专利名称：转人血管抑素(Angiostatin)基因藻的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种利用基因重组技术将外源目的基因人血管抑素(Angiostatin)基因导入受体藻的制备方法。通过转基因藻的繁殖，规模生产目的基因的产物。
研制和开发抗肿瘤药物一直是国内外的热门课题，传统的化学药物治疗方法针对的是增殖速度快的肿瘤细胞，由于毒副作用大和易导致耐药性等缺点，临床应用受到一定限制。近几年研究证明，象癌这样的实体瘤其生长依赖于血管生成，新血管生成是肿瘤生长和转移扩散的必要条件。阻断实体瘤血管生成能限制肿瘤生长和防止转移。因此，抗肿瘤血管内皮细胞间质治疗为肿瘤治疗提供了新途径。1994年美国科学家Folkman等人发现了血管抑素(Angiostatin,ANG)。实验证明，这种血管抑素在体外能强烈抑制小牛血管内皮细胞增殖，在体内抑制肿瘤血管生成，从而抑制肿瘤生长和转移。由于血管抑素无毒副作用，而且具有强的抗肿瘤血管内皮生成作用，它在二十一世纪可能成为治疗恶性肿瘤复发和转移的主导药物之一，市场需求量大，前景广阔。自从血管抑素发现后，国外进行了许多有关它的结构及利用DNA重组技术生产血管抑素的研究，目前国外生产的血管抑素大多数是利用大肠杆菌为宿主的发酵法，其下游纯化工艺相当复杂，成本提高。此外，大肠杆菌为原核生物，影响重组人血管抑素的糖基化过程，产品生物活性难以保证。
由于用大肠杆菌发酵法生产血管抑素存在上述缺点，因此如何利用转基因动物或植物生产血管抑素成为国际上研究的一大热点。一般认为，利用转基因植物要比转基因动物生产重组蛋白具有更多优点1、与动物细胞培养相比，植物细胞培养条件简单而且易于成活，有利于遗传操作。2、转基因植物中的外源基因可通过植物杂交方法进行基因重组，进而在植物体内积累基因。3、用动物细胞生产重组蛋白，可能污染动物病毒，这对人体可能造成潜在危险，而植物病毒不感染人类，所以用植物细胞生产重组蛋白更为安全。目前国外利用转基因植物生产的药物如乙型肝炎表面抗原疫苗已获得成功。由于上述优点，利用转基因植物作为廉价的生产系统有可能成为今后基因工程药物的主流。
本发明的目的在于利用新型生物反应器转基因蓝藻或绿藻，生产一种血管生成抑制因子血管抑素(Angiostatin)，它能抑制不同实体瘤的血管内皮细胞增殖和血管再生，使肿瘤失去血液供应及营养来源，从而抑制肿瘤生长和转移。
本发明的目的是通过以下方法来达到
转人血管抑素(Angiostatin)基因藻的制备方法是将含有人血管抑素(Angiostatin)基因的表达载体，通过介导基因转化法导入受体藻中，再经过筛选培养，得到转人血管抑素(Angiostatin)基因藻。
本发明中，制备了四套不同的表达载体，利用下述不同基因转化法将人血管抑素基因片段导入受体藻染色体基因组、叶绿体基因组或以游离质粒形式存在于受体藻细胞质中。
介导基因转化法可为三亲结合法、农杆菌介导法、紫外激光微束法、电击穿孔法、PEG法、基因枪法、玻璃珠搅拌法或者其它转化方法等。
受体藻可为蓝藻和绿藻，其中蓝藻包括鱼腥藻、螺旋藻等，绿藻包括盐藻、衣藻和小球藻等。
本发明主要包括以下步骤1、从人胚肝细胞或人粒细胞中按常规方法提取全mRNA，经逆转录制备cDNA，以此为模板，用PCR方法扩增Angiostatin基因片段。
2、应用基因克隆方法将Angiostatin基因片段克隆到适当的藻表达载体上，运用三亲结合法、农杆菌转化法、基因枪法、PEG法、玻璃珠搅拌法或其它转化方法转入到受体蓝藻或绿藻中。
3、将经转基因处理后的受体藻扩增培养后涂布于含筛选标记物适宜该藻生长的培养基平板上，光照培养5-10天，然后挑取单一藻落于常规液体培养基中培养，如此反复接种培养至继代培养至少15代。
经上述方法处理和培养所得蓝藻或绿藻即为目的基因(人血管抑素)的转化藻体，可供常规培养用。
本发明制备的转人血管抑素(Angiostatin)基因藻可制成口服制剂，也可经纯化制成注射剂。
本发明与现有技术相比具有以下优点本发明所采用的藻类培养条件简单，遗传操作较简便，且无毒素，并有较高营养价值，可供食用，故具有安全、高效、经济的特点，是一种理想的新型生物反应器。此外，本发明与大肠肝菌为宿主的发酵法比较，具有降低成本和简化下游纯化工艺等优点，据初步估计，利用转基因盐藻生产1.0克血管抑素的费用约为发酵法的56％。必将提高该产品在国际、国内市场的竞争力，具有极大的社会经济效益。
