专利名称：：包含血管抑素或其片段的复合物、其制备方法及应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及含有血管抑素或其片段，优选片段Kl-3的复合物和缓释制剂及其制备方法。本发明涉及的复合物无毒副作用、具有更高的生物活性以及更好的代谢稳定性。本发明还提供含有这种复合物和缓释制剂的药物组合物以及含有这种复合物的试剂盒。本发明还提供使用本发明中的复合物、缓释制剂、药物组合和试剂盒来预防、诊断、治疗肿瘤、制备抗肿瘤药物以及抗新生血管疾病的方法。
背景技术：
：癌症是当今世界的常见病以及多发病，是威胁人类生命的头号杀手。因此抗癌药物的开发以及研制一直是国内外的热门课题。目前临床上常用的抗癌药物多为传统的化疗药物，长期使用易导致耐药性以及对人体也有很大的毒副作用，在临床应用上受到很大的限制。1971年，Folkman提出肿瘤的生长和迁移依赖于新生血管生成理论，新生血管生成是指在原有血管上生成新的毛细血管。因此，阻断肿瘤新生血管生成就可能阻止肿瘤的生长和转移。将肿瘤中的新生血管内皮细胞作为癌症治疗的靶点，为治疗肿瘤提供了一种治疗方式，即抗血管生成治疗(FolkmanJ.NEnglJMed1971;285:1182-1186)。血管抑素(Angiostatin)是1994年O'Reilly等在Lewis肺癌荷瘤小鼠的血清和尿液中提取的内源性血管生成抑制剂。它是小鼠血纤溶酶原(Plasminogen)N端从第98位氨基酸残基(以起始氨基酸残基Met为第一位氨基酸)起始的一段序列(O'ReillyMS，HolmgrenL,ShingY,etal.Cell,1994,79:315-328)，它至少包括血纤溶酶原5个Kringles结构中的前4个，每个Kringle结构由80个左右氨基酸残基组成(LerchPG，RiskliEE,LergierW,etal.EurJBiochem，1980,107:7-13)。研究发现重组人纤溶酶原的K1、K2、K3、K5、Kl-3、K2-3、Kl-5等都能有效抑制牛毛细血管内皮细胞(bovinecapillaryendothelialcell,BCE)细胞增殖，而K4几乎无此活性。Kl-3抑制细胞增殖的活性明显强于最初发现的血管抑素Kl-4(CaoY,JiRW,DavidsonD,etal.JBiolChem，1996，271(46):29461-29467.)。研究进一步发现Kl-3能抑制小鼠Lewis肺癌生长及转移作用，也能抑制小鼠Lewis肺癌原发瘤及小鼠血管内皮瘤等在内的多种原发瘤的生长。血管抑素发挥活性的机理在于它通过抑制血管内皮细胞的增殖，从而抑制了肿瘤组织新生血管的生成，从而切断提供肿瘤组织营养和氧气的运输通路，最后饿死肿瘤。O'Reilly指出，血管抑素是内源性纤溶酶原内部的一个片断，它特异性的作用于增生的血管内皮细胞，因此一般不会引起免疫反应，长期注射也不出现体重减轻、活动减少、食欲下降及条件致病菌的感染等副作用(SimBKL，O'ReillyMS,etal.CancerRes,1997,57:1329-1334,)，同时也不会影响肝、肾的功能(KirschM，StrasserJ，AllendeR,etal.JBiolChem,1996,271(46):29461-29467)。相比之下，目前市场上大部分的化疗药物，主要是针对肿瘤细胞，但是肿瘤细胞具有遗传的不稳定性以及高的突变率，故而极易产生耐药性，影响药效。鉴于以上原因，血管抑素在肿瘤细胞的治疗上已经取得很明显的疗效，有望成为二十一世纪的主打抗癌药物。然而，尽管包括血管抑素在内的多肽和蛋白质类药物相比于化学药物具有毒副作用小，以及不产生耐药性等优点，并且为了尽可能的提高蛋白药物的生物利用度以及减少其在体内的降解，通常采用静脉给药方式，但是对于分子量小的蛋白来说，静脉给药的体内半衰期很短。体内的蛋白降解只是其中一方面的原因，另一个重要的方面是，小分子蛋白能够通过肾过滤的途径很快的被消除。研究发现，血液中水力半径超过白蛋白或是分子量大于约66,000道尔顿(66kDa)的蛋白，通常可以稳定的保留在循环系统中。但是小分子却会通过肾小球过滤很快的被消除。所以，为维持小分子量蛋白在血液中的有效治疗浓度，需要进行频繁的注射或点滴。这种治疗方式虽然能达到治疗的目的，但是却给病人带来了严重的不便与痛苦，提高了用药成本，对某些药物长期的使用还有可能产生一些副作用，例如免疫反应。作为蛋白药物的血管抑素同样存在半衰期短，体内清除率高的缺点。本发明的目的就在于改善该蛋白的体内代谢特征，使其具有更高的稳定性和更长的体内半衰期，取得更好疗效。高分子聚合物是改变和控制药物的动力学特性如半衰期、免疫学特征、毒理特性的常用方法。它具有水溶性好、生物相容性好、无或弱免疫原性等特征。其中聚乙二醇(polyethyleneglycol,PEG)是应用最为普遍的一种蛋白修饰分子。PEG分子具有两亲性，既可以溶解于水，又可以溶解于大多数的有机溶剂，无毒、无免疫原性、在水溶液中有高溶解性等性质，是被包括美国FDA、中国SFDA在内的很多，家的药品管理机构批准的，可用于药物制备的高分子之一。将蛋白质与亲水性的高分子(如聚乙二醇)偶联，可增加蛋白稳定性、减少非特异性吸附和抗原性。当偶联物达到一定分子量时，可大大降低肾脏的排除效率，这种方法是延长蛋白质药物体内半衰期的一种有效方法(FrokjaerS.etal.Nat.Rev.DrugDiscov.2005Apr4(4):298-306;HarrisJM.etal.Nat.Rev.DrugDiscov.2003Mar2(3):214-21)。最初PEG修饰都是以氨基作为反应位点，主要包括蛋白的N端(x-氨基和赖氨酸残基侧链上的s-氨基。这一类反应的产物是一个蛋白分子与一个或多个PEG分子偶联。对于赖氨酸残基侧链s-氨基上的修饰也往往因为反应位点不特异而产生修饰后的同分异构体。目前，针对蛋白N端a-氨基和赖氨酸残基侧链s-氨基的等电点差异，又新开发出了只针对蛋白N端的PEG修饰试剂，使得修饰位点一致，修饰产物组成均一。另一种可用于PEG修饰的蛋白位点是半胱氨酸的巯基。由于巯基在蛋白中的数目通常少于氨基，所以这类修饰的位点更加特异。利用基因工程技术，可以在蛋白任的何部位引入半胱氨酸作为特异的修饰位点。但是此类引入半胱氨酸作为修饰位点也是有一定的局限性，因为对某些本身带有半胱氨酸的蛋白，可能会造成二硫键的错配或无法复性。另外蛋白的羧基也是一种常用的修饰位点(VeroneseFMetal.DrugDiscov.Today.2005Nov1;10(21》1451-8.)。PEG修饰技术已经成功地运用在许多蛋白类药物上，比较成功的包括PEG-天冬酰胺酶(GrahamMLAdv.DrugDeliv.Rev.55，1293-1302AvramisVassiliosI.etal.W09939732andUS6689762)、PEG-腺酐脱氨酶(LevyYetal.J.Pediatr.113,312—:317;DavisSetal.ClinExp.Immunol.46:649-652;HershfieldMSetal.NEnglJMed316:589-596)和PEG-干扰素(BailonPetal.C.Bioconjug.Chem.12，195—202，WangYSetal.Adv.DrugDeliv,Rev.54，547—570，MengXiantaietal.WO2005077421，VanVlasselaerPeteretal.WO2004076474，BallonPascalSebastianetal.US2004030101,KarasiewiczRobertetalEP0593868)等。本领域希望得到半衰期较长以及生物活性更高的血管抑素片段或含有其的复合物。