miR-199a及其抑制剂的应用的制作方法

专利名称：miR-199a及其抑制剂的应用的制作方法
miR-199a及其抑制剂的应用
技术领域：
本发明涉及生物技术microRNA的研究领域，更具体地讲，涉及miR_199a及其抑制物在心脏疾病中的应用。
背景技术：
心脏病是心脏疾病的总称，包括风湿性心脏病、先天性心脏病、高血压性心脏病、 冠心病、心肌疾病等各种心脏病。心脏病是目前危害人类健康的主要疾病之一。心脏在受到各种生理刺激，组织损伤或者内分泌失调的情况下会产生肥厚性生长以维持心脏血输出量。在体内，引发心肌肥厚的信号种类繁多，包括超负荷的机械牵拉力， 血流动力学压力，以及神经活动，激素分泌等。通过模拟这些诱发因素，可以人为的建立实验动物的心肌肥厚模型。例如通过主动脉缩窄方法建立整体压力超负荷肥厚模型、α-肾上腺素能受体激动剂诱发的心肌细胞肥大模型。在以往的研究中，通过这些模型，人们检测出了对心肌肥厚具有正性激活或负性抑制的一系列重要因子，绘制与心肌肥厚相关的信号途径。MicroRNA是近年来在果蝇、线虫、小鼠和人等多种生命体中被发现的一类具有转录后调节活性的小分子RNA。这一内源性的小分子RNA的大量发现得益于两种技术，一种是 microRNA cDNA文库的构建和测序技术；另一种是生物素标记的寡核苷酸探针捕获，通过接头引物进行PCR扩增的技术。通过文库的构建和测序，人们掌握了 microRNA的大量序列信息，通过对这些序列进行生物信息学比对分析，人们发现大部分microRNA在物种间高度保守，在进化上高度同源。关于microRNAs的基因组定位，早期普遍认为其位于基因间区域，但近几年研究发现大部分microRNAs位于基因的内含子中，随宿主基因的转录而转录，与宿主基因具有相似的表达谱；另一部分聚簇存在的microRNAs，能够单独转录，其表达水平受到多种因素的调节。例如miR-l的表达受到血清反应因子(SRF)和MEF调控。这些microRNAs基因的转录产物须经过多步剪切加工才能形成成熟的microRNAs，进而发挥其生物学功能。首先， microRNAs基因经RNA聚合酶II转录，形成Pri_microRNA，再经Drosha剪切，形成了具有发卡结构的Pre-microRNA ；Exportin 5将其从胞核转运至胞浆后，经Dicer酶剪切，成双链 microRNA分子；最后，双链分离，一条被降解，另一条成为成熟microRNAs，并与其它分子一起形成了 RNA诱导的沉默复合体(RISC)。RISC通过与mRNA的3'端非编码区相互作用，引起mRNA的降解或者翻译过程的抑制，从而在转录后水平负性调节蛋白质表达。生物信息学分析发现一个microRNA可能直接调控上百个基因的表达，进而调控了许多重要的细胞途径和生理病理过程。例如=MicroRNAs能够调控细胞的分裂、分化、增殖和凋亡；胚胎的发育，机体的能量代谢、激素分泌和造血功能以及应对压力胁迫等生理过程；肿瘤发生和心肌肥厚等病理过程。在心血管系统中，microRNAs参与了心脏和血管的疾病发生过程。MicroRNAs表达的紊乱，参与多种心血管疾病的发生过程，在心脏方面， William等将67个病人分为典型的四组疾病状态缺血性心肌病、扩张型心肌病、主动脉缩窄和非心衰病人，然后对他们的心肌组织进行全基因组microRNA表达检测，发现多种 microRNAs的表达水平在各种人类心脏疾病中均发生了显著性改变。对于microRNAs作用机制的探讨，目前认为其通过负性蛋白的表达而参与各种生命活动过程。Zhao等研究发现，miR-1在心脏发育早期的过表达，将促进心肌细胞分化，引起心脏发育停止，心室壁变薄；相反，miR-1的基因敲除小鼠中则出现心室壁变厚，室间隔缺损；进一步研究表明这一效应主要是通过miR-1抑制Hand2的蛋白表达实现的。MicroRNAs在心肌肥厚中的功能研究有助于我们更好的理解其发病机理，进一步找到心肌疾病相关的药物靶点，从而为这类疾病的预防或治疗提供行之有效的途径。

