专利名称：增效蛋白在原核生物中的表达及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及在原核生物中表达粉纹夜蛾颗粒体病毒增效蛋白C末端截短蛋白，含有粉纹夜蛾颗粒体病毒增效蛋白C末端截短蛋白基因的质粒，用这种重组质粒在原核生物中产生粉纹夜蛾颗粒体病毒增效蛋白C末端截短蛋白的方法，以及表达的昆虫病毒增效蛋白C末端截短蛋白在农林业中的应用。
现在已知，昆虫病毒增效蛋白(enhancin)是由昆虫病毒基因编码能显著提高病毒杀虫活性的一种功能性蛋白质。1998年，美国学者(Zhong，J.and R.R.Grandos1998.VIIth International Colloguium on Invertebrate Pathology and Microbial ControlIVth Internatiol Conference on Bacillus thuringensis.Ausgust 23-2865)已将粉纹夜蛾颗粒体病毒(Trichoplusia ni granulosis virus简称TnGV)增效蛋白基因克隆于核型多角体病毒AcNPV，构建了重组病毒工程毒株，并用该毒株与野生型病毒混合使用，可显著提高Tn的杀虫效果。然而，这种工程病毒受到其宿主范围及其毒力的影响，因此在应用上有着局限。
本发明的目的是提供一种新型的含有粉纹夜蛾颗粒体病毒增效蛋白C末端截短蛋白基因的工程菌株，该菌株的构建方法、用途以及用该茵株生产增效蛋白的方法。
为实现上述目的，本发明所采取的技术方案如下一种工程菌株，E.coli M15(pQE-TnGVEnNp85)，该菌株含有携带粉纹夜蛾颗粒体病毒增效蛋白C末端截短蛋白基因的重组质粒pQE-TnGVEnNp85，这种菌种命名为E.coli M15(pQE-TnGVEnNp85)，已于2000年5月17日保藏于湖北省武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心，登记入册号为CCTCC M200010，所含重组质粒pQE-TnGVEnNp85由下列DNA元件组成(1)粉纹夜蛾颗粒体病毒增效蛋白C末端截短蛋白基因；(2)大肠杆菌质粒复制起始点；(3)氨苄青霉素抗性基因；卡那霉素抗性基因；(4)六个连续组氨酸编码区；本发明用于构造工程菌株的原始材料有如下几种(1)粉纹夜蛾颗粒体病毒(TnGV)，由美国汤姆·杰弗逊大学赠送。
(2)受体大肠杆菌E.coli M15菌株，购自QIA-GEN公司。
(3)pQE载体，购自Promega公司。
用来表达颗粒体病毒增效蛋白的重组质粒通过基因工程方法获得，其构建方法是采用碱裂解酚提取法提取TnGV DNA，并经HindIII消化用作模板，设计引物为P15’GAC TCT GCA GTA CAA AGT GAT 3’，P25’CGT GAA GCT TAA CTC GTTTTC 3’，由上海生工公司合成。
反应条件模板DNA煮沸3min，迅速冷却至0℃；反应混合物94℃变性60S，50退火120S，73℃延伸180S，循环30次；终循环于73℃延伸7min。
用Pst I/HindIII双酶切消化，得到截短的约2.1Kb片段，与pQE质粒上用相同酶消化的切口，用T4 DNA连接酶连接，构建pQE-TnGVNp85表达质粒，将其转化至大肠杆菌E.coli M15菌株，经筛选得到含TnGVC末端截短基因的工程菌株。该工程菌株定名为E.coli M15 pQE-TnGVNp85，已保藏于中国武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心，登记号为CCTCC M200010。
将重组获得的携带粉纹夜蛾颗粒体病毒增效蛋白C末端截短蛋白的工程菌株CCTCC M200010单菌落挑到内含100μg/ml的Amp(氨苄青霉素)和25μg/ml Kan(卡那霉素)的LB培养基中(25ml)，37℃，200rpm/min过夜培养，以1∶20比例接种到含上述双抗500ml LB培养基中继续培养，当其浓度达到OD600＝0.7-0.9时，加入IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)到终浓度1mM，于37℃，200rpm诱导表达5hr，收获菌液，4000rpm离心10min，收集菌体沉淀，再按常规方法即可获得TnGV病毒增效蛋白C末端截短蛋白。
