专利名称：一种放射性铼标记人纤溶酶原kringle5蛋白及其制备方法
一种放射性铼标记人纤溶酶原kr ingle 5蛋白及其制备方
法
技术领域：
本发明涉及生物医药技术领域，更具体地讲，涉及一种放射性标记蛋白及其制备方法以及该放射性标记蛋白的应用。
背景技术：
目前国际上以肿瘤血管为靶点的药物已有多种，许多已进入临床试验或者被批准临床应用。如Endostatin(内皮抑素)已于2005年被FDA批准进入临床；Angiostatin(血管抑素)也已进入临床试验I期。Cao 等已发现重组人纤溶酶原 Kringle 5 (Recombinant HumanPlasminogen Kringle5, rhk5)作为肿瘤血管生成抑制剂，活性等各方面优于上述药物，具有潜在的应用价值。核素标记血管生成抑制剂可通过β射线达到增强肿瘤靶向治疗的效果，降低肿瘤血管生成抑制剂的用量，降低成本。目前国外已有类似研究，如Yang等使用99mTc标记 Endostatin的实验研究显示肿瘤可以清晰显像；Lee等使用123I标记的Agiostatin取得了同样的效果。目前尚未见采用具有优良理化性质的放射性核素188Re标记具有更强肿瘤血管抑制作用的rhk5的研究、特别是治疗的研究报道。Endostatin及Angiostatin等若要达到治疗效果需持续给药，且费用昂贵。99mTc标记Endostatin的实验研究显示肿瘤可以清晰显像，但不能用于治疗；Lee等使用123I标记的Agiostatin取得了同样的效果，但标记不稳定。 核素直接标记蛋白常会造成蛋白活性的损伤。
发明内容本发明的第一个目的是提供一种高效的抗肿瘤药物188Re-rhk5，即核素188Re标记的重组入纤溶酶原Kringle 5蛋白。本发明的第二个目的是提供188Re-rhk5的制备方法。本发明的第三个目的是提供188Re-rhk5在抑制肿瘤生长中的应用。为实现上述目的，本发明公开以下技术方案一种核素标记rhk5蛋白，其特征在于，所述核素为188Re。188Re-rhk5的制备方法，包括步骤(1)和步骤(2)步骤(l)rhk5蛋白的表达，形成羧基端连接6XHis -Tag的融合蛋白，可以优选通过下述两种方式获得将Kringle 5基因片段构建入原核表达载体质粒pET_22b (+)—氨基端加入信号肽序列一羧基端加入6 XHis序列一当pET-22b (+) _k5在BL21-CodonPlus感受态菌被诱导后，在rhk5氨基端表达信号肽段，并在氧化环境下形成二硫键，同时切除信号肽，形成羧基端连接6 X Hi s · Tag的融合蛋白。
或者，将Kringle 5基因片段构建入真核表达载体质粒pFastbacl —羧基端加入 6XHis序列一当pFaStbacl-rhk5在27°C培养的昆虫sf9细胞内孵育后，以可溶性方式表达rhk5蛋白，并在氧化环境下形成二硫键，形成羧基端连接6XHis · Tag的融合蛋白。步骤(2)三羰基铼标记rhk5的核心步骤1)取5mg BH3 · NH3放入干燥西林瓶中，加盖密封，通CO气体约20min。2)在lmL188Re04_的生理盐水淋洗液中，力口入7 μ L浓Η3Ρ04。3)混勻后注射到已通好CO的西林瓶中，70°C水浴加热15min。4)测定反应后生成的中间体fac-[188Re[(CO)3(H2O)3]+的螯合率。5)三羰基铼标记rhk5，优化后的标记条件为rhk520 μ g，加入0. lmL188Re04"淋洗液，调节溶液的PH值为5. 0，充分混勻后，置50°C水浴中温育lh。步骤⑵中测定反应后生成的中间体faC-[188Re[(C0)3(H20)3] +的螯合率，以GF254 硅胶薄板为固定相，V(甲醇)V(浓盐酸)=99 1为流动相，在放射性薄层扫描仪上进行测定。步骤(2)中使用磷酸缓冲液调节溶液的pH值为5. 0。荷瘤裸鼠体内生物分布研究表明肿瘤组织的188Re-rhk5摄取随时间延长逐渐增高，在2h时最高；rhk5能在新生血管密集部位积聚，用放射性核素标记rhk5进行肿瘤显像是可行的；初步治疗实验显示单次瘤内注射37MBq188Re-rhk5，对肿瘤及肿瘤血管有放射治疗作用，18天后抑瘤率达37.2%。本发明的积极效果(1)三羰基铼标记法采用组氨酸作为双功能螯合剂，间接标记rhk5，不与二硫键作用，保留了 rhk5蛋白活性；(2)核素188Re标记rhk5，通过核素的β 射线及交叉火力作用，不但增强抗肿瘤血管生成作用、减少了药物用量，而且弥补了靶向性之不足；(3)188Re_rhk5在使用β射线治疗的同时可以用其发射的Y射线来进行显像，监测治疗效果。