发明内容本发明的第一个目的在于提供miR-199a及其类似物在制备治疗心肌缺血损伤药物中的应用，所述类似物是指能够生成类似于miR-199a序列的重组质粒或病毒载体或者是化学合成的类似miR-199a的序列；所述miR-199a 序列为CCCAGUGUUCAGACUACCUGUUC。本发明第二个目的在于提供miR-199a抑制剂在制备治疗抑制心肌细胞肥大及慢性心衰药物中的应用，所述miR-199a抑制剂是指能够生成类似于miR-199a反义互补序列的重组质粒或病毒载体或者是化学合成的类似miR-199a反义序列的RNA或DNA ；所述miR-199a 反义互补序列为GAACAGGTAGTCTGAACACTGGG。本发明第三个目的在于提供一种筛选预防或治疗心脏疾病的潜在物质的方法，包括如下步骤(1)用候选物质处理表达miR-199a的体系；(2)检测所述体系中miR_199a的表达或活性；若所述候选物质可增强或降低miR-199a的表达或活性，则表明该候选物质是预防或治疗心脏疾病的潜在物质。microRNA-199a(miR-199a)为一种本领域已知的 microRNA(miRNA)小分子，其对于调控RNA是有用的。然而，现有技术中对于miR-199a生物学功能目前并不清楚。miR-199a具有如CCCAGUGUUCAGACUACCUGUUC所示的序列。其可以来自被分离细胞，或者可通过人工合成的方式获得。在得知了 miR-199a的序列后，本领域人员可以方便地制备获得mi R_199a或其抑制物。MiR_199a 的用途MiRNA参与心肌肥厚的多个方面包括心肌增殖，电传导和纤维化等。然而， miR-199a是否参与心肌肥厚过程仍未见报道。通过定量PCR检测发现miR-1、miR-133、 miR-499、miR-214、miR-24、miR-21和miR-199a等在心肌肥厚和慢性心衰中表达异常。通过 Northern blot的方法，本发明人确定了 miR_199a主要表达于肺脏和心脏，在心脏中主要表达于心肌细胞，在心肌成纤维细胞仅有微量表达。通过生物信息学靶点预测，本发明人确认了缺氧诱导因子1是时1 -1993的一个靶基因。过表达1^1 -1993可以降低包含!1正-10 3， 非翻译区的荧光素酶活性。在大鼠肥厚的心脏左室，miR-199a表达显著上调。在培养的心肌细胞中过表达miR-199a显著增加细胞表面积，相反，在培养的心肌细胞中抑制miR_199a的表达则降低细胞的表面积，另外，在苯肾上腺素诱发的肥大心肌细胞模型中抑制miR-199a的表达能够抑制细胞表面积。此外，miR-199a在心肌细胞的过表达能够抑制心肌收缩蛋白 myh6的表达，表明miR-199a的表达异常参与心肌收缩紊乱。此外，在血清剥夺的心肌细胞中miR-199a过表达能够抑制心肌损伤标志分子anp和serCa2的表达，表明在心肌缺血中 miR-199a具有保护作用。基于本发明人的上述新发现，本发明提供了一种miR-199a的用途，用于保护缺血心肌，其抑制物可用于防治心肌肥厚和慢性心衰的发生。MiR_199a抑制剂及其用途本发明人在深入研究后发现miR-199a的表达异常参与心肌收缩紊乱，能够抑制心肌收缩蛋白myh6的表达。MiR-199a的表达上调能够促进心肌细胞肥大。深入研究后发现，MiR-199a的抑制剂能够抑制心肌细胞肥大。因此，本发明还提供了 miR-199a抑制剂的用途，用于制备预防或治疗心脏疾病的组合物。所述的心脏疾病特别是心肌疾病，尤其是心肌肥厚或心衰。miR-199a的抑制剂包括了拮抗剂、下调剂、阻滞剂、阻断剂等。任何可降低 miR-199a的活性、降低miR_199a的稳定性、抑制miR_199a的表达、减少miR_199a的有效作用时间、或抑制miR-199a的转录和加工的物质均可用于本发明，作为可用于预防或治疗心脏疾病的有效物质。所述的miR-199a的抑制剂也可以是经过修饰的形式。在得知了 miR_199a对于心脏疾病的作用后，本领域人员可以方便地得知可以通过miR-199a抑制剂来防治心脏疾病的发生或发展。因此，任何miR-199a的抑制剂都可用于本发明，根据miR-199a的特性，本领域人员可以获得多种miR_199a的抑制剂。