除PEG外，本领域常用的其他的高分子修饰剂有葡聚糖、聚蔗糖、淀粉、聚丙氨酸、乙二酸和丙二酸的共聚物、羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚1,3-乙二醇次甲基醚、乙烯和顺丁烯二酰肼的共聚物、多聚唾液酸、环糊精等。将血液蛋白或其片段作为载体，与药用蛋白偶联或融合表达，从而起到增加蛋白分子量的目的，也是一种延长药用半衰期的方法。例如用免疫球蛋白的Fc片段和目的蛋白偶联以延长其半衰期，例如将此方法用在Notchl受体蛋白(KitajewskyJanetal.WO2005-111072)、促红细胞生成素(EPO)(GilliesStephenDetal.WO2005-063808)、人生长激素(KimYoungMinetal.WO2005047337)等蛋白上。血浆白蛋白也是一种常用的偶联载体，可以运用在抗生素类，消炎类，抗氧化物等蛋白上(EzrinAlanMetal.WOO117568，OtagiriMasakietal.EP1571212)。另一种延长蛋白体内半衰期的方法是将蛋白做成缓释剂型。将蛋白药物放入一种药用载体中，使得蛋白从载体中缓慢释放，在体内维持一种稳定的药物浓度。常用的方法有水凝胶、微胶囊、微球、微型渗透泵、脂质体等(PeppasNAetal.Eur.J.Pharm.Biopharm.50,2746(2000);PackhaeuserCBetal.Eur丄Pharm.Biopharm.58，445—45:5(2004);MetselaarJMetal.MiniRev.Med.Chem.4，319—329(2002))。脂质体是一种具有双层膜结构的空球形态的超显微粒子。该双层膜由两亲分子多为磷脂构成并有水性的内腔。将亲水性的蛋白药物包裹在脂质体的内腔中，在体内缓慢释放，可以维持蛋白的血药浓度，达到增加半衰期的作用。一些实例包括用在神经生长因子(HouXiipuetal.CN1616087)、血红蛋白(FarmerMarthaCetal.US4911929)等。
发明内容本发明中描述的"Kl"、"K2"、"K3"、"K5"、"Kl-2"、"Kl-3"、"K1画5"、"K2-3"、"K2-5"、"K3画5"、"kringlesl-3"，凃特殊说明外，是指血纤溶酶原(Plasminogen)的片段，其中人血纤溶酶原的序列如SEQIDNO:7所示。(参见U.S.PatentNO:7，157,556和WO02/26782A2)-其中"K1-3"是指"Kringlesl-3"。PEG除特殊说明外，是指聚乙二醇，优选单甲基聚乙二醇(methylpolyethyleneglycol,mPEG)。在本发明的一方面，本发明人令人惊讶地发现了一种修饰物与血管抑素或其片段形成的复合物，所述复合物具有比未修饰的血管抑素或其片段更长的体内半衰期，所述修饰物选自高分子聚合物、蛋白质分子或其片段、肽链、小分子或其他任何形式的化学物质。根据本发明，该复合物不仅保持原有的抑制血管生成的活性，而且具有更高的生物活性和更长的体内半衰期，并且对细胞以及动物没有毒副作用，长期使用，也不会产生耐药性等副作用。另外，Henkin等人公开了PEG与K5所形成的复合物保持K5原有的生物活性，其半衰期提高到5.53h(WO02/26782A2)，但本发明中所描述的PEG与K1-3所形成的复合物体内半衰期延长至81.5h，远远高于PEG与K5所形成的复合物(参见本发明实施例4)。对于临床应用来说，具有更长的给药间隔或者是更少的给药剂量，这对于患者无论是经济上还是精神上，都是具有非常重要的意义。在一个优选的实施方案中，本发明的血管抑素是人、鼠或其他哺乳动物来源的。更优选地，所述血管抑素是人血管抑素。在另一个优选的实施方案中，本发明的血管抑素是重组血管抑素。更优选地，所述重组血管抑素是重组人血管抑素。在一个优选的实施方案中，本发明的血管抑素的片段选自血管抑素K1、K2、K3、K5、Kl-2、Kl-3、Kl-5、K2-3、K2-5和K3-5。更优选地，所述血管抑素片段是具有SEQIDNO:3所示序列的血管抑素Kl、具有SEQIDNO:4所示序列的血管抑素K2或具有SEQIDNO:5所示序列的血管抑素K3。最优选地，本发明所述血管抑素的片段是具有SEQIDNO:l所示序列的血管抑素Kl-3，并且当所述人血管抑素是由大肠肝菌表达的重组人血管抑素Kl-3时，其具有SEQIDNO:2的序列，其中N末端的Met在大肠肝菌表达时任选地被删除。在优选的实施方案中，用于本发明的复合物的血管抑素或其片段还包括血管抑素或其片段的具有活性的突变体、衍生物、异构体或是它们的组合。在一个优选的实施方案中，所述血管抑素或其片段的衍生物是在血管抑素或其片段的N端或C端附加一段长度为1-15个氨基酸的肽链形成的。在一个进一步优选的实施方案中，所述血管抑素或其片段的衍生物是在人血管抑素的N端附加一段7个氨基酸组成的含有His-tag的肽链MHHHHHH，该衍生物具有SEQIDNC):6的序列，并且当由大肠杆菌表达时其N末端的Met任选地被删除。在另一个优选的实施方案中，所述血管抑素或其片段的衍生物是在人血管抑素的N端附加一段序列为MGGSHHHHH或MGGSHHHHHH的肽链，并且当由大肠杆菌表达时其N末端的Met任选地被删除。在本发明的一个实施方案中，所述复合物中的修饰物与血管抑素或其片段通过共价键连接。在本发明的另一个实施方案中，所述复合物中的修饰物与血管抑素或其片段通过非共价键连接。优选地，修饰物可以通过化学偶联的方法连接到血管抑素或其片段上，也可以通过融合表达的方式和血管抑素或其片段连接到一起。本发明的高分子聚合物可以有生物活性，也可以没有生物活性。合适的聚合物包括但不限于聚烯醇类化合物、聚醚类化合物、聚乙烯吡咯烷酮、聚氨基酸、二乙烯基醚与马来酸酐的共聚物、N-(2-羟丙基)-甲基丙烯酰胺、葡聚糖及葡聚糖衍生物如硫酸葡聚糖、纤维素及纤维素的衍生物(包括甲基纤维素和羧甲基纤维素)、淀粉及淀粉衍生物、聚蔗糖、聚氧乙基多醇、肝素或肝素片段、聚烃基乙二醇及其衍生物、聚烃基乙二醇和其衍生物的共聚物、聚乙烯基乙醚、聚羟乙基天冬酰胺(a,P-Poly((2-Hydroxyethyl)-DL-aspartamide))、聚羧酸(polycarboxylates)、氧化乙烯和甲醛的共聚物(polyoxyethylene-oxymethylenes)、聚丙烯酰吗啉(polyacryloylmorpholines)、氨基化合物与氧化烯烃的共聚物、聚透明质酸、聚环氧化(pdyoximnes)、乙二酸与丙二酸的共聚物、聚1，3-乙二醇次甲基醚、乙烯和顺丁烯二酰肼的共聚物、多聚唾液酸、环糊精或其他药学上可接受的高分子聚合物。本发明的聚醚类化合物包括但不限于聚烷撑二醇(HO((CH2)xO)nH)、聚丙二醇、聚氧化乙烯(HO((CH2)20)nH)、聚乙烯醇((CH2CHOH)n)或它们的衍生物，所述聚烯醇类化合物包括但不限于聚乙二醇(包括单甲基聚乙二醇、单羟基聚乙二醇等)、聚乙烯醇、聚丙烯醇、聚丁烯醇或它们的衍生物。在一个优选的实施方案中，所述修饰物是聚乙二醇。一个更优选的方案中，所述聚乙二醇选用单甲基聚乙二醇。本发明使用的聚乙二醇分子是线性的或是分叉的。优选地，所述聚乙二醇分子的平均分子量位于1,000到100,000道尔顿之间。更优选地，所述聚乙二醇分子的平均分子量位于5,000到40,000道尔顿之间。最优选地，所述聚乙二醇是分子量为20kDa的单甲基聚乙二醇。在本发明的一个实施方案中，一个血管抑素分子或其片段和一个或多个聚乙二醇分子偶联。优选地，所述修饰是位点特异性的，不会影响血管抑素或其片段的生物活性。该修饰产物具有抗新生血管生成的活性，并且相比于无修饰物的血管抑素或其片段在代谢上更稳定，具有更长的血液半衰期，可以作为抗新生血管生成疾病或抗肿瘤的药物。优选地，所述血管抑素分子或其片段与聚乙二醇分子偶联的位点选自血管抑素或其片段的N端a-氨基、赖氨酸残基侧链的s-氨基、半胱氨酸残基侧链的巯基、天冬氨酸残基侧链的羧基、谷氨酸残基侧链的羧基中的一或多种。