图1中间体fac- [188Re (CO) 3 (H2O) 3] +的合成并用放射薄板层析法(RTLC)鉴定；图2纯化前标记产物在9g/L生理盐水展开体系中RTLC分析结果；图3纯化后标记产物在9g/L生理盐水展开体系中RTLC分析结果；图4纯化后标记产物在乙醇氨水(2 1 5V/V/V)展开体系中RTLC分析结果；图5188Re_rhk5在肺癌移植瘤裸鼠体内的组织分布(η = 3)；图6188Re-rhk5在肺癌移植瘤裸鼠体内阻断前后的组织学分布(2h) (η = 3)；图7 :188Re_rhk5在肺癌移植瘤裸鼠体内的显像图A，B分别为各时间点的显像图； A，0. 5h ；B，2h ；箭头所指部位为肿瘤；图8188Re-rhk5 治疗后肿瘤生长抑制曲线188Re_rhk5 (37MBq)、188Re (37MBq)、 rhk5(15mg/kg)和0.9%生理盐水治疗后18天内肿瘤大小的改变，每组6只，*代表P < 0. 05，**代表P < 0. 01 (188Re-rhk5治疗组与其余各组比较)。
具体实施方式
以下结合附图对本发明做详细说明。制备实施例1(l)rhk5蛋白的表达将Kringle 5基因片段构建入原核表达载体质粒 pET-22b(+)—氨基端加入信号肽序列一羧基端加入6XHi s序列一当pET-22b(+)-k5在 BL21-CodonPlus感受态菌被诱导后，可以在rhk5氨基端表达信号肽段，通过信号肽可以将蛋白产物分泌到大肠杆菌内、外膜间的外周质，并在氧化环境下形成二硫键，形成具有功能的可溶性融合蛋白，同时切除信号肽，使其接近天然蛋白。羧基端连接6XHis -Tag的融合蛋白，利用His -Tag不但可用来进行镍柱纯化，而且为蛋白质的western blot鉴定及后续的核素三羰基铼间接法标记rhk5奠定了基础。(2)三羰基铼标记rhk5 取5mg BH3 -NH3放入干燥西林瓶中，加盖密封，通CO气体约20min —在lmL188Re04_的生理盐水淋洗液中，加入7 μ L浓H3PO4 —混勻后注射到已通好CO 的西林瓶中，70°C水浴加热15min—采用放射薄板层析法(RTLC)测定反应后生成的中间体 faC-[188Re[(C0)3(H20)3]+的螯合率，以GF254硅胶薄板为固定相，V(甲醇)V(浓盐酸)= 99 1为流动相，在放射性薄层扫描仪上进行测定。如图1所示，放射薄板层析法鉴定显示， 中间体fac-[188Re (CO) 3 (H2O) 3]+合成后纯度很高(前面的峰)，几乎无杂质，可直接用来进行下一步实验。一采用正交实验得出优化后的标记条件rhk520y g，加入0. lmL188Re04_淋洗液(37_370MBq)，用磷酸缓冲液调节溶液的pH值为5. 0，充分混勻后，置50°C水浴中温育 lh。标记产物经RTLC分析结果如图1所示，标记率可达65%以上，放射化学纯度可达95% 以上，如图3、图4所示。制备实施例2(l)rhk5蛋白的表达将Kringle 5基因片段构建入真核表达载体质粒 pFastbacl —羧基端加入6XHis序列一当pFastbacl_rhk5在27°C培养的昆虫sf9细胞内孵育后，可以以可溶性方式表达rhk5蛋白，并在氧化环境下形成二硫键，形成具有功能的可溶性融合蛋白，羧基端连接6XHis · Tag的融合蛋白，利用His · Tag不但可用来进行镍柱纯化，而且为蛋白质的western blot鉴定及后续的核素三羰基铼间接法标记rhk5奠定了基础。真核表达的rhk5蛋白活性较高，但是产量较低。大规模制备时还是选用原核表达的方法更适合。(2)三羰基铼标记rhk5的方法同实施例1。