所述的miR-199a的抑制剂例如包括但不限于特异性结合miR_199a的蛋白；特异性干扰miR-199a基因表达、加工的小干扰分子，如siRNA分子、miRNA分子、反义核苷酸寸。所述的miR-199a的抑制剂优选为反义核苷酸，或是序列与其反义核苷酸的序列具有80%以上的相同性(较佳地具有85%以上的相同性)的反义核苷酸；它们均具有 miR-199a反义核苷酸相同的功能。所述的miR-199a的抑制剂可以是miR-199a的反义核苷酸。从理论上来讲，根据反义技术获得的反义分子可用于治疗任何由基因表达或者基因缺失引起的疾病。所述的“反义核苷酸”还包括经修饰的反义核苷酸，所述的修饰基本不改变反义核苷酸的活性，更佳地，所述修饰可提高反义核苷酸的活性、稳定性或治疗效果。对反义核苷酸的修饰包括但不限于甲氧基化修饰、锁核酸修饰、肽核酸修饰、硫代修饰、磷酸骨架由磷脂连接骨架代替。本发明对小干扰RNA的制备方法没有特别的限制，包括但不限于化学合成法，体外转录法等。应理解，本领域技术人员在得知了本发明所提供的反义核苷酸的序列以后，可以以各种途径方便地制备或表达所述的反义核苷酸。所述的反义核苷酸可通过采用适当的转染试剂被输送到细胞内，或还可采用本领域已知的多种技术被输送到细胞内。筛选方法在得知了所述的miR-199a与心脏疾病的相关性后，可以基于该特征来筛选调节 miR-199a的表达或活性，进而可预防或治疗心脏疾病的物质。因此，本发明提供一种筛选可用于预防或治疗心脏疾病的潜在物质的方法，所述的方法包括将候选物质与表达miR-199a的体系接触；和检测候选物质对miR_199a的影响；若所述候选物质可降低miR-199a的表达或活性，就表明该候选物是预防或治疗心脏疾病的潜在物质。所述的体系包括(但不限于)溶液体系、亚细胞体系、细胞体系、组织体系、 器官体系、或动物体系。药物组合物本发明还提供了一种药物组合物，所述的药物组合物含有有效量的所述的 miR-199a抑制剂，以及药学上可接受的载体。所述“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即有合理的效益/风险比的物质。所述“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所
接受的量。所述“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、PH缓冲物质等。本发明的miR-199a抑制剂的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。通常，当本发明的miR-199a抑制剂每天以约0. 001-100mg/kg(优选的为 0.01-20mg/kg)动物体重的剂量给予时，能得到令人满意的效果，较佳地每天以2-4次分开的剂量给予，或以缓释形式给药。对大部分大型哺乳动物而言，每天的总剂量约为 0.005-100mg，较佳地约为0.008-50mg。可调节此剂量方案以提供最佳治疗应答。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。任何适用的给药途径都是可以的，包括但不限于口服、静脉内注射、皮下注射、肌肉给予、局部给予、植入、缓释给予、心脏内给予等；优选的，所述给药方式是非肠道给予的。本发明的积极效果本发明提供了一种miR_199a的用途，用于保护缺血心肌，其抑制物可用于防治心肌肥厚和慢性心衰的发生，可通过改变miR-199a的基因表达来达到预防或治疗这些疾病的目的，miR-199a及其抑制剂在治疗相关疾病的药物中具有广阔的前景。