更优选地，所述血管抑素分子或其片段与聚乙二醇分子偶联的位点选自血管抑素或其片段N端ot-氨基或SEQIDNO:l所示序列第2、7、15、17、24、69、94、97、121、125、128、129、150、175、215、228、246位的赖氨酸残基侧链上的s-氨基中的一或多个。更优选地，一个血管抑素分子或其片段与一个聚乙二醇分子偶联，偶联位点为血管抑素或其片段N端的a-氨基。更优选地，在本发明的复合物中，一个具有SEQIDNO:2的重组人血管抑素分子的片段Kl-3与一个聚乙二醇分子偶联，偶联位点为血管抑素片段Kl-3N端的a-氨基。最优选地，在本发明的复合物中，一个具有SEQIDNO:2的重组人血管抑素分子的片段Kl-3与一个20kDa单甲基聚乙二醇分子偶联，偶联位点为血管抑素片段K1-3N端的a-氨基。在一个优选的实施方案中，本发明使用PEG特异修饰Kl-3N端的ot-氨基，其产物具有抑制内皮细胞增殖及迁移，抑制肿瘤细胞增殖,，抑制小鼠肿瘤生长的生物活性。在本发明的另一个实施方案中，一个血管抑素分子或其片段与一个或多个聚乙二醇分子偶联，偶联方法为在血管抑素分子或其片段内部或其N末端或C末端附加半胱氨酸或是含有半胱氨酸的肽链，使得偶联位点为附加的半胱氨酸残基侧链上的巯基。根据本发明，合适的聚氨基酸包括，但不限于同种氨基酸的聚合物，两种或两种以上的氨基酸的共聚物，例如聚丙氨酸。根据本发明，适合用作修饰载体的蛋白分子优选天然存在的蛋白或其片段，包括但不限于甲状腺结合蛋白、转甲状腺蛋白、转铁蛋白、纤维蛋白原、免疫球蛋白、白蛋白等以及它们的片段。上述的载体蛋白优选为人源的。上述蛋白的片段是指任何比该蛋白小却保持了载体功能的部分。在一个优选的实施方案中，本发明的复合物是白蛋白偶联的血管抑素或其片段，其特征为一个血管抑素分子或其片段和一个或多个白蛋白偶联，该偶联物可以是通过化学修饰得到的，或是通过融合表达得到的，或是通过其他方法得到的，其中的白蛋白优选人血清白蛋白或其片段。在另一个优选的实施方案中，本发明的复合物是免疫球蛋白Fc片段偶联的血管抑素或其片段，其特征为一个血管抑素分子或其片段和一个或多个免疫球蛋白Fc片段偶联，该偶联物可以是通过化学修饰得到的，或是通过融合表达得到的，或是通过其他方法得到的，其中的Fc片段优选人免疫球蛋白IgG中的Fc区域的片段。本发明的修饰物还包括小分子或是小肽或是其他化合物。在-一个实施方案中，本发明的复合物是小分子或是小肽或是其他化合物修饰的血管抑素或其片段，其特征是该复合物具有同体内其他分子或成分反应或结合的活性，使得该聚合物可以在体内和其他成分形成更大的复合物，其中所述活性是由可以和血液成分的氨基、羟基、巯基反应形成共价键的反应活性基团产生的，优选地所述反应活性基团是马来酰亚胺，它可以和血液成分，例如白蛋白中的巯基反应。在一个优选的实施方案中，本发明的复合物是血管抑素或其片段被糖基化、磷酸化或酰基化的产物，其中修饰的位点是原来蛋白序列中存在的氨基酸残基，或是通过突变产生的氨基酸残基。该复合物没有很大的分子量，但是因为修饰改变了Kl-3的性质，从而延长了其半衰期。本发明的血管抑素或其片段与上述修饰物直接或间接共价相连，直接连接指的是血管抑素或其片段的某一个氨基酸和载体蛋白的某一氨基酸直接相连，可以通过肽键或二硫键。间接相连指的血管抑素或其片段和载体蛋白通过一定的化学基团或几个基团的组合连接。当本发明的血管抑素或其片段与修饰物通过非共价键相互作用时，该复合物具有特定的组成式，其中的修饰物优选地是蛋白、小分子或其他i'七学物质。本发明的另一方面提供一种缓释制剂，它是由血管抑素或其片段，优选片段Kl-3，或上述的任一复合物与生物相容性物质形成的。该组合物中的血管抑素或其片段仍然具有生物活性，但却可以依靠该载体改变药物代谢特征达到延长体内保留时间的目的。所述的缓释制剂包括但不限于微胶囊、水凝胶、微球、微型渗透泵、脂质体等。在本发明的另一方面，提供了一种药物组合物，其由上述复合物或缓释制剂与药学上可接受的载体形成，所述复合物由一种修饰物与血管抑素或其片段，优选血管抑素片段Kl-3形成。本发明使用的药学上可接受的载体包括对于以所用剂量和浓度与其接触的细胞或哺乳动物无毒的药用上可接受的载体、赋形剂、或稳定剂。通常生理学上可接受的载体是含水的pH缓冲溶液。生理学上可接受的载体的例子包括诸如磷酸盐、柠檬酸盐、和其他有机酸在内的缓冲液；包括抗坏血酸在内的抗氧化剂；低分子量(不超过10个残基)多肽；诸如血清白蛋白、明胶、或免疫球蛋白等蛋白质；诸如聚乙烯吡咯烷酮等亲水性多聚体；诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸等氨基酸；单糖、二糖和包括葡萄糖、甘露糖、或糊精等其他糖类；诸如EDTA等螯合剂；诸如甘露醇或山梨醇等糖醇；诸如钠等成盐反离子；和/或诸如TWEEN⑧、聚乙二醇、和PLURONICS⑧等非离子表面活性剂。赋形剂优选无菌且一般不含不良物质。这些组合物可通过常规的灭菌技术进行灭菌。本发明的另一方面还提供一种试剂盒，其包括上述复合物、缓释制剂或药物组合物和使用说明，其中所述复合物由一种修饰物与血管抑素或其片段形成，优选地是聚乙二醇修饰的血管抑素片段Kl-3。本发明还涉及到制备本发明的复合物的方法，所述复合物由一种修饰物与血管抑素或其片段，优选片段Kl-3形成。特别涉及制备聚乙二醇(PEG)修饰的血管抑素或其片段的方法，即将活化的PEG与血管抑素或其片段混合，在适当的溶液、温度、pH、摩尔比条件下反应，并任选地用阳离子柱或分子筛纯化偶联产物。其中反应的:)H优选pH3-10之间，更优选pH5-7之间，聚乙二醇与血管抑素摩尔比为1:1到10:1。本发明还提供一种上述复合物、缓释制剂、药物组合物或试剂盒在预防、诊断或治疗肿瘤中的用途，其中所述复合物由一种修饰物与血管抑素或其片段形成，优选地是聚乙二醇修饰的血管抑素片段Kl-3。本方法适合的癌症包括但不限于肺癌、神经内分泌瘤、结肠癌、骨癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、口腔癌、乳腺癌、前列腺癌、淋巴癌、食道癌、口腔癌、彝咽癌、宫颈癌、肉瘤、肾癌、胆癌、恶性黑色素肿瘤等。本发明还提供一种上述含有血管抑素或其片段，优选K卜3的复合物、药物组合物或缓释制剂在制备抗肿瘤药物中的用途，其中所述药物适于静脉注射、静脉滴注、皮下注射、肌肉注射、腹腔注射、皮下包埋、透皮吸收、肝动脉注射、口服、鼻粘膜给药、口腔粘膜给药、眼部给药、直肠给药、阴道给药或其他临床给药方式，给药时间由每天到每21天给药，优选每天至每周给药。本发明还提供一种上述复合物、缓释制剂、药物组合物或试剂盒在预防、诊断或治疗非肿瘤疾病的药物中的用途，其中所述复合物由一种修饰物与血管抑素或其片段形成，优选地是聚乙二醇修饰的血管抑素片段Kl-3。所述非肿瘤疾病的特征为新生血管异常生成而导致人的组织或器官病变，所述药物适于静脉注射、静脉滴注、皮下注射、肌肉注射、腹腔注射、皮下包埋、透皮吸收、肝动脉注射、口服、鼻粘膜给药、口腔粘膜给药、眼部给药、直肠给药、阴道给药或其他临床给药方式，给药时间由每天到每21天给药，优选每天至每周给药。本发明还提供一种延长血管抑素或其片段，优选延长片段Kl-3半衰期的方法，所述方法包含将修饰物与血管抑素或其片段形成复合物的步骤以及任选地包含制备由上述复合物和生物相容性物质形成的缓释制剂的步骤。实验表明，本发明优选的实施方案中的PEG与K1-3N端偶联的复合物，具有抑制血管内皮细胞迁移和小鼠肿瘤生长的活性，与Kl-3相比，活性明显提高，并且体内药代学研究表明修饰后的Kl-3能有效的减缓Kl-3在体内的代谢，延长体内代谢时间。本发明中提到的血管抑素或其片段，除特殊说明以外，包括野生型的血管抑素或其片段，即体内自然存在的形式或其具有活性的突变体、片段、异构体、衍生物等或它们的组合。血管抑素或其片段的来源可以是但不限于动物细胞表达的，也可以是从酵母或大肠肝菌中发酵纯化而来的。