利用携带粉纹夜蛾颗粒体病毒增效蛋白C末端截短蛋白基因的大肠杆菌发酵生产的增效蛋白可作为有效成份提高病毒杀虫剂，BT杀虫剂，阿维菌素等生物杀虫剂的杀虫效果或单独以乳剂方式用于转基因抗虫棉。
本发明提供了一种增效蛋白工程菌株Ecoll M15(pQE-TnGVNp85)，该菌株的用途和构建方法，以及由此工程菌株生产粉纹夜蛾颗粒体病毒增效蛋白。该菌株含有TnGV增效蛋白全长基因，能在原核生物中复制，从而获得增效蛋白，可作为有效成份提高病毒杀虫剂，BT杀虫剂，阿维菌素等生物杀虫剂的杀虫效果，可使害虫死率明显提高，半数致死时间也明显减少。这种昆虫病毒增效蛋白也可单独以乳剂方式用于转基因抗虫棉。
图1为构建本发明的重组质粒pQE-TnGVNp85示意图。
以下结合附图和具体的实施方案对本发明的技术方案作进一步的说明，这些实施方案无意于以任何方式限制本发明权利要求所要求的范围。(一)En-TnGV基因的PCR扩增1.TnGV-DNA的提取取TnGV悬液100μL，加等体积0.04mol/L NaOH碱解液及终浓度为1％的SDS，56℃水浴处理10分钟，待悬液半透明后，用碱性酚，酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1V∶V)混合液，氯仿∶异戊醇(24∶1V∶V)混合液抽提TnGV-DNA各一次，无水乙醇沉淀DNA，-20℃放置过夜，离心后用75％乙醇洗涤DNA沉淀，自然干燥，将DNA溶于TE(Tris·HCl 10mM，EDTA 1mM pH8.0)缓冲液，于4℃保存。
2.En-TnGV基因的PCR扩增取TnGV-DNA 10uL，作10倍稀释，取2μl，100℃煮6min立即冰浴，按B.M.公司Taq DNA Polymerase试剂(从栖热水生菌YT-1中提纯得到的耐热的DNA多聚酶)操作手册，并参见Sambrook等在“分子克隆”(实验室手册，冷泉港，1989)的方法，加入(1)10×PCR反应缓冲液10μl，(2)两引物各2μl，(3)10mmol/L dNTPs(脱氧核苷三磷酸)2μl，(4)Taq DNA polymerase(5U/μl)1μl，(5)补去离子水至100μl反应体积，(6)加石蜡油覆盖液面，进行PCR扩增。反应条件93.5℃变性60s，50℃退火90s，72.5℃延伸180s，循环30次，最后一次循环在72.5℃延伸7min，经电泳检测，得到单一的长约2.9kb的En-TnGV基因全长DNA片段。
(二)En-TnGV基因PCR产物的回收低熔点琼脂糖回收PCR扩增的En-TnGV基因。用低熔点琼脂糖制备0.7％的凝胶，将DNA样品与加样缓冲液(溴酚蓝0.25％，蔗糖40％)混合，加入点样孔，电泳结束后，在长波(256nm)紫外灯确定并切下2.1DNA带，放入1.5ml离心管中，加入约5倍体积的20mmol/L Tris·Cl(三氨基甲的盐酸盐溶液)-1mmol/LEDTA(乙二胺四乙酸)(pH8.0)至琼脂糖块中，65℃温育至凝胶块熔化，加入等体积碱性酚，颠倒数次混匀后，8,000rpm离心10min，水相用酚∶氯仿∶异戊醇，氯仿∶异戊醇，氯仿∶异戊醇各抽提一次，再加入1/10体积3mol/L NaAc(pH5.2)及2倍体积无水乙醇，混匀后-20℃过夜，次日离心，弃上清，用75％乙醇洗涤DNA沉淀，室温干燥后溶于适量TE缓冲液中，-20℃保存。
(三)Dot blot验证En-TnGV基因(1)En-TnGV基因探针的制备按DIG标记及检测试剂盒操作手册，加1μgEn-TnGV基因PCR产物，补加灭菌双蒸水至16μl，100℃煮沸10min，快速在冰NaCl冰浴，加4μl DIG-Hiigh Prime(地高辛标记引物)，混匀，37℃放置1-20hr，最后65℃加热10min终止反应。
(2)去除未结合的DIG-dUTP(地高辛标记的脱氧尿苷三磷酸)在上步处理样品中，加无水冷乙醇(-20℃)80μl，混匀，-20℃放置2hr，12,000rpm离心15min，去上清，加50μl 75％乙醇洗沉淀，自然干燥，加50μl TE缓冲液溶解探针DNA。