图1.定量PCR或Northern blot对心肌高丰度microRNAs的组织表达谱进行分析，以期获得心肌特异的microRNA，定量PCR结果如图IA所示miR_21、miR-23、miR-24、 miR-181、miR-199a、miR-214、miR-451 为组织广谱表达，而 miR-1、miR-133、miR-499 仅在肌组织表达，miR-126为组织广谱表达(图IB)；图2.腹主动脉缩窄(AAC)建立大鼠心肌肥厚模型A，假手术对照组(Sham)及 AAC大鼠心脏的H&E染色，标尺为2mm ；B,与对照组相比，肾上腹主动脉缩窄后大鼠的心重 /体重比明显升高；C，与对照组相比，肾上腹主动脉缩窄后大鼠心肌组织的中anp和myh7 的mRNA表达水平显著升高；D，心肌高丰度microRNAs在腹主动脉缩窄1周表达异常，与对照组相比，miR-1、miR-133和miR-499表达显著降低，而miR_199a表达显著升高，心肌高丰度microRNAs在腹主动脉缩窄4周表达异常，与对照组相比，miR_181a表达显著降低，而miR-214、miR-24、miR-21 表达显著升高；图3. MiR-199a和miR-214在心肌肥厚中表达升高A，miR_199a和miR-214基因定位于非编码RNA Dmn3os中，在人、小鼠、大鼠及斑马鱼物种间高度保守；B，在大鼠各器官中miR-199a主要表达心脏和肺脏，在心脏中，miR-199a主要表达于心肌细胞，在心肌成纤维细胞中表达较低；C，MiR-214在AAC 4周、8周、12周中的肥厚心肌中表达明显升高， miR-199a在心肌肥厚过程表达异常，在AAC12周时，表达升高最为明显；图4. MiR-199a过表达促进培养的心肌细胞肥大，使其表面积显著增加A，定量 PCR和Northern blot检测腺病毒转染后的心肌细胞中miR_199a的表达，miR-199a的表达量约上调10倍左右；B，miR-199a过表达后，心肌细胞出现了明显的肥大表型；随机选取 10个视野的200个细胞，对其表面积进行统计分析，表明miR-199a过表达能够显著促进基础水平的心肌细胞表面积增加；C，MiR-199a过表达抑制心肌收缩蛋白Myh6的表达；D， MiR-199a过表达抑制ANP、ATP2a2的表达；图5. miR-199a反义寡核苷酸沉默miR_199a，抑制培养的心肌细胞肥大A，定量 PCR和Northern blot检测反义寡核苷酸转染后的心肌细胞中miR_199a的表达，miR-199a 的表达量约下调至心肌细胞基础水平的左右；B，在培养的心肌细胞中，转染miR-199a 的As-RNA 48h后，心肌细胞表面积明显降低；C，在PE诱导心肌细胞肥大模型中，沉默 miR-199a抑制心肌细胞肥大；图6. Hifl α可能是miR_199a的靶基因A，miR_199a与缺氧诱导因子(Hifl α ) 和Sirtuinl的3'端非编码区序列匹配程度较好；B，Luciferase实验表明，miR_199a能够抑制融合Hifl α 3'端非编码区的报告基因的表达，但不能抑制融合Sirtuinl 3'端非编码区的报告基因的表达；C，Western blot结果表明miR_199a过表达不能抑制Sirtuin的
蛋白表达。
具体实施方式以下结合附图对本发明的技术方案做详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室指南(New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。I.材料和方法RNA 制备 人心脏总RNA购于Ambion，Inc.，小鼠、大鼠组织以及培养细胞的总RNA用 TRIzol(Invitrogen)抽提。实时荧光定量PCR常规方法抽提RNA，通过颈环结构的特异性引物反转录相应的microRNA，然后进行实时荧光定量PCR检测，以双标准曲线方法定量，分析各样本的microRNA浓度，并通过溶解曲线和琼脂糖凝胶电泳确定基因扩增的特异性。Northern blot 检测 miRNA
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总RNA经PAGE尿素变性胶电泳后转膜，行紫外交联，然后与同位素标记的特异性探针杂交过夜，洗膜后，-80°C条件下进行X胶片显影。以非编码RNA TO或5.8S RNA作为内参照分析mi croRNA的表达量。乳鼠心肌细胞培养和肥大模型取出生1-3天的SD乳鼠，无菌条件下取心室肌，胰蛋白酶消化后收集细胞、计数并接种。常规培养2天后，再以无血清培养24小时，然后给予ΙΟΟμΜ苯肾上腺素 (phenylephrine, ΡΕ)孵育48小时，诱导细胞肥大，观察细胞表型并进行microRNA、肥厚标志分子等检测。