其中来源于动物细胞或酵母细胞表达的人血管抑素片段Kl-3具有如SEQIDNO:l所示的氨基酸序列，或在此序列的N端和/或C端有10个氨基酸以内的增加或缺失的序列；来源于大肠肝菌表达的Kl-3具有SEQIDNO:2的序列，但其N末端的Met在表达后有时会被删除。Kl-3的突变体指的是通过氨基酸的取代、缺失、增加而得到的Kl-3。其片段是指序列属于SEQIDNO:l或SEQIDNO:2的任何更小的部分，可以是但不限于通过酶切得到的，或基因工程表达的，或通过多肽合成的方法得到的。优选地，所述突变体与SEQIDNO:l具有60%氨基酸序列同源性，或是具有70%氨基酸序列同源性，更期望的是具有80%以至90%的同源性，特别是有95%的序列同源性。所述片段是指包含SEQIDNO:l的一部分的序列，例如具有SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5的序列。曾有报道具有SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5的序列的片段具有抑制内皮细胞增殖的活性(CattaneoMGetal.THEJOURNALOFBIOLOGICALCHEMISTRY.Vol.271,No.46,IssueofNovember15,pp.29461—29467,1996)。Kl-3的异构体是指具有和SEQIDNO:l相同的氨基酸序列或分子式，但是却有不同的构象，包括蛋白二级或三级结构的不同或是局部氨基酸旋光性的改变，异构体的来源可以是天然存在的突变或是通过人为设计而得到的。Kl-3的衍生物是指在SEQIDNO:l的基础上进行修饰的产物，其中的修饰是指在蛋白上共价连接一个或多个其他小分子，例如磷酸分子、糖分子等，或是30个氨基酸以内的小肽链，连接位点可以是蛋白内的任意一个氨基酸。Kl-3具有活性的突变体、片段、异构体、衍生物的组合是指同时具有两种或两种以上上述特征变化的产物，但不限于片段的突变体、突变体的修饰产物等。图1:显示人血管抑素片段Kl-3的氨基酸序列SEQIDNO:l。图2:显示大肠杆菌表达的人血管抑素片段Kl-3的氨基酸序列SEQIDNO:2。这里N末端的Met在表达后有时会被删除。图3:显示人血管抑素kl的氨基酸序列SEQIDNO:3。图4:显示人血管抑素k2的氨基酸序列SEQIDNO:4。图5:显示人血管抑素k3的氨基酸序列SEQIDNO:5。图6:显示一种具有活性的N端附加氨基酸的Kl-3的氨基酸序列SEQIDNO:6。N末端的Met在表达后有时会被删除。图7:PEG与具有SEQIDNO:2序列的Kl-3的N端的偶联。反应条件是4。C，10h。反应后溶液用SDS-PAGE检测，泳道.蛋白分子量标准；泳道2:Kl-3;泳道38分别是PEG与Kl-3摩尔比均为5:1，pH分别为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、8.0条件修饰后的Kl-3;泳道9~12分别是pH5.5、20k:DaPEG与Kl-3摩尔比分别为1:1、2:1、5:1、10:l条件修饰后的Kl-3。图8:PEG与具有SEQIDNO:2序列的Kl-3的N端的偶联。反应条件是室温，10h。反应后溶液用SDS-PAGE检测，泳道:l:蛋白分子量标准；泳道2:Kl-3;泳道38分别是PEG与Kl-3摩尔比均为5:1，pH分别为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、8.0条件修饰后的Kl-3;泳道912分别是pH5.5、PEG与Kl-3摩尔比分别为1:1、2:1、5:1、:0:l条件修饰后的Kl-3。图9:PEG与具有SEQIDNO:2序列的Kl-3的N端的偶联。反应前后溶液用SDS-PAGE检测，泳道l:蛋白分子量标准；泳道2:Kl-3;泳道3:PEG修饰的Kl-3。图10:PEG修饰具有SEQIDNO:2序列的Kl-3的N端偶联后，用阳离子柱SP纯化。使用阳离子柱SP吸附蛋白，再用氯化钠梯度溶液洗脱，最后用还原SDS-PAGE检测纯化效果。泳道l:蛋白分子量标准；泳道2:纯化前；泳道3:上样穿透的溶液；泳道4-13:分布收集的洗脱液。图11:PEG与Kl-3N端偶联的产物的体内代谢试验结果。Kl-3:具有SEQIDNO:2序列的Kl-3;PEG-Kl-3:PEG修饰的具有SEQIDNO:2序列的Kl-3。图12:PEG与Kl-3N端偶联的产物抑制人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)迁移的活性。Kl-3:具有SEQIDNO:2序列的Kl-3;PEG-Kl-3:PEG修饰的具有SEQIDNO:2序列的Kl-3。图13:PEG与Kl-3N端偶联的产物抑制人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)损伤的自我修复活性。Kl-3:具有SEQIDNO:2序列的Kl-3;PEG-Kl-3:PEG修饰的具有SEQIDNO:2序列的K1-3。图14:PEG与Kl-3N端偶联的产物抑制人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)增殖的活性。Kl-3:具有SEQIDNO:2序列的Kl-3;PEG-Kl-3:PEG修饰的具有SEQIDNO:2序列的Kl-3。图15:PEG与Kl-3N端偶联的产物抑制人微血管内皮细胞(HMEC)增殖的活性。Kl曙3:具有SEQIDNO:2序列的Kl-3;PEG-Kl-3:PEG修饰的具有SEQIDNO:2序列的Kl-3。图16:PEG与Kl-3N端偶联的产物抑制肿瘤细胞(Hela)增殖的活性。Kl-3:具有SEQIDNO:2序列的Kl-3;PEG-Kl-3:PEG修饰的具有SEQIDNO:2序列的Kl-3。图17:PEG与Kl-3N端偶联的产物抑制小鼠黑色素瘤(B16)的活性。Kl-3-4.5-1:具有SEQIDNO:2序列的Kl-3，4.5mg/kg体重，每天给药；PEG-K1-3-1.5-1:PEG修饰的具有SEQIDNO:2序列的Kl-3，1.5mg/kg体重，每天给药；PEG-Kl-3-4.5-1:PEG修饰的具有SEQIDNO:2序列的Kl-3，4.5mg/kg体重，每天给药；PEG-Kl-3-4.5-3:PEG修饰的具有SEQIDNO:2序列的Kl-3，4.5mg/kg体重，每3天给药；PEG-Kl-3-4.5-6:PEG修饰的具有SEQIDNO:2序列的Kl-3，4.5mg/kg体重，每6天给药。PEG-Kl-3-4.5-9:PEG修饰的具有SEQIDNO:2序列的Kl-3，4.5mg/kg体重，每9天给药。图18:PEG与Kl-3N端偶联的产物抑制小鼠肝癌(H22)的活性。Kl-3-4.5-1:具有SEQIDNO:2序列的Kl-3，4.5mg/kg体重，每天给药PEG-K1-3-1.5-1:PEG修饰的具有SEQIDNO:2序列的Kl-3，1.5mg/kg体重，每天给药；PEG-Kl-3-4.5-hPEG修饰的具有SEQIDNO:2序列的Kl-3，4.5mg/kg体重，每天给药；PEG-Kl-3-4.5-3:PEG修饰的具有SEQIDNO:2序列的Kl-3，4.5mg/kg体重，每周给药2次；PEG-Kl-3-4.5-7:PEG修饰的具有SEQIDNO:2序列的Kl-3，4.5mg/kg体重，每周给药1次。具体实施方式为了进一步说明本发明，提供下述实施例。下述实施例仅是为了说明本发明而非对本发明进行具体限制。本领域技术人员清楚本发明同时还包括对下述实施例所述的技术方案进行任何无需创造性劳动的改变所产生的技术方案。除非特别说明，下述实施例中所用聚乙二醇(PEG)是082MOP01MPEG-BUTYRALD-20K,NETKTAR,Lot#:PT-03G-05。