附图的图面说明如下
图1人血管抑素(Angiostatin)基因克隆载体pUC19-ANG的构建示意图。
图2蓝藻表达载体pDC8-ANG的构建示意图。
图3盐藻基因组表达载体pBI121-ANG的构建示意图。
图4载体p64A，其上克隆有叶绿体同源片段clpP-tml-petB及chlL基因。
图5叶绿体表达载体p64C-ANG的构建示意图。
图6自主复制载体pBPV-ANG的构建示意图。
现以转基因鱼腥藻和盐藻为例，对本发明做进一步详细说明，但这些说明不应被理解为对本发明所指出的受体藻范围的限定。
实施例一转基因蓝藻(以鱼腥藻为例)1.1人血管抑素(Angiostatin)基因克隆载体pUC19-ANG的构建(如
图1所示)(1)合成两种引物，分别为5’-ATCGGATCCATTATTTGAAAAGAAAGTG-3’和BamHⅠ5’-ATCG GAATTC AAGCAGGACAACAGGCGG-3’。
EcoRⅠ(2)取人胚肝2克，匀浆破碎细胞后提取全mRNA，经过逆转录制备人肝脏cDNA。(参考文献Ausubel FM,et.Short protocols in molecular biology 3rd ed,1995)(3)以从第(2)项得到的人肝脏cDNA为模板，加入第(1)项所述两种引物各2微升(浓度为0.1μg/μl)，加入5μl 2.5mM dNTP,5μl 10×PCR缓冲液和1μl Taq酶，在PCR仪上94℃ 1分钟，55℃ 1分钟和72℃ l分钟，共计32个循环。然后用1.5％琼脂糖凝胶电泳回收Angiostatin基因，并带有BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点。
(4)用常规克隆方法将第(3)项得到的Angiostatin基因用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切割，同时将pUC19用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切割，将Angiostatm基因片段插入到载体pUC19中，构成人血管抑素(Angiostatin)基因克隆载体pUC19-ANG。
1.2蓝藻表达载体pDC8-ANG的构建(如图2所示)(1)利用常规克隆方法，用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切割实施例一中1.1项制备的人血管抑素(Angiostatin)基因克隆载体pUC19-ANG,15％琼脂糖电泳回收Angiostatm基因片段。
(2)用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切割质粒pRL439，并将第(1)项回收的Angiostatin片段插入到pRL439中，构成中间载体pRL439-ANG。
(3)将第(2)项制备的中间载体pRL439-ANG用EcoRⅠ和SalⅠ双酶切割，并将载体质粒pDC-8用EcoRⅠ和SalⅠ双酶切割，将pRL439-ANG中的EcoRⅠ/SalⅠ片段插入到pDC-8中，其中带有PpsbA启动子和扩增的Angiostatm片段，构成蓝藻表达载体pDC8-ANG。
1.3三亲结合法制备转Angiostatin基因蓝藻(1)鱼腥藻PCC7120于BG-11培养基中光照振荡培养2天，取40ml藻细胞，25℃4900r/min离心10分钟。沉淀的藻细胞经BG-11培养液洗涤离心后，重悬于0.5ml BG-11培养基中；并用BG-11培养液1∶10和1∶100稀释后备用。
(2)按常规克隆方法，用蓝藻表达质粒pDC8-ANG转化大肠杆菌TG1，并用RP4接合质粒及pRL542辅助质粒转化大肠杆菌HB101。
(3)分别接种含穿梭表达质粒pDC8-ANG的大肠杆菌TG1和含pR4质粒、pRL542辅助质粒的HB101菌于40ml含氨苄青霉素的LB培养液中，37℃,250r/min，振荡培养约12小时。25℃,4900r/min，离心10分钟，菌体经LB培养液洗涤离心后，共同悬于1ml BG-11培养基中，4℃保存备用。