过表达microRNA的腺病毒载体的构建与转染将microRNA前体序列克隆入pAdTrack-CMV穿梭质粒(可表达绿色荧光蛋白)， 线性化后转化BJ5183感受态菌，获得重组质粒。重组质粒经酶切线性化后转染293细胞， 在293细胞中进行病毒包装，获得第一代腺病毒。按IOMoI滴度，多次转染293细胞，获得较高滴度的病毒液，经氯化铯密度梯度离心纯化。纯化后的病毒原液以10倍梯度稀释后， 转染293T细胞，荧光显微镜下计数呈绿色荧光的细胞百分数以确定病毒滴度。腺病毒以50MoI、IOOMoI滴度转染心肌细胞，荧光显微镜下计数绿色荧光细胞的百分数，以确定转染效率；通过定量PCR和Northern blot检测microRNA表达量以确定病毒的表达效率。 MicroRNA反义序列的设计及沉默效率分析Mirbase获得microRNAs成熟序列，设计其反义互补RNA，化学合成该序列，并进行碱基的2'甲氧修饰。将反义序列按照40nM浓度转染心肌细胞，孵育48小时，通过定量PCR 和Northern blot分析其对靶microRNA的沉默效率。生物信息学法预测microRNAs的靶基因利用TargetScan、Bibiserve、Pictar等microRNA靶基因预测网站和软件，对大鼠的microRNA的二级结构和靶基因进行预测分析，寻找序列匹配程度高、二级结构稳定、靶序列在物种间高度保守的基因进行后续验证。双荧光报告基因法检测microRNA的靶基因将靶基因的3’非编码区中能与microRNA相互作用的序列克隆至pGL3质粒中荧光素酶的3’非编码区，构建重组的荧光素酶报告基因质粒。将其与表达相应microRNA的 PSuper载体按一定的比例共转293T细胞。24小时后裂解细胞，采用双荧光报告基因检测系统检测荧光素酶的表达量，从而反映microRNA在离体体系中能否调控靶基因表达。大鼠心肌肥厚模型采用肾上腹主动脉缩窄方法建立大鼠心肌肥厚模型，具体操作如下成年健康SD 大鼠，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，无菌条件下开腹，分离腹主动脉，在右肾动脉上方沿腹主动脉用4号丝线将其与外径为0. 6mm的注射针管一并扎紧，后迅速将针管移去，缝合关腹，对照组不做丝线结扎，其它处理相同。术后继续饲养动物，定期处死动物并取心肌，通过 HE染色、肥厚标志分子检测、心重/体重比值等监测心肌肥厚发生情况。组织学分析取sham和AAC组大鼠心脏，用4%多聚甲醛固定过夜，石蜡包埋。石蜡切片(4 μ m) 后用苏木精&伊红染色(H&E)，观察分析。
细胞免疫荧光及细胞表面积分析4%多聚甲醛细胞固定15分钟后用0. Triton X-100通透15分钟，5%山羊血清室温封闭1小时，以1 500稀释度加入anti-α -actinin抗体(Sigma) 4°C孵育过夜。用 PBS洗三遍后加入Alexa-555 (Molecular Probes)标记的二抗，室温孵育1小时。细胞核用 4，，6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)标记，最后封片。细胞表面积用软件 AxioVision 4. 7. 1 (Carl Zeiss, Inc)进行计算。统计学分析数据以平均值士标准误表示。对于相对基因表达分析，对照组的平均值定义为 1。用非配对Student’ s t test进行数据统计分析。Sigma plot程序用于数据分析。P < 0. 05为显著差异。实施例l、miR-199a在心肌肥厚中表达升高，可能是心肌肥厚的一个检测指标MicroRNA，特别是心肌高丰度特异的microRNAs的表达异常，在心血管疾病的发生过程中发挥重要的功能。本课题组在前期工作中已确定多种心肌高丰度的microRNAs。本实验将通过定量PCR或Northern blot对这部分microRNAs的组织表达谱进行分析，以期获得心肌特异的 microRNA。