实施例l、不同条件下PEG与Kl-3N端的偶联。本实施例涉及的Kl-3(购自普罗吉公司，中国)是具有SEQIDNO:2序列的Kl-3。将Kl-3透析到pH5.5的30mM醋酸钠(购自北京化学试剂公司，中国)溶液中。用紫外分光光度计(8453，Agilent)在280nm波长下测量蛋白浓度，然后将浓度调节到1mg/ml。Kl-3与特异修饰蛋白N端的PEG偶联。第一种情况，在pH值5.5时，取10ml上述含有Kl-3的透析后的溶液(含蛋白10mg)，按照PEG与Kl-3的摩尔比分别为1:1、2:1、5:1、10:1，加入20kDaPEG固体，并室温搅拌，直到完全溶解，加入还原剂CH3BNNa(Sigma)，浓度为20mM，并最后调节溶液的pH值为5.5。第二种情况，取10ml上述含有Kl-3的透析后的溶液(含蛋白10mg)，按照PEG与Kl-3的摩尔比为5:1，加入PEG固体，室温搅拌，直到完全溶解,加入还原剂CH3BNNa，浓度为20mM，最后调节pH值分别为5.0，5.5,6.0,6.5,7.0，8.0。分别在室温和4i:静置不同时间以后，观察比较Kl-3被单一PEG修饰的情况，即一个PEG与一个Kl-3偶联，偶联的位点是Kl-3N端的a-氨基，少量Kl-3会被非特异性的多位点修饰。这样就可以找出PEG与Kl-3反应的最佳条件。反应前后溶液电泳结果如图7-8所示。实施例2、PEG与K1-3N端的偶联。本实施例涉及的Kl-3是具有SEQIDNO:2序列的Kl-3。将Kl-3透析到pH5.5的30mM醋酸钠溶液中。用紫外分光光度计在280nm波长下测量蛋白浓度，然后将浓度调节到1mg/ml。与特异修饰蛋白N端的PEG偶联时，取20ml上述含有Kl-3的透析后的溶液(含蛋白20mg)，加入PEG固体100mg，并室温搅拌，直到完全溶解，使得PEG与Kl-3的摩尔比为5:1。加入还原剂CH3BNNa,浓度为20mM，并最后调节溶液的pH值为5.5。室温静置6h以后，高于80%的Kl-3被单一PEG修饰，即一个PEG与一个Kl-3分子偶联，并且偶联的位点是Kl-3N端的a-氨基，少量Kl-3会被非特异性的多位点修饰。这时反应液可直接上柱纯化。反应前后溶液电泳结果如图9所示。实施例3、PEG修饰K1-3N端后用阳离子柱SP纯化。本实施例涉及的Kl-3是具有SEQIDNO:2序列的Kl-3。将PEG修饰的Kl-3用SP层析柱(Amersham)纯化。将反应后的混合液调节pH为5。层析柱用含有20mM醋酸钠，pH值为5.0的平衡缓冲液平衡后上样。上样后再用含有20mM醋酸钠，1M氯化钠，pH5.0的洗脱缓冲液梯度洗脱，未反应的聚乙二醇由于带电荷极少，所以在穿透和冲洗的过程中出现，洗脱出峰的顺序为多修饰Kl-3、单修饰Kl-3、Kl-3。根据280nm的紫外检测可以收集不同的分离组分。纯化结果如图IO所示。实施例4、PEG与K1-3N端偶联的产物在血液中的长效效应。本实施例涉及的Kl-3是具有SEQIDNO:2序列的Kl-3。测定K1-3和PEG修饰的Kl-3在Wistar大鼠(维通利华实验动物中心)体内的代谢速率来检验PEG修饰后产物在血液中的长效效益。选用2只200克左右体重的健康大鼠，分别尾静脉注射Kl-3和PEG修饰的K1-3N端偶联产物，4.5mg/kg体重。按照0、5、10、30分钟、1、2、4、8、16、24、36、48、72、96、120、144h的时间间隔眼眶取血。收集血浆，用夹心法ELISA分别测K1-3和PEG修饰的K1-3的浓度。体内药代动力学显示，PEG修饰的Kl-3在大鼠体内的半衰期为81.5h，而Kl-3在大鼠体内的半衰期仅为12.2h，这表明偶联高分子量的PEG能有效的增加Kl-3在体内代谢的半衰期，以达到长效的目的。结果如图ll所示。实施例5、PEG与Kl-3N端偶联的产物抑制人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)迁移的活性。本实施例涉及的Kl-3是具有SEQIDNO:2序列的Kl-3。将HUVEC(普罗吉公司，北京)在含有20。/。胎牛血清(Hyclone)的M199培养液(Hyclone)中培养至对数生长期。然后饥饿12h。之后加入测细胞迁移皿(Millipore,USA)中，每孔细胞数104个。迁移条件为含5%胎牛血清的M199培养液。加药组分别加入Kl-3和PEG修饰的Kl-3，浓度分别为0.004昭/ml、0.04昭/ml、0.4吗/ml、4吗/ml。37°C楚泰8h，用1%戊二醛(北京化工厂，中国)固定细胞，刮掉膜上层的未迁移细胞，用苏木精、伊红(北京化学试剂公司，中国)染色。在显微镜下，取大小相同三个视野，计算细胞数，最后算出抑制率。结果显示在0.04-4ng/ml的范围内，随着给药浓度的增加，对细胞迁移的抑制增强，结果显示具有SEQIDNO:2序列的Kl-3对细胞迁移的抑制率分别为43%、68%、76%，PEG修饰后的Kl-3对细胞迁移的抑制率达到58%、65%、69%。以上结果表明经过PEG修饰的Kl-3保持其原有的生物活性。结果如图12所示。实施例6、PEG与Kl-3N端偶联的产物抑制人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)损伤修复的活性。本实施例涉及的Kl-3是具有SEQIDNO:2序列的Kl-3对HUVEC损伤修复的影响。将HUVEC以2xl()S个/ml的密度接种在12孔板(Coming公司)中，在含20%胎牛血清的M199完全培养液中培养至对数生长期。然后饥饿12h，在孔中轻轻划一十字交叉线,,洗净悬浮细胞。试验设为阴性对照组(PBS)，阳性对照组(Kl-3浓度分别为0.04jxg/ml、0.4pg/ml、4吗/mO，给药组(PEG修饰的Kl-3的浓度分别为0.04吗/ml、0.4吗/ml、4吗/ml)。37。C培养16h，测细胞的迁移量。通过对细胞迁移的抑制来计算其药效。结果显示在0.04-4吗/ml的范围内，随着给药浓度的增加，对细胞迁移的抑制增力口，其抑制率分别为0%、20%、25%;PEG修饰的Kl-3的抑制率分别为35%、40%、105%。结果表明经PEG修饰后的Kl-3不仅保持而且大大加强其生物活性，同时在4吗/ml浓度时，伴随一些细胞的皱缩死亡。结果如图13所示。实施例7、PEG与Kl-3N端偶联的产物抑制人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)增殖的活性。本实施例涉及的Kl-3是具有SEQIDNO:2序列的Kl-3。釆用饥饿过夜的HUVEC，以2xl0"个/ml的密度接种在96孔板(Corning)中，含20%胎牛血清的M199培养液中培养至对数生长期。然后饥饿12h。在按照试验设计加入不同浓度的Kl-3以及PEG修饰的Kl-3。实验设为阴性对照组(PBS)、阳性对照组(Kl-3浓度分别为0.04昭/ml、0.4吗/ml、4吗/ml)、给药组(PEG修饰的Kl-3的浓度分别为0.04|ig/ml、0.4fig/ml、4pg/ml)。37。C培养48h，加入MTT(Amresco公司)，37。C孵育4h，加入DMSO(生工生物工程公司，中国)，酶标仪(Model550,Biorad公司)570nm测其吸收值。结果如图14所示。实施例8、PEG与Kl-3N端偶联的产物抑制人微血管内皮细胞(HMEC)增殖的活性。本实施例涉及的Kl-3是具有SEQIDNO:2序列的Kl-3。采用饥饿过夜HMEC(ATCC弁CRL10636，USA)，以2xl()4个/ml的密度接种在96孔板中，在含10%血清的DMEM中培养至对数生长期。然后饥饿12h。在预先试验设计加入不同浓度的未修饰以及修饰后的Kl-3。实验设阴性对照组(PBS)、阳性对照组(Kl-3浓度分别为0.04吗/ml、0.4(ig/ml、4吗/ml)、给药组(PEG修饰的Kl-3的浓度分别为0.04fxg/ml、0.4lag/ml、4吗/ml)。