(4)将各稀释度的藻细胞和细菌按1∶10比例混合后，均匀涂布于混合纤维素酯微孔滤膜(0.4μm)上，在常规BG-11平板上30℃光照培养48-72小时后，将膜移至含20μg/ml新霉素的BG-11平板上继续光照培养，直到转化子出现。
实施例二转基因绿藻(以盐藻为例)2.1盐藻表达载体的构建2.1.1盐藻基因组表达载体pBI121-ANG的构建(如图3所示)(1)合成两种引物，分别为5’-ATCGGATCCATTATTTGAAAAGAAAGTG-3’和BamHⅠ5’-ATCGGAGCTC AAGCAGGACAACAGGCGG-3’。
SacⅠ(2)利用常规克隆方法，用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切割实施例一中制备的人血管抑素(Angiostatin)基因克隆载体pUC19-ANG，加入第(1)项所述两种引物各2微升(浓度为0.1μg/μl)，加入5μl 2.5mM dNTP,5μl 10×PCR缓冲液和1μl Taq酶，在PCR仪上94℃ 1分钟，55℃ 1分钟和72℃ 1分钟，共计32个循环。然后用1.5％琼脂糖凝胶电泳回收Angiostatm基因，其中含有BamHⅠ和SacⅠ酶切位点。
(3)用常规克隆方法将第(2)项得到的Angiostatm基因用BamHⅠ和SacⅠ双酶切割，同时将pBI121用BamHⅠ和SacⅠ双酶切割，将Angiostatm基因片段插入到载体pBIl21中，构成盐藻表达质粒pBIl21-ANG。
2.1.2叶绿体表达载体p64C-ANG的构建(如图5所示)(1)合成两种引物，分别为5’-ATCGGATCCATTATTTGAAAAGAAAGTG-3’和BamHⅠ5’-ATCGGAGCTC AAGCAGGACAACAGGCGG-3’。
SacⅠ(2)利用常规克隆方法，用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切割实施例一中制备的人血管抑素(Angiostatin)基因克隆载体pUC19-ANG，加入第(1)项所述两种引物各2微升(浓度为0.1μg/μl)，加入5μl 2.5mM dNTP,5μ1 10×PCR缓冲液利1μl Taq酶，在PCR仪上94℃ 1分钟，55℃ 1分钟和72℃ 1分钟，共计32个循环。然后用15％琼脂糖凝胶电泳回收Angiostatin基因，其中含有BamHⅠ和SacⅠ酶切位点。
(3)载体p64A上克隆有叶绿体同源片段clpP-tml-petB及chlL基因(长5.2kb)(如图4所示)。合成四条引物，分别为引物15’-CCTGGAGCTCATGGATCCTAGATATCGTCATAAAATCAAACTCCAGGAATAAAAAC-3’SacⅠ BamHⅠ EcoRⅠ引物25’-TTCTAAACGTTCTTCAAACCAATCG-3’引物35’-GATCGAGCTCCTAGGTGAATGCAGCTTAATAAGAATAAAGCAGCTTTAAATACTTTCCT-3’SacⅠ AvrⅡ BsmⅠ引物45’-ATAAGCGAATTGACTTCAAAACTAAT-3’以p64A为模板扩增出chL5’和chL3′非编码区，并添加EcokⅤ、BamHⅠ、SacⅠ、AvrⅡ、BsmⅠ多酶克隆位点，构建成叶绿体表达载体p64C 。
(4)用常规克隆方法将第(2)项得到的人Angiostatin片段和第(3)项得到的质粒p64C均用BamHⅠ和SacⅠ双酶切割后，将Angiostatin基因片段插入到p64C中，构成叶绿体表达载体p64C-ANG。(如图5所示)2.1.3自主复制载体pBPV-ANG的构建(如图6所示)(1)合成两种引物，分别为5’-ATCCTCGAGATTATTTGAAAAGAAAGTG-3’和XhoⅠ5’-ATCGCCGCGGAAGCAGGACAACAGGCGG-3’。
SacⅡ(2)利用常规克隆方法，用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切割实施例一中1.1项中制备的人血管抑素(Angiostatin)基因克隆载体pUC19-ANG，加入第(1)项所述两种引物各2微升(浓度为0.1μg/μl)，加入5μl 2.5mM dNTP,5μl 10×PCR缓冲液和1μlTaq酶，在PCR仪上94℃1分钟，55℃1分钟和72℃1分钟，共计32个循环。然后用1.5％琼脂糖凝胶电泳回收Angiostatin基因，并带有XhoⅠ和SacⅡ酶切位点。