结果如图 IA 所示miR-21、miR-23、miR-24、miR-181、miR-199a、 miR-214、miR-451为组织广谱表达，而miR-l、miR-133、miR-499仅在肌组织表达(图1B)。心肌组织中存在多种高丰度的microRNAs。本实验采用经典的肾上腹主动脉缩窄的方法，成功建立了大鼠心肌肥厚模型(图2)。大鼠在腹主动脉缩窄1周后，肾素-血管紧张素系统被激活，同时外周阻力增大，引起心脏的后负荷增加。为了维持正常的泵血功能，心脏开始出现代偿性的肥厚反应，表现为收缩蛋白合成增多，从而引起心脏重量增加， 因此通过对心重/体重比这一指标进行检测，将有助于我们了解整个模型的病理进程。本实验中，我们分别对腹主动脉缩窄后1周、4周、8周、12周的大鼠心重/体重比进行了统计分析，表明在腹主动脉缩窄1周后，腹主动脉缩窄(AAC)组的心重/体重比明显高于假手术(sham)组，并且随缩窄时间的延长，心重/体重比持续升高，在第8周时达到最高峰，但在12周时AAC组的心重/体重比仍高于sham组(图2B)。在心肌肥厚的过程中，许多胎儿期基因将重新表达，心房钠尿肽(ΑΝΡ)、β-重链肌球蛋白(β MHC)、内皮素-I(ET-I)分子表达水平可以间接反映心肌肥厚和损伤的程度。在本实验中，我们通过定量PCR检测这些分子标志物的mRNA表达水平，结果表明与sham组相比，ANP在腹主动脉缩窄1周时，即显著上调，并持续升高至4周，随着心脏代偿机制的激活，其表达量在4周后略有下降，但仍明显高于对照组；8周后，ANP的mRNA水平又持续升高至12周(图2C)。β MHC与ANP有类似的变化趋势，表现为双峰相1周时，表达急剧升高，后逐渐下降，但随心肌损伤的加剧，其表达在8周、12周又再次被激活(图2C)。ΑΝΡ、β MHC,ET-I这些分子的mRNA表达水平，表明心肌肥厚建立成功。肾上腹主动脉缩窄1周大鼠的心脏，纵切面和横断面H-E染色，结果表明-MC组与sham组相比，大鼠心脏左心室壁已明显增厚，左心室变小，表明心肌肥厚模型建立成功。腹主动脉缩窄1周时，肥厚心肌microRNAs表达异常，其中miR-l、miR-133和 miR-499表达显著降低，而miR-199a表达显著升高，最为明显。腹主动脉缩窄4周时，肥厚心肌 microRNAs 表达异常，其中 miR_23a、miR-133、miR-145、miR-199a 和 miR-499 表达未发生改变，miR-181a表达显著降低，而miR-21、miR-24和miR-214表达显著升高(图2D)。Northern blot结果表明，miR_199a主要表达于心脏和肺脏(图3B)。为了进一步分析miR-199a在心脏各个细胞类型的表达谱，本发明人分离了大鼠心脏的心肌细胞和成纤维细胞，并检测了 miR-199a的表达水平。通过Northern blot方法，miR_199a主要在心肌细胞检测到，而在成纤维细胞表达量较低(图3B)。因此本发明人的结果表明，miR-199a 主要表达于心肌细胞。前一工作中，我们通过定量PCR对腹主动脉缩窄1周、4周大鼠的肥厚心肌进行 microRNAs表达检测，发现miR-199a和miR-214表达异常最为明显；我们将进一步探讨这2 种microRNAs在整个心肌肥厚病理进程中的异常表达，探索其可能的病理意义。结果表明 miR-199a在前期表达显著升高，在12周时间点上，表达升高最为明显，提示了在心肌肥厚的病理进程中，miR-199a可能主要在心肌由代偿期向失代偿期过渡中起作用；miR-214的表达量在AAC 1周时没有变化，4周时表达开始升高达sham组的1. 5倍，12周的表达量较 sham组升高1倍左右，提示miR-214可能在心肌肥厚的发生过程起重要功能(图3C)。实施例2、过表达miR-199a可诱导的心肌细胞肥大。MiR-199a过表达腺病毒以IOOMoI的量转染培养的心肌细胞48h后(图4A)，行免疫荧光染色，结果如图4B所示miR-199a过表达后，心肌细胞出现了明显的肥大表型；随机选取10个视野的200个细胞，对其表面积进行统计分析，表明miR-199a过表达能够显著促进基础水平的心肌细胞表面积增加。实施例3、MiR-199a沉默抑制培养的心肌细胞肥大。