37。C培养48h，加入MTT，37。C孵育4h，加入DMSO，酶标仪570nm测其吸收值。结果如图15所示。实施例9、PEG与K1-3N端偶联的产物抑制肿瘤细胞(人宫颈癌细胞，Hda)增殖的活性。本实施例涉及的Kl-3是具有SEQIDNO:2序列的Kl-3。以2x104的密度将Hela细胞(ATCC弁CCL-2，USA)接种在96孔板中，在含10。/。血清的DMEM中培养至对数生长期。然后饥饿12h。在按照试验设计加入不同浓度的Kl-3以及PEG修饰的Kl-3。实验设阴性对照组(PBS)、阳性对照组(Kl-3浓度分别为0.4)ag/ml、4|j.g/ml、40ng/ml、150pg/ml)、给药组(PEG修饰的Kl-3的浓度分别为:0.4(xg/ml、4昭/ml、40吗/ml、150吗/ml)。37。C培养48h，力口入MTT，37r孵育4h，加入DMSO，酶标仪570nm测其吸收值。结果显示，PEG修饰后的Kl-3比Kl-3具有更好的抑制肿瘤细胞增殖的活性。实验中还发现，Kl-3和PEG修饰的Kl-3在浓度为40pg/ml时的抑制肿瘤细胞增殖的活性最好，明显的高于150pg/ml以及0.4pg/ml、4pg/ml。实验结果如图16所示。实施例10、PEG与Kl-3N端偶联的产物在小鼠黑色素瘤(B16)模型晚期治疗中的活性。本实施例涉及的Kl-3是具有SEQIDN0:2序列的Kl-3。实验观察了PEG修饰的Kl-3对小鼠B16肿瘤的体内抑制活性。实验材料选用20克体重的C57B/L小鼠(维通利华实验动物中心)，背部接入lxl()S个黑色素瘤细胞(ATCC井CRL-6475TM，USA)。待肿瘤长起分组，每组8只，分别设阴性对照组(20mM醋酸钠溶液)、阳性对照组(Kl-34.5mg/kg体重，每天给药)、给药组(PEG修饰的Kl-31.5mg/kg体重，每天给药；PEG修饰的Kl-34.5mg/kg体重，分别每l、3、6、9天给药)。待肿瘤长至lci^开始分组，分组后即可给药，给药方式为皮下注射。给药周期为IO天，第ll天处死小鼠，称瘤重，以抑瘤率来评价药效。对于具有SEQIDN0:2序列的重组人血管抑素Kl-3，实验结果显示阳性对照组的抑瘤率为45%，给药组1.5mg/kg体重，每天给药组的抑瘤率为28%;4.5mg/kg体重每l、3、6、9天给药组的抑瘤率分别为60%、34%、25%、24%。表明同剂量的PEG修饰的Kl-3，比Kl-3具有体内更高的抑瘤活性;并且较低给药剂量的PEG修饰的Kl-3也具有一定的抑瘤效果。结果如图17所示。实施例11、PEG与Kl-3N端偶联的产物在小鼠肝癌(H22)模型早期治疗中的活性。本实施例涉及的Kl-3是具有SEQIDNO:2序列的Kl-3。实验观察了PEG修饰的Kl-3对小鼠肝癌的体内抑制活性。实验材料选用20克体重的Babl/c小鼠(维通利华实验动物中心)，背部接入lxl06个肝癌细胞。分别设定阴性对照组(20mM醋酸钠溶液)、阳性对照组(Kl-34.5mg/kg体重，每天给药)、给药组(PEG修饰的Kl-31.5mg/kg体重，每天给药；4.5mg/kg体重，分别每天、每周2次、每周1次给药)。接瘤的第2天分组给药。给药方式为皮下注射。给药周期为3周，第22天处死小鼠，称瘤重，以抑瘤率来评价药效。对于具有SEQIDNO:2序列的Kl-3，实验结果显示阳性对照组的抑瘤率为51%，给药组1.5mg/kg体重，每天给药组的抑瘤率为54%;4.5mg/kg体重每天、每周2次、每周1次给药组的抑瘤率分别为60%、84%、50%。表明同剂量的Kl-3，比Kl-3具有体内更高的抑制肝癌生长的活性；并且低剂量修饰的Kl-3组对肝癌生长的抑制率高于高剂量Kl-3组；同时由于PEG修饰的Kl-3在体内代谢速度减慢:，因此在延长给药间隔的情况下，相同剂量的PEG修饰的Kl-3高于Kl-3的生物活性，其中每周给药2次的抑瘤效果最好，达到了80%以上。结果如图18所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>ThrThrProProProSerSerGlyProThrTyrGinCysLeuLysGly165.170175ThrGlyGluAsnTyrArgGlyAsnValAlaValThrValSerGlyHis180185190ThrCysGinHisTrpSerAlaGinThrProHisThrHisAsnArgTh]:195200205ProGluAsnPheProCysLysAsnLeuAspGluAsnTyrCysArgAsn210215220ProAspGlyLysArgAlaProTrpCysHisThrThrAsnSerGinVal225230235240ArgTrpGluTyrCysLyslieProSerCys245250<210>2<211>260<212>PRT<213>Homosapiens<400>2MetValTyrLeuSerGluCysLysThrGlyAsnGlyLysAsnTyrArg151015GlyThrMetSerLysThrLysAsnGlylieThrCysGinLysTrpSer202530SerThrSerProHisArgProArgPheSerProAlaThrHisProSer354045GluGlyLeuGluGluAsnTyrCysArgAsnProAspAsnAspProGin505560GlyProTrpCysTyrThrThrAspProGluLysArgTyrAspTyrCys65707580AsplieLeuGluCysGluGluGluCysMetHisCysSerGlyGluAsn859095TyrAspGlyLyslieSerLysThrMetSerGlyLeuGluCysGinAla100105110TrpAspSerGinSerProHisAlaHisGlyTyrlieProSerLysPhe115120125ProAsnLysAsnLeuLysLysAsnTyrCysArgAsnProAspArgGlu130135140LeuArgProTrpCysPheThrThrAspProAsnLysArgTrpGluLeu145150155160CysAsplieProArgCysThrThrProProProSerSerGlyProThr165170175TyrGinCysLeuLysGlyThrGlyGluAsnTyrArgGlyAsnValAla180185190ValThrValSerGlyHisThrCysGinHisTrpSerAlaGinThrPro195200205HisThrHisAsnArgThrProGluAsnPheProCysLysAsnLeuAsp210215220GluAsnTyrCysArgAsnProAspGlyLysArgAlaProTrpCysHis225230235240ThrThrAsnSerGinValArgTrpGluTyrCysLyslieProSerCys245250255AspSerSerPro260<210>3<211>79<212>PRT<213>Homosapiens<400>3CysLysThrGlyAsnGlyLysAsnTyrArgGlyThrMetSerLysThr151015LysAsnGlylieThrCysGinLysTrpSerSerThrSerProHisArg202530ProArgPheSerProAlaThrHisProSerGluGlyLeuGluGluAsn354045TyrCysArgAsnProAspAsnAspProGinGlyProTrpCysTyrThr505560ThrAspProGluLysArgTyrAspTyrCysAsplieLeuGluCys657075<210>4<211>78<212>PRT<213>