(3)用常规克隆方法将第(2)项得到的Angiostatm基因片段用XhoⅠ和SacⅡ双酶切割，同时将质粒pBPV用XhoⅠ和SacⅡ双酶切割，然后将Angiostatm插入到pBPV中，构建成自主复制型载体pBPV-ANG。
2.2盐藻表达载体转化2.2.1农杆菌转化法制备转Angiostatin基因盐藻(1)将实施例二中2.1.1所制备的盐藻表达载体质粒pBI121-ANG在大肠杆菌JM109中大量扩增，参见《分子克隆》。
(2)从含50μg/ml利福平的YEP平板上挑取农杆菌单菌落，接种于5ml含50μg/ml利福平的YEP液体培养基中，200r/min、28℃培养过夜。取2ml过夜培养液接种于50ml含50μg/ml利福平的YEP液体培养基中，在相同条件下培养至OD600达0.5，菌液冰浴30分钟，4℃、5000r/min离心10分钟，收集菌体。将菌体悬浮于10ml 0.15mol/L的NaCl中，离心收集菌体，再悬浮于1ml 20mmol/L CaCl2溶液，以每份0.2ml将菌体悬浮液分装在1.5mlEppendorf管中，置液氮速冻1分钟，-70℃冰箱保存备用。
(3)室温融化农杆菌感受态细胞，加入1μg第(1)项制备的载体质粒pBI121-ANG，混匀后冰浴30分钟，然后置液氮速冻1分钟，经37℃保温3分钟后加1ml YEP培养液，摇匀，置28℃保温3小时，再以5000r/min离心3分钟，收集菌体，涂布于含50μg/ml利福平、50μg/ml卡那霉素的YEP平板上，28℃暗培养2～3天，待转化子菌落长出后，挑出单菌落提取质粒，进行鉴定。
(4)将盐藻接种于TAP培养基中，28℃ 200r/min光照培养4天。700r/min离心5分钟，去上清，TAP培养基反复洗涤3次后，用新鲜TAP液体培养基重新悬浮藻体，使浓度为2×105/ml。将悬液分装于9ml的培养皿中，每皿5ml左右，在弱光照(400Lux)下静置培养1-2天。同时将第(3)项鉴定正确的农杆菌接种于YEB液体培养基中，在28℃、200r/min条件下振荡培养至OD600为0.5左右，将菌液转入无菌离心管中，5000r/min离心5分钟，收集菌体，用TAP液体培养基悬浮，稀释至菌细胞浓度为1×109/ml放置冰上待用。
(5)取50μl农杆菌加入到盛有盐藻细胞的培养皿中轻轻混匀，使农杆菌盐藻约为100∶1，于25℃共培养2天。
(6)将共培养液转入无菌离心管中，700r/min离心5分钟，弃上清。加入TAP培养液洗涤3次。最后用含500μg/ml羧苄青霉素及头孢霉素的TAP培养液悬浮细胞沉淀，使细胞浓度约为3～6×104/ml，于25℃、100r/min条件下进行选择培养。3天后转入同体TAP选择培养基(含500μg/ml羧苄青霉素及头孢霉素)中继代选择培养至转化藻落出现。
2.2 2基因枪法制备转Angiostatin基因盐藻(1)称取60mg 0.1μm金粉于Eppendorf管中，加入1ml 70％酒精，充分涡旋，静置15分钟，1500r/min离心5分钟弃上清，用同法洗涤3次后将沉淀转入1ml无菌的50％甘油中。
(2)取实施例二2.1.1,2.1.2或2.1.3项中制备的质粒5μl(浓度为1μg/μl)，加入50μl上述颗粒中，并加入50μl 2.5mol/L CaCl2和20μl0.1mol/L亚精胺。混合物涡旋10分钟，15000r/min离心5分钟，去除上清液，用140μl 70％乙醇冲洗沉淀1次，再用100％乙醇冲洗1次，最后用48μl 100％乙醇重悬，并用超声波处理3秒钟，分散金颗粒。
(3)将置于超净工作台内的基因枪内壁用70％酒精仔细擦净。选用900Psi的压力膜，与轰击膜和阻挡网一同置于70％酒精中浸泡15分钟，取出，在超净台上吹干。吸取第(2)项制备的DNA-金颗粒悬浮液5～10μl均匀涂布于轰击膜上，使溶液分布均匀，室温晾干后，将其与阻挡网一起装入基因枪装置中。抽真空至真空度为660mmHg后轰击，一个培养皿中的材料轰击2次，第2次轰击时将培养皿旋转90度。
(4)将经过第(3)项轰击处理后的盐藻平皿置于300Lux的光照条件下培养1～2天，再用1ml无菌水洗下，涂于含10μg/ml新霉素的TAP固体培养基上培养。
(5)3000Lux连续光照条件下培养一周后，挑取单藻落再进行一次筛选，涂于含20μg/ml新霉素的TAP平板上，至转化子出现。