应用实施例1荷瘤裸鼠体内生物分布研究表明肿瘤组织的188Re-rhk5摄取随时间延长逐渐增高，在2h时最高；rhk5能在新生血管密集部位积聚，用放射性核素标记rhk5进行肿瘤显像是可行的；初步治疗实验显示单次瘤内注射37MBq188Re-rhk5，对肿瘤及肿瘤血管有放射治疗作用，18天后抑瘤率达37.2%。188Re_rhk5经单剂量静脉注射后，如图2所示，188Re-rhk5在血中清除较快。肾脏与其他器官组织相比，在不同时间段有明显的高放射性摄取，是由于标记物主要通过泌尿系统排泄所致。其余脏器放射性摄取相对较低，随时间延长而摄取逐渐减低。肿瘤组织有相对高的摄取，且与其它脏器相反，在0-2h内，随时间延长而摄取逐渐增高，在肿瘤内滞留时间较长。随后的特异性阻断实验中于188Re_rhk5显像前30min静脉注射IOOyg rhk5，在注射后2h处死裸鼠，各脏器的分布测定结果如图3所示肿瘤部位的188Re-rhk5摄取下降。证实了 188Re_rhk5与肿瘤结合的特异性。其余脏器分布在阻断前后未见明显变化。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
权利要求
1.一种核素标记rhk5蛋白，其特征在于，所述核素为188Re。
2.如权利要求1所述的188Re_rhk5的制备方法，其特征在于，包括如下步骤(1)rhk5蛋白的表达，形成羧基端连接6XHis· Tag的融合蛋白；(2)三羰基铼标记rhk51)取5mgBH3 · NH3放入干燥西林瓶中，加盖密封，通CO气体约20min ；2)在ImL188ReO4-的生理盐水淋洗液中，力Π入7μ L浓H3PO4 ；3)混勻后注射到已通好CO的西林瓶中，70°C水浴加热15min；4)测定反应后生成的中间体fac_[188Re [ (CO) 3 (H2O) 3] +的螯合率；5)三羰基铼标记rhk5，优化后的标记条件为rhk520yg，加入0. lmL188Re04_淋洗液，调节溶液的PH值为5. 0，充分混勻后，置50°C水浴中温育lh。
3.根据权利要求2所述的188Re-rhk5的制备方法，其特征在于，步骤(l)rhk5蛋白的表达包括如下步骤将Kringle 5基因片段构建入原核表达载体质粒pET_22b (+)—氨基端加入信号肽序列一羧基端加入6XHis序列一当pET-22b (+)_k5在BL21-CodonPlus感受态菌被诱导后， 在rhk5氨基端表达信号肽段，并在氧化环境下形成二硫键，同时切除信号肽，形成羧基端连接6XHis · Tag的融合蛋白。
4.根据权利要求2所述的188Re-rhk5的制备方法，其特征在于，步骤(l)rhk5蛋白的表达包括如下步骤将Kringle 5基因片段构建入真核表达载体质粒pFastbacl —羧基端加入6XHis序列一当pFaStbacl-rhk5在27°C培养的昆虫sf9细胞内孵育后，以可溶性方式表达rhk5蛋白，并在氧化环境下形成二硫键，形成羧基端连接6 X His · Tag的融合蛋白。
5.根据权利要求2所述的188Re-rhk5的制备方法，其特征在于，步骤(2)中测定反应后生成的中间体fac-[188Re[(C0)3(H20)3]+的螯合率，以GF254硅胶薄板为固定相，V甲醇V浓 asg= 99 1为流动相，在放射性薄层扫描仪上进行测定。
6.根据权利要求2所述的188Re-rhk5的制备方法，其特征在于，步骤(2)中使用磷酸缓冲液调节溶液的PH值为5.0。
7.如权利要求1所述的188Re_rhk5在抑制肿瘤生长中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种188Re-rhk5蛋白及其制备方法，三羰基铼标记法采用组氨酸作为双功能螯合剂，间接标记rhk5，不与二硫键作用，保留了rhk5蛋白活性。核素188Re标记rhk5，通过核素的β射线及交叉火力作用，不但增强抗肿瘤血管生成作用、减少了药物用量，而且弥补了靶向性的不足。
文档编号A61P35/00GK102268423SQ20101019305
公开日2011年12月7日 申请日期2010年6月4日 优先权日2010年6月4日
发明者张岚, 曹本红, 李彪 申请人:上海交通大学医学院附属瑞金医院, 上海原子科兴药业有限公司, 中国科学院上海应用物理研究所