Hoiaosapiens<400>4CysMetHisCysSerGlyGluAsnTyrAspGlyLyslieSerLysThr151015MetSerGlyLeuGluCysGinAlaTrpAspSerGinSerProHisAla202530HisGlyTyrlieProSerLysPheProAsnLysAsnLeuLysLysAsn354045TyrCysArgAsnProAspArgGluLeuArgProTrpCysPheThrThr505560AspProAsnLysArgTrpGluLeuCysAsplieProArgCys657075<210>5<211>78<212>PRT<213>Homosapiens<400>5CysLeuLysGlyThrGlyGluAsnTyrArgGlyAsnValAlaValThr151015ValSerGlyHisThrCysGinHisTrpSerAlaGinThrProHisThr202530HisAsnArgThrProGluAsnPheProCysLysAsnLeuAspGluAsn354045TyrCysArgAsnProAspGlyLysArgAlaProTrpCysHisThrThr50556065<210><211><212><213>70756266PRTHomosapiens<400>6MetHisHisHisHisHisHisValTyrLeuSerGluCysLysThrGly151015AsnGlyLysAsnTyrArgGlyThrMetSerLysThrLysAsnGlylie202530ThrCysGinLysTrpSerSerThrSerProHisArgProArgPheSer354045ProAlaThrHisProSerGluGlyLeuGluGluAsnTyrCysArgAsn505560ProAspAsnAspProGinGlyProTrpCysTyrThrThrAspProGlu65707580LysArgTyrAspTyrCysAsplieLeuGluCysGluGluGluCysMet859095HisCysSerGlyGluAsnTyrAspGlyLyslieSerLysThrMetSer100105110GlyLeuGluCysGinAlaTrpAspSerGinSerProHisAlaHisGly115120125TyrlieProSerLysPheProAsnLysAsnLeuLysLysAsnTyrCys130135140ArgAsnProAspArgGluLeuArgProTrpCysPheThrThrAspPro145150155160AsnLysArgTrpGluLeuCysAsplieProArgCysThrThrProPro165170175ProSerSerGlyProThrTyrGinCys!LeuLysGlyThrGlyGluAsn180185190TyrArgGlyAsnValAlaValThrValSerGlyHisThrCysGinHis195200205TrpSerAlaGinThrProHisThrHisAsnArgThrProGluAsnPhe210215220ProCysLysAsnLeuAspGluAsnTyrCysArgAsnProAspGlyLys22523023524CArgAlaProTrpCysHisThrThrAsnSerGinValArgTrpGluTyr245250255CysLyslieProSerCysAspSerSerPro260265<210>7<211>715<212>PRT<213i>Homosapiens<彻>7MetProSerThrSerPheProValProSerLysPheProLeuGlyPro151015AlaAlaAlaValPheGlyArgGlyGluThrLeuGlyProAlaProArg202530AlaGlyGlyThrLysSerAlaGluGluGluHisTyrGlyTyrAlaSer354045SerAsnValSerProAlaLeuProLeuProThrAlaHisSerThrLeu505560ProAlaProCysHisAsnLeuGinThrSerThrProGly工leliePro65707580ProAlaAspHisProSerGlyTyrGlyAlaAlaLeuAspGlyGlyPro859095AlaGlyTyrPheLeuSerSerGlyHisThrArgProAspGlyAlaPro100105110AlaLeuGluSerProArglieGlulieThrSerCysLeuGlyLeuTyr115120125HisAsnAsnAsnGinPhePheHisAspValGluValGlu.AspValLeu130135140ProSerSerLysArgSerProSerThrAlaThrLeuSerLeuProSer145150155160LeuGluAlaTyrArgAspProSerCysLeuSerProAlaSerSerLeu165170175SerSerArgSerCysAsnSerGluAlaSerSerTyrGluSerAsnTyr180185190SerTyrProTyrAlaSerProGinThrSerProTrpGinSerProCys195200205ValSerProLysThrThrAspProGluGluGlyPheProArgGlyLeu210215220GlyAlaCysThrLeuLeuGlySerProArgHisSerProSerThrSer225230235240ProArgAlaSerValThrGluGluSerTrpLeuGlyAlaArgSerSer245250255ArgProAlaSerProCysAsnLysArgLysTyrSerLeuAsnGlyArg260265270GinProProTyrSerProHisHisSerProThrProSerProHisGly275280285SerProArgValSerValThrAspAspSerTrpLeuGlyAsnThrThr290295300GinTyrThrSerSerAlalieValAlaAlalieAsnAlaLeuThrThr305310315320AspSerSerLeuAspLeuGlyAspGlyValProValLysSerArgLys325330335ThrThrLeuGluGinProProSerValAlaLeuLysValGluProVal340345350GlyGluAspLeuGlySerProProProProAlaAspPheAlaProGlu355360365AspTyrSerSerPheGinHislieArgLysGlyGlyPheCysAspGin370375380LeuSerProThrSerTyrMetSerProThrLeuProAlaLeuAspTrp405410415GinLeuProSerHisSerGlyProTyrGluLeuArglieGluValGin420425430ProLysSerHisHisArgAlaHisTyrGluThrGluGlySerArgGly435440445AlaValLysAlaSerAlaGlyGlyHisProlieValGinLeuHisGly450455460TyrLeuGluAsnGluProLeuMetLeuGinLeuPhelieGlyThrAla465470475480AspAspArgLeuLeuArgProHisAlaPheTyrGinValHisArglie485490495ThrGlyLysThrValSerThrThrSerHisGluAlalieLeuSerAsn500505510ThrLysValLeuGlulieProLeuLeuProGluAsnSerMetArgAla515520525VallieAspCysAlaGlylieLeuLysLeuArgAsnSerAsplieGlu530535540LeuArgLysGlyGluThrAsplieGlyArgLysAsnThrArgValArg545550555560LeuValPheArgValHisValProGinProSerGlyArgThrLeuSer565570575LeuGinValAlaSerAsnProlieGluCysSerGinArgSerAlaGin580585590GluLeuProLeuValGluLysGinSerThrAspSerTyrProValVal595600605LeuAlaValProGinHisProTyrGinTrpAlaLysProLysPro390395400r5y8T3GlyGlyLysJLysMetValLeuSerGlyHisAsnPheLeuGinAspSer610615620LysValliePheValGluLysAlaProAspGlyHisHisValTrpGlu625630635640MetGluAlaLysThrAspArgAspLeuCysLysProAsnSerLeuVal645650655ValGlulieProProPheArgAsnGinArglieThrSerProValHis660665670ValSerPheTyrValCysAsnGlyLysArgLysArgSerGinTyrGin675680685ArgPheThrTyrLeuProAlaAsnGlyAsnAlaliePheLeuThrVal690695700SerArgGluHisGluArgValGlyCysPhePhe70571071权利要求1.一种修饰物与血管抑素片段K1-3形成的复合物，所述复合物具有比未修饰的血管抑素片段K1-3更长的体内半衰期，所述修饰物选自聚乙二醇或其他高分子聚合物、蛋白质分子或其片段、肽链、小分子或其他任何形式的化学物质。2.权利要求l的复合物，其中所述血管抑素片段Kl-3是人、鼠或其他哺乳动物来源的血纤溶酶原片段Kl-3或其具有活性的片段、突变体、衍生物、异构体或是它们的组合。3.权利要求2的复合物，其中所述血管抑素片段Kl-3是具有SEQIDNO:l所示序列的人血管抑素片段Kl-3或其具有活性的片段、突变体、衍生物、异构体或是它们的组合。4.权利要求1的复合物，其中所述血管抑素片段Kl-3是重组血管抑素片段Kl-3。5.权利要求4的复合物，其中所述重组血管抑素片段Kl-3是具有SEQIDNO:2所示序列的重组人血管抑素片段Kl-3或其具有活性的片段、突变体、衍生物、异构体或是它们的组合。6.权利要求5的复合物，其中所述重组人血管抑素片段Kl-3由大肠肝菌表达，其中N末端的Met在大肠肝菌表达时任选地被删除。7.权利要求l-6任一项的复合物，所述修饰物与血管抑素片段Kl-3通过共价键连接。8.权利要求1的复合物，所述修饰物是聚乙二醇。9.权利要求8的复合物，所述聚乙二醇是单甲基聚乙二醇。10.权利要求8的复合物，其中所述聚乙二醇是线性的或是分叉的。11.权利要求8-10的复合物，其中所述聚乙二醇分子量位于1,000到100，000道尔顿之间，优选分子量为20kDa的单甲基聚乙二醇。12.权利要求8-10任一项的复合物，其特征为一个血管抑素片段Kl-3与一个或多个聚乙二醇分子偶联，偶联的位点是血管抑素的N端a-氨基、赖氨酸残基侧链的s-氨基、半胱氨酸残基侧链的巯基、天冬氨酸残基侧链的羧基、谷氨酸残基侧链的羧基中的一种或其组13.权利要求12的复合物，其特征为一个血管抑素片段Kl-3与一个或多个聚乙二醇分子偶联，偶联的位点是血管抑素片段Kl-3的N端a-氨基或SEQIDNO:l所示序列第2、7、、17、24、69、94、97、121、125、128、129、150、175、215、228、246位的赖氨酸残基侧链上的s-氨基或其组合。14.权利要求12的复合物，其特征为一个血管抑素片段Kl-3与一个聚乙二醇分子偶联，偶联位点为血管抑素片段Kl-3N端的a-氨基。15.权利要求14的复合物，其特征为一个具有SEQIDNO:2的重组人血管抑素分子的片段Kl-3与一个聚乙二醇分子偶联，偶联位点为血管抑素片段K1-3N端的a-氨基。16.权利要求15的复合物，其特征为一个具有SEQIDNO:2的重组人血管抑素分子的片段Kl-3与一个20kDa单甲基聚乙二醇分子偶联，偶联位点为血管抑素片段K1-3N端的a-氨基。17.权利要求12的复合物，其特征为一个血管抑素片段Kl-3与一个或多个聚乙二醇分子偶联，偶联的位点是血管抑素天冬氨酸或谷氨酸残基侧链上的羧基。18.权利要求8-11任一项的复合物，其特征为一个血管抑素片段Kl-3与一个或多个聚乙二醇分子偶联，偶联方法为在血管抑素片段Kl-3分子内部或其N末端或C末端附加半胱氨酸或是含有半胱氨酸的肽链，使得偶联位点为附加的半胱氨酸残基侧链上的巯基。19.权利要求1-18任一项的复合物与生物相容性物质形成的缓释制剂。20.权利要求19的缓释制剂，所述的缓释制剂选自微胶囊、水凝胶、微球、微型渗透泵或脂质体。21.—种药物组合物，其包含权利要求1-20中任一项的复合物或缓释制剂和药学上可接受的载体。22.—种试剂盒，其包含权利要求1-21的复合物、缓释制剂或药物组合物和使用说明。23.制备权利要求8-18任一项的复合物的方法，其特征是在足以使活化的聚乙二醇与血管抑素片段Kl-3发生反应的溶液、温度、pH、摩尔比的条件下将活化的聚乙二醇与血管抑素片段Kl-3混合。24.权利要求23的方法，其中pH为5-7，聚乙二醇与血管抑素片段Kl-3摩尔比为1:1至U10:1。25.权利要求24的方法，进一步包括将偶联产物用阳离子柱纯化。26.权利要求1-21的复合物、缓释制剂或药物组合物在制备抗肿瘤药物中的用途。27.权利要求26的用途，所述肿瘤选自肺癌、神经内分泌瘤、结肠癌、骨癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、口腔癌、乳腺癌、前列腺癌、淋巴癌、食道癌、口腔癌、鼻咽癌、宫颈癌、肉瘤、肾癌、胆癌、恶性黑色素肿瘤或其他肿瘤。28.权利要求1-21的复合物、缓释制剂或药物组合物在制备治疗非肿瘤疾病的药物中的用途，所述疾病的特征为新生血管异常生成而导致人的组织或器官病变。29.权利要求26-28的用途，其中所述药物适于静脉注射、静脉滴注、皮下注射、肌肉注射、腹腔注射、皮下包埋、透皮吸收、肝动脉注射、口服、鼻粘膜给药、口腔粘膜给药、眼部给药、直肠给药、阴道给药或其他临床给药方式。30.—种延长血管抑素片段Kl-3半衰期的方法，所述方法包含将修饰物与血管抑素片段Kl-3形成复合物的步骤，所述修饰物选自聚乙二醇或其他高分子聚合物、蛋白质分子或其片段、肽链、小分子或其他任何形式的化学物质。31.—种延长血管抑素片段Kl-3半衰期的方法，所述方法包含将血管抑素片段Kl-3或由一种修饰物与血管抑素片段Kl-3形成的复合物与生物相容性物质形成缓释制剂的步骤，所述修饰物选自聚乙二醇或其他高分子聚合物、蛋白质分子或其片段、肽链、小分子或其他任何形式的化学物质。全文摘要本发明公开了一种抗肿瘤或抗新生血管生成疾病的药物及含有这种药物的药物组合物及试剂盒，同时也公开了制备这种抗肿瘤或抗新生血管生成疾病药物的方法。本发明中的抗肿瘤或抗新生血管生成疾病的药物包含一种修饰物与血管抑素或其片段形成的复合物，所述复合物具有比无修饰物的血管抑素或其片段更长的体内半衰期，所述修饰物选自高分子聚合物、蛋白质分子或其片段、肽链、小分子或其他任何形式的化学物质。文档编号A61K47/48GK101219219SQ200710004558公开日2008年7月16日申请日期2007年1月10日优先权日2007年1月10日发明者常国栋,杨恕玲,罗永章,磊高申请人:北京普罗吉生物科技发展有限公司