(3)预杂交将TnGV-DNA基因组1μl，点在硝酸纤维素膜上，室温干燥后，在变性液(1.5mol/L NaCl-0.5mol/L NaOH)中处理5min，水中漂洗2min，复性液[1mol/L Tris·Cl(7.4)1.5mol/L NaCl]中处理5min，2×SSC液中漂洗2min，室温晾干，80℃烘膜2hr备用，与探针DNA杂交。将干膜于5×SSC浸湿后，放到杂交袋中，按0.2ml/cm2的量加杂交液，封口并不留气泡，68℃水浴2hr。
(4)DNA杂交将标记好的探针DNA在沸水煮10min后，冰浴，加入杂交液(5×SSC1.5％Blocking reagent0.1％N-Laurol-sarco-sine0.02％SDS)中，混匀，剪开杂交袋，倒出杂交液，注入新的杂交液，重新封口并不留气泡在袋内，68℃保温8-24hr。
(5)显色从袋中取出膜，用洗涤液I(2×SSC 0.1％SDS)洗10min后，重复3次→再用洗涤液II(0.1×SSC 0.1％SDS)洗15min，重复2次→在bufl(0.1M马来酸0.15MnaCl pH7.5)中洗5min→在buf2(含1.5％Blocking reagent的bufl)中轻摇30min→在buf2*，27℃，轻摇30min→用bufl洗15min，重复2次→在buf3中洗2min，放入20ml新配buf4，避光放置1-8hr，观察结果，若出现合适的点就用TE缓冲液50ml冲洗5min。
(四)质粒DNA的制备及DNA的限制性内切酶消化使用常规技术(参见Sambrook等在“分子克隆”的方法，实验窒手册，冷泉港，1989)培养细菌并分离质粒DNA(1)细菌的生长和质粒的扩增从平板上挑取单菌落接种到含有氨共青霉素和卡那霉素抗生素的LB培养基中，37℃，200rpm培养过夜，至培养物OD600达到0.6以上。
(2)快速提取质粒DNA将培养物移至离心管中，8,000rpm离心5min弃上清，收集菌体，每5ml菌液的菌体加1ml STE(0.1MnaCl，10mM Tris·Cl pH8.0，1mMEDTA pH8.0)重悬，8,000rpm离心5min，弃上清，将沉淀重悬于200μl冷溶液I(50mM葡萄糖，25mM Tris·Cl pH8.0，10mMEDTA pH8.0)，加入400μl新鲜配制的溶液II
，缓慢颠倒数次置冰浴几分钟，另入300μl冷溶液III(5M醋酸钾60ml，冰乙酸11.5ml加蒸馏水至100ml)，倒置管温和地振荡10秒钟混匀内容物，置冰上5min，12,000rpm离心5min，吸取上清至另一干净离心管，加等体积酚∶氯仿∶异戊醇充分混匀，12,000rpm离心2min，吸取水相至另一干净离心管，加2倍体积的无水冷乙醇，混匀后室温放置15min，12,000rpm离心10min，倒尽上清，用75％乙醇洗涤沉淀，12,000rpm离心5min后倒出乙醇，管倒置于纸巾上，使残余乙醇挥发，加入50μl TE缓冲液溶解核酸沉淀。加入RNase A至终浓度20μg/ml，37℃放置1hr，以琼脂糖凝胶电泳鉴定无RNA带后加入等体积酚∶氯仿∶异戊醇抽提，吸水相至另一干净离心管，加入1/10体积3mol/L NaAc(pH5.2)，再加入2倍体积无水乙醇，混匀后置-20℃，1小时左右后，12,000rpm离心10min，核酸沉淀用75％乙醇洗涤，自然干燥后加TE缓冲液20uL，置-20℃保存。
(五)En-TnGV基因DNA片段的克隆1.En-TnGV基因PCR产物的磷酸化按Promega公司的T4噬菌体多核苷酸激酶操作手册并参见Sambrook等在“分子克隆”，实验室手册，(冷泉港，1989，)在灭菌的0.5ml离心管中(1)加入En-TnGV基因PCR产物1μg，(2)激酶10×缓冲液4μl，(3)0.1mM的ATP2μl(4)T4多核苷酸激酶10U，(5)补加去离子水至40μl，37℃水浴30min，加入2μl 0.5M EDTA终止反应。加40μl苯酚∶氯仿∶异戊醇振荡1min，8,000rpm离心2min，再用氯仿∶异戊醇抽提1次，转移上清水相至一干净离心管，加入1/10体积3M乙酸钠，2倍体积无水乙醇，混匀，置于-20℃过夜，12,000rpm离心20min，弃上清，自然干燥，重悬DNA于20uL TE缓冲液。