2.2.3PEG法制备转Angiostatm基因盐藻(1)将盐藻细胞悬浮于W5液中30分钟，500r/min离心5分钟收集菌体，重新悬浮至浓度为2×106/ml，取0.5ml悬液放入10ml离心管中，加入50μl小牛胸腺DNA静置10分钟。
(2)加入实施例二中2.1.1或2.1.3项中制得的质粒10μl，静置10分钟，加入等体积40％PEG，立即混匀，放置30分钟，每隔5分钟加1～2ml 0.25mol/L CaCl2溶液，逐步稀释到10ml为止。
(3)离心收集盐藻，重悬于10ml常规TAP培养液中培养。
2.2.4电击法制备转Angiostatin基因盐藻(1)盐藻培养4天后收集藻体，用含有0.2mol/L甘露醇和0.2mol/L山梨醇的TAP培养液处理1.5小时，1000rpm离心10min，用电击缓冲液调至密度为1×108/ml。
(2)加入实施例二中2.1.1或2.1.3项的质粒DNA至浓度为10μg/ml并和25μg/ml的鲑精DNA充分混匀，在冰上放置5-10min。
(3)取0.4ml混合好的培养细胞放入电击小杯中进行电击，其中脉冲距离为2mm，电场强度为6000V/cm，脉冲持续期为0.2s，脉冲次数为28，进行100个循环周期，重复3次。
(4)电击完毕后，将混合细胞接种于20mlTAP液体培养基中光照培养5～10天。
2.3转基因盐藻的筛选培养将经过实施例二中2.2.1、2.2.2、2.2.3和2.2.4处理得到的转基因盐藻离心收集后，在常规TAP液体培养基中扩增，涂布于50μg/ml新霉素的0.5％琼脂TAP培养基平板上，光照培养5～10天，然后再挑取单一藻落于常规TAP液体培养基中培养，如此反复选择性培养15代(15个周期)。每代进行Angiostatm基因表达的鉴定。最后经扩增培养后冷藏保存，可作为一级种子。
生产时取一级藻种在Mclachlan培养液中扩增培养，制备成转Angiostatin基因藻口服制剂，或将表达产物经纯化后制备成重组人Angiostatin注射剂。
权利要求
1.一种转人血管抑素(Angiostain)基因藻的制备方法，其特征在于将含有人血管抑素(Angiostatin)基因的表达载体，通过介导基因转化法导入藻中，再经过筛选培养，得到转人血管抑素(Angiostatin)基因藻。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于介导基因转化法选择适合载体的常规转化方法，例如电击穿孔法、基因枪法、PEG法、玻璃珠搅拌法、农杆菌介导法、三亲结合法。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于受体藻包括(1)蓝藻如螺旋藻、鱼腥藻；(2)绿藻如盐藻、衣藻和小球藻。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于筛选培养过程包括以下步骤，将转基因处理后的藻扩增后，涂布于含抗生素的培养基平板上，光照培养，然后挑取单一藻落于常规液体培养基中培养，如此反复接种培养至继代培养至少15代。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于转人血管抑素(Angiostatin)基因藻经处理后可制成口服制剂。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于转人血管抑素(Angiostatin)基因藻其表达产物纯化后制成注射剂。
全文摘要
一种转入血管抑素(Angiostatin)基因藻的制备方法,特征为将含有人血管抑素基因的表达载体,通过PEG法或基因枪法等介导基因转化法导入藻中,再经过筛选培养,得到转人血管抑素基因藻,后经继代选择性培养,从而获得转基因藻。这种转人血管抑素藻经处理后可制成口服液或纯化后制成注射剂,两者均可用于治疗实体瘤。本发明采用转基因藻生产人血管抑素具有安全、高效、经济等优点。
文档编号C12N15/29GK1315500SQ00114449
公开日2001年10月3日 申请日期2000年3月28日 优先权日2000年3月28日
发明者薛乐勋, 潘卫东, 姜国忠, 王建民, 郑合明, 张贵星, 鲁照明, 董子明, 张云河, 赵勤, 苏堤, 王建人, 杜保华 申请人:薛乐勋