，倒置管温和地振荡10秒钟混匀内容物，置冰上5min，12,000rpm离心5min，吸取上清至另一干净离心管，加等体积酚∶氯仿∶异戊醇充分混匀，12,000rpm离心2min，吸取水相至另一干净离心管，加2倍体积的无水冷乙醇，混匀后室温放置15min，12,000rpm离心10min，倒尽上清，用75％乙醇洗涤沉淀，12,000rpm离心5min后倒出乙醇，管倒置于纸巾上，使残余乙醇挥发，加入50μl TE缓冲液溶解核酸沉淀。加入RNase A至终浓度20μg/ml，37℃放置1hr，以琼脂糖凝胶电泳鉴定无RNA带后加入等体积酚∶氯仿∶异戊醇抽提，吸水相至另一干净离心管，加入1/10体积3mol/L NaAc(pH5.2)，再加入2倍体积无水乙醇，混匀后置-20℃，1小时左右后，12,000rpm离心10min，核酸沉淀用75％乙醇洗涤，自然干燥后加TE缓冲液20uL，置-20℃保存。
(五)En-TnGV基因DNA片段的克隆1.En-TnGV基因PCR产物的磷酸化按Promega公司的T4噬菌体多核苷酸激酶操作手册并参见Sambrook等在“分子克隆”(实验室手册，冷泉港，1989)，在灭菌的0.5ml离心管中。
(1)加入En-TnGV基因PCR产物1μg，(2)激酶10×缓冲液4μl，(3)0.1mM的ATP2μl(4)T4多核苷酸激酶10U，(5)补加去离子水至40μl，37℃水浴30min，加入2μl 0.5M EDTA终止反应。加40μl苯酚∶氯仿∶异戊醇振荡1min，8,000rpm离心2min，再用氯仿∶异戊醇抽提1次，转移上清水相至一干净离心管，加入1/10体积3M乙酸钠，2倍体积无水乙醇，混匀，置于-20℃过夜，12,000rpm离心20min，弃上清，自然干燥，重悬DNA于20uL TE缓冲液。
2.连接En-TnGV基因PCR产物到pGEM-T质粒按Promega公司的pGEM-T载体操作手册并参见Sambrook等在“分子克隆”，实验室手册，冷泉港，1989，在已灭菌干净的0.5ml离心管中，加入(1)10×T4DNA连接酶缓冲液1μl，(2)50ng/μl的pGEM-T载体，1μl，(3)约50ng的上述处理样品DNA，(4)3Weiss units/μl T4 DNA连接酶1μl，(5)补加去离子水至10μl，混匀后置4℃连接过夜。
3.大肠杆菌TG1菌株感受态细胞的制备和转化从37℃培养16-20hr的新鲜LB平板中挑取Ecoli TG1单菌落，置3mlLB液体培养基试管中，37℃，200rpm培养过夜，再将菌液按1∶100比例接种于适量LB培养基中，37℃剧烈振荡培养约3hr(OD600＝0.3-0.4)，将菌液转入1.5ml无菌离心管，置冰上10min，待培养物预冷至0℃时，4,000rpm离心10min，收集菌体，倒出培养液以0.5ml冰冷的0.1mol/L CaCl2重悬细胞，置冰上半小时后，4,000rpm离心10min，倒出上清，加入100μl冰冷0.1mol/L CaCl2重悬细胞。所制成感受态细胞置4℃，并在12～24hr内使用。
在100μl E.coli TG1菌株感受态细胞中加入8uL待转化的连接产物DNA(DNA≤50ng)，轻旋以混匀内容物，置冰上30min，于42℃水浴中热休克90s后，迅速移至冰浴中，待细胞冷却1-2min后，每管加入900μl SOC培养液(蛋白胨20g，酵母粉5g，NaCl0.5g，250mMKCl 10ml，5MnaOH调pH值至7.0，15磅20分钟高压灭菌。临用前加入5ml已灭菌的2MMgCl2，20ml已灭菌的1M葡萄糖溶液)，置37℃，150rpm温育45min，将转化细胞涂布至含100μg/ml氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养12-16小时后观察转化结果。
(六)工程菌株E.coli TG1(pGEM-T/En)的筛选(1)显色平板在Amp+平板上涂布30μl X-gal(5-溴-4-氯-3吲哚-β-硫代半乳糖，X-gal20mg/ml溶于二甲基甲酰胺中)和10μl IPTG(100mg/ml)，待平板表面液体被完全吸收后，涂布转化后的细菌悬液，37℃放置约1hr，使平板吸收完菌液，再倒置培养12-16小时，白色菌落为阳性，蓝色菌落为阴性。
(2)重组质粒pGEM-T/En的酶切鉴定将小量提取的重组质粒pGEM-T/En用限制性内切酶SalI，BamHI和KpnI单酶切消化，用0.7％琼脂糖凝胶电泳，经EB染色后观察，通过与分子量比较DNA片段大小的方法进一步鉴定。
权利要求
1.一种工程菌株E.Coli TG1(pGEM-T/En)，该工程菌株已提交至中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏编号为CTCC M20006。
2.根据权利要求1所述的工程菌株，它携带粉纹夜蛾颗粒体病毒增效蛋白全基因，并能够在原核生物中复制。
3.根据权利要求1所述的工程菌株，其特征在于它所含重组质粒pGEM-T/En是由下列DNA元件构成(1).粉纹夜蛾颗粒体病毒增效蛋白全基因；(2).丝状噬菌体f1复制起始点；(3).大肠杆菌质粒复制起始点；(4)氨苄青霉素抗性基因。
4.一种构建权利要求1-3所述的工程菌株的方法，其特征在于以TnGV基因组DNA作模板，设计引物P15’TCCTCCAATGTTGCACGATT，P25’AACTGACTGTTGAACGTTAT，PCR法扩增增效蛋白基因，得到全长～2.9Kb的片段，与pGEM-T载体用T4DNA连接酶连接后，再转化至大肠杆菌E-coli TG1受体菌，经筛选获得含增效蛋白全长基因片段的工程菌株。
全文摘要
本发明公开了一种通过基因工程手段构建工程菌株:CTCC M20006 EColi TG1(pGEM－T/En)、工程菌株的构建方法和工程菌株的用途。该菌株是以TnGV为模板,经T
文档编号C12N1/21GK1331285SQ0011466
公开日2002年1月16日 申请日期2000年6月30日 优先权日2000年6月30日
发明者孟小林, 徐进平 申请人:武汉大学