2.连接En-TnGV基因PCR产物到pQE质粒按Promega公司的pGEM-T载体操作手册并参见Sambrook等在“分子克隆”，实验窒手册，(冷泉港，1989)，在已灭菌干净的0.5ml离心管中，加入(1)10×T4 DNA连接酶缓冲液1μl，(2)50ng/μl的pQE载体，1μl，(3)约50ng的上述处理样品DNA，(4)3 Weiss units/μl T4 DNA连接酶1μl，(5)补加去离子水至10μl，混匀后置4℃连接过夜。
3.大肠杆菌M15菌株感受态细胞的制备和转化从37℃培养16-20hr的新鲜LB平板中挑取E.coli M15单菌落，置3mlLB液体培养基试管中，37℃，200rpm培养过夜，再将菌液按1∶100比例接种于适量LB培养基中，37℃剧烈振荡培养约3hr(OD600＝0.3-0.4)，将菌液转入1.5ml无菌离心管，置冰上10min，待培养物预冷至0℃时，4,000rpm离心10min，收集菌体，倒出培养液以0.5ml冰冷的0.1mol/L CaCl2重悬细胞，置冰上半小时后，4,000rpm离心10min，倒出上清，加入100μl冰冷0.1mol/L CaCl2重悬细胞。所制成感受态细胞置4℃，并在12～24hr内使用。
在100μl E.coli M15菌株感受态细胞中加入8uL待转化的连接产物DNA(DNA≤50ng)，轻旋以混匀内容物，置冰上30min，于42℃水浴中热休克90s后，迅速移至冰浴中，待细胞冷却1-2min后，每管加入900μl SOC培养液(蛋白胨20g，酵母粉5g，NaCl0.5g，250mMKCl 10ml，5MnaOH调pH值至7.0，15磅20分钟高压灭菌。临用前加入5ml已灭菌的2MMgCl2，20ml已灭菌的1M葡萄糖溶液)，置37℃，150rpm温育45min，将转化细胞涂布至含100μg/ml氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养12-16小时后观察转化结果。
(六)重组质粒pQE-TnGVNp85的筛选(1)显色平板在Amp+平板上涂布30μl X-gal(5-溴-4-氯-3吲哚-β-硫代半乳糖，X-gal20mg/ml溶于二甲基甲酰胺中)和10μl IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷100mg/ml)，待平板表面液体被完全吸收后，涂布转化后的细菌悬液，37℃放置约1hr，使平板吸收完菌液，再倒置培养12-16小时，白色菌落为阳性，蓝色菌落为阴性。
(2)重组质粒pQE-TnGVNp85的酶切鉴定将小量提取的重组质粒pQE-TnGVNp85用限制性内切酶EcoR I.HindIII和PstI和单酶切消化，用0.7％琼脂糖凝胶电泳，经EB染色后观察，通过与分子量比较DNA片段大小的方法进一步鉴定。
(七)SDS-PAGE电泳分析表达质粒中外源基因的表达1.凝胶的灌制参照参见Sambrook等在“分子克隆”(实验室手册，冷泉港，1989)的方法，配制8％的分离胶溶液15ml，依次混合各成分后加入催化剂TEMED(N，N，N’，N’四甲基乙二胺)，立即混匀并灌胶，封一层0.1％SDS覆盖液面，37℃下聚合30min。聚合完全后排净凝胶上的液体，以同样方法灌浓缩胶，插入梳子，避免产生气泡。
2.蛋白质样品的制备挑含待表达质粒的细菌M15[pREP4]单菌落在100μg/ml Amp，25μg/ml Kan的LB培养基中37℃过夜活化，然后以1∶20稀释接种到含100μg/ml Amp，25μg/ml Kan的LB培养基中继续培养，当其浓度达到OD600＝0.7～0.9时，取出未经诱导的细菌对照。加入IPTG至终浓度1mM，于42℃，200rpm培养30min后，降至37℃继续摇床培养5hr后收获细菌，4,000rpm离心10min，收集菌体沉淀，加入适量去离子水重悬菌体，置-20℃保存备用。
3.上样及电泳在样品中加等体积2×SDS凝胶加样缓冲液，于100℃加热3-5min变性，按顺序加样，最后在所有不用的加样孔中加上等体积的加样缓冲液，以100V电泳至溴酚兰进入分离胶，提高电压至150V，当溴酚兰到达底部前约1cm处结束电泳(约需4hr)。