前一部分实验结果表明，miR_199a过表达能够显著促进基础水平的心肌细胞肥大。为更好的探讨miR-199a的内源性功能，本工作通过心肌细胞转染2’甲氧修饰的 miR-199a的反义RNA，进而沉默内源性的miR_199a。通过定量PCR和Northern blot检测表明miR-199a的As-RNA能够显著抑制内源性的miR_199a的水平(图5A)。在培养的心肌细胞中，转染miR-199a的As-RNA 48h后，细胞免疫荧光染色，结果表明与对照组相比， 心肌细胞的肥大表型受到明显抑制；随机选取10个视野的200个细胞，对其表面积进行统计分析，表明miR-199a沉默后能够显著抑制基础水平的心肌细胞肥大(图5B)。为了进一步探讨miR-199a能否抑制PE诱发的心肌细胞肥大，本实验将在PE诱导的肥大心肌细胞中进一步沉默miR-199a，观察其对肥大心肌细胞的影响。结果如图5C所示miR-199a沉默后抑制心肌细胞肥大，随机选取10个视野的200个细胞，对其表面积进行统计分析，表明miR-199a过表达抑制PE诱导条件下心肌细胞表面积增加。实施例4、MiR-199a过表达引起心肌细胞收缩蛋白的表达异常。重链肌球蛋白的异构体转变是心肌肥厚中肌纤维发生的一个显著性改变。我们通过定量PCR对这两种肌收缩蛋白进行mRNA表达检测，结果如图4C所示miR-199a过表达能够明显抑制myh6的mRNA表达水平，而对myh7的mRNA表达水平的影响无统计学差异。实施例5、MiR-199a降低心肌损伤的生物标志分子的表达。通过前期对细胞进行形态学观察，我们发现miR-199a能够明显的改善心肌细胞的生长状态，同时鉴于miR-199a在AAC 12周时表达升高最为明显，我们推测其可能在心力衰竭的发生过程中起重要作用。为此我们通过定量PCR检测心肌损伤的生物标志分子 ANP、ATP2a2的mRNA表达水平，结果如图4D所示ANP、ATP2a2的mRNA表达均下调，暗示了 miR-199a在基础水平有可能具有改善心肌细胞的功能。实施例6、MiR-199a作用靶基因的寻找及验证。
通过生物信息学分析，发现Ddrl、MAP3kll、SIRTl、Hifl α、、JUNB, Gsk3 β、 Arhgapl2、均可能是miR-199a的潜在靶基因(表1)。表1. miR-199a靶基因的生物信息学预测
权利要求
1.miR-199a及其类似物在制备治疗心肌缺血损伤药物中的应用，所述类似物是指能够生成类似于miR-199a序列的重组质粒或病毒载体或者是化学合成的类似miR-199a的序列；所述 miR-199a 序列为CCCAGUGUUCAGACUACCUGUUC。
2.miR-199a抑制剂在制备治疗抑制心肌细胞肥大及慢性心衰药物中的应用，所述 miR-199a抑制剂是指能够生成类似于miR-199a反义互补序列的重组质粒或病毒载体或者是化学合成的类似miR-199a反义序列的RNA或DNA ；所述 miR-199a 反义互补序列为GAACAGGTAGTCTGAACACTGGG。
3.一种筛选预防或治疗心脏疾病的潜在物质的方法，其特征在于，包括如下步骤(1)用候选物质处理表达miR-199a的体系；(2)检测所述体系中miR-199a的表达或活性；若所述候选物质可增强或降低miR-199a的表达或活性，则表明该候选物质是预防或治疗心脏疾病的潜在物质。
全文摘要
本发明公开了miR-199a及其类似物在制备治疗心肌缺血损伤药物中的应用，以及miR-199a抑制剂在制备治疗抑制心肌细胞肥大及慢性心衰药物中的应用，并且在此基础上，公开了一种筛选预防或治疗心脏疾病的潜在物质的方法，包括如下步骤(1)用候选物质处理表达miR-199a的体系；(2)检测所述体系中miR-199a的表达或活性；若所述候选物质可增强或降低miR-199a的表达或活性，则表明该候选物质是预防或治疗心脏疾病的潜在物质。
文档编号A61K48/00GK102266569SQ20101019305
公开日2011年12月7日 申请日期2010年6月4日 优先权日2010年6月4日
发明者宋晓伟, 李青, 秦永文, 荆清, 袁文俊 申请人:中国人民解放军第二军医大学