4.固定，染色和脱色剥胶后以5倍体积染液固定并染色过夜(至少4小时以上)，将凝胶浸泡于脱色液中平缓摇动4hr以上，其间更换脱色液3次，脱色完全后即可进行观察和照相。
(八)纯化表达质粒中目的基因表达产物1.目的基因的表达挑含待表达质粒的细菌M15[pREP4]单菌落在100μg/ml的Amp和25μg/mlKan的25ml LB培养基中37℃，200rpm过夜活化，然后以1∶20比例接种到含100μg/ml Amp和25μg/ml LB培养基中继续培养，当其浓度达到OD600＝0.7-0.9时，加入IPTG至终浓度1mM，于42℃，200rpm诱导表达30min后，降至37℃，继续培养5hr，收获菌液，4,000rpm离心10min，收集菌体沉淀，保存于-20℃备用。
2.确定目的基因表达产物的形式在细菌沉淀中加入2-5倍体积的声波处理液，反复冻融3次，置于冰中用超声波破碎细菌。置于光学显微镜高倍物镜观察，有大量晶体，然后置于电子显微镜下观察，进一步确定目的基因表达产物以包涵体形式存在。
3.不溶性蛋白的变性纯化把上述处理后的表达产物经30％-60％蔗糖梯度离心，取出包涵体带，洗糖三次，8,000rpm离心10min收集沉淀。每克沉淀重悬于5ml BufferB(8M尿素，0.1M磷酸钠，0.01M Tris·Cl，pH8.0)，在室温中搅拌沉淀1hr，10,000rpm离心15min，收集上清，加入8ml 50％Ni-NTA树脂(已在Buffer B中预平衡)，在室温中搅45min，然后小心加到直径为1.6柱中，用120ml Buffer B冲洗，至流液A280＜0.01，再用Buffer C(8M尿素，0.1M磷酸钠，0.01M Tris·Cl，pH6.3)冲洗至A280＜0.01，然后用10-20ml Buffer D(8M尿素，0.1M磷酸钠，0.01M Tris·Cl，pH5.9)洗脱重组蛋白质，最后用10-20ml Buffer E(8M尿素，0.1M磷酸钠，0.01M Tris·Cl，pH4.5)洗脱，每3ml收集一管洗脱液，进行SDS-PAGE电泳分析。
(九)表达产物的生物活性测定1.TnGVNp85对HaNPV的增效活性HaNPV终浓度为1×104PIBs/ml(多角体)，pQE-TnGVNp85终浓度为1.6×106PIBs/ml(包涵体)，28℃下棉铃虫3龄幼虫单头饲于6孔Costar细胞培养器中每孔加适量人工饲料，并加25μl处理液于人工饲料表面，使之充分吸收，幼虫取食48小时后补加足量新鲜人工饲料，记载死亡和存活虫数。
2.pQE-TnGVNp85对Bt的增效活性Bt1∶200，取50μl初步纯化的TnGVNp85包涵体，加150μl50mmol/LNa2CO3/HCl(pH9.5)，28℃碱解1小时；另取少量未碱解的TnGVNp85作平衡稀释计数，使处理中TnGVNp85终浓度相当于1.3×106Obs/ml；在Bt对照中补加等量的Na2CO3/HCl溶液，26℃下将棉铃虫2龄幼虫单头饲于24孔养虫器中，每虫加24μl处理液。72小时后统计死亡虫数。
(十)增效蛋白与各种生物杀生剂混合使用的实施例1.对病毒增效实施例将蔗糖梯度离心纯化的包涵体进行稀释[来源于E.coli M15(pQE-TnGVNp85)]，AcMNPV终浓度1×103PIBs/ml(多角体)，Np85终浓度1×104OBs/ml(包涵体)，28℃下将银纹夜蛾3龄幼虫单头饲养于6孔Costar细胞培养皿中，皿孔加适量人工饲料，并加入25μl上述各种处理液于人工饲料表面，使其充分吸收，幼虫食48小时后外加足量新鲜的人工饲料，统计死亡和存活虫数(结果见表)。
表1 Np85对AcMNPV感染银纹夜蛾3龄幼虫的增效活性
结果表明，实验组的LT50比对照组减少3天，较正死亡率提高39.6％2.对Bt增效实施例将Bt菌粉(16000IU/mg)作1∶1000，1∶2000，1∶4000倍比稀释成三个不同浓度，人工饲料添食感染2龄棉铃虫幼虫，每个稀释度30头，2个重复，同时设立正常对照。根据统计结果，求得Bt对2龄棉铃虫幼虫，致死中浓度为LC50为0.652g/L取致死中浓度Bt稀释液与1×104OBs/ml Np85复配，人工饲料添食感染2龄棉铃虫幼虫，每个稀释度30头，2个重复，同时设立单独Bt对照，结果，试验组比对照组提高Bt对棉铃虫幼虫死亡率为33.1％.
3.对阿维菌素实施例将阿维菌素(1.8％乳油)作1∶3000，1∶6000，1∶12000倍比稀释成三个不同浓度，人工饲料添食喂养4龄棉铃虫幼虫，每个稀释度30头，2个重复，同时设立正常对照，根据统计结果，求得阿维菌素(1.8％乳油)对老龄棉铃虫幼虫致死中浓度LD50为1∶5800，取致死中浓度阿维菌素稀释液与1×104OBs/ml Np85复配，人工饲料添食喂养4龄棉铃虫幼虫，每个稀释度30头，2个重复，同时设立单独阿维菌素对照，结果，试验组比对照组提高阿维菌素对棉铃虫老龄幼虫死亡率为27.2％。
权利要求
1.一种工程菌株E.ColiM15(pQE-TnGVNp85)，该工程菌株已提交到中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏编号为CCTCC M200010。
2.根据权利要求1所述的工程菌株，其特征在于这种菌株含粉纹夜蛾颗粒体病毒增效蛋白C末端截短蛋白基因，并能在原核生物细胞中复制。
3.根据权利要求1所述的工程菌株，其特征在于它所含的重组表达载体是由下列DNA元件构成(1).粉纹夜蛾昆虫病毒增效蛋白C末端截短蛋白基因；(2).大肠杆菌质粒复制起始点；(3).氨苄青霉素抗性基因；(4)六个连续组氨酸编码区。
4.一种构建权利要求1-3所述的工程菌株的方法，其特征在于以TnGV基因组DNA作模板，设计引物P15’GAC TCT GCA GTA CAA AGT GAT 3’P25’CGT GAA GCT TAA CTC GTT TTC 3’，用Pst I/HindIII双酶切消化，得到截短的～2.1Kb片段，与pQE质粒上用相同酶消化的切口连接，构建pQE-TnGVNp85表达质粒，将其转化至大肠杆菌E.coliM15菌株，经筛选得到含粉纹夜蛾颗粒体病毒增效蛋白C末端截短蛋白基因的工程菌株。
5.一种用权利要求1-3所述的工程菌株生产粉纹夜蛾颗粒体病毒增效蛋白的方法，其特征在于将重组获得的携带粉纹夜蛾颗粒体病毒增效蛋白C末端截短蛋白的工程菌株CCTCC M200010单菌落挑到内含100μg/ml的氨苄青霉素和25μg/ml卡那霉素的LB培养基中，37℃，200rpm/min过夜培养，以1∶20比例接种到含上述双抗500mlLB培养基中继续培养，当其浓度达到OD600＝0.7-0.9时，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷至终浓度1mM，于37℃，200rpm诱导表达5hr，收获菌液，4000rpm离心10min，收集菌体沉淀，再按常规方法即可获得昆虫病毒增效蛋白质C末端截短蛋白。
6.权利要求1-3所述的工程菌株与昆虫病毒、苏芸金芽胞杆菌、阿维菌素或其它生物杀虫剂制备成复合生物杀虫剂在农林业用于病虫的生物防治，或单独使用增效工程蛋白用于转基因抗虫棉防治棉铃虫。
全文摘要
本发明公开了一种通过基因工程手段构建工程菌株:CTCC M200010 E.Coli M15 (pQE－TnGVNp85)、工程菌株的构建方法和工程菌株的用途。该菌株是以粉纹夜蛾颗粒体病毒(TnGV)为模板,PCR法产生TnGV增效蛋白基因,并构建含TnGV增效蛋白的C末端截短基因的表达载体,转化E.Coli M15菌株所得。它携带粉纹夜蛾颗粒体病毒增效蛋白全基因,并能够在原核生物中表达,从而获得粉纹夜蛾颗粒体病毒增效蛋白。
文档编号C12N15/70GK1331286SQ0011466
公开日2002年1月16日 申请日期2000年6月30日 优先权日2000年6月30日
发明者孟小林, 徐进平 申请人:武汉大学