生物相关物质微阵列及其制备方法

专利名称：生物相关物质微阵列及其制备方法
技术领域：
本发明涉及其上固定有作为探针的生物相关物质的微阵列，以及制备该微阵列的方法。所述微阵列可以用于临床检测和食品检测等领域。
目前公开了制备这些DNA微阵列的几种方法，其中一种方法是将DNA区室化并固定于玻璃基片上，另一种方法是在硅基片上在分隔开的区域内采用生产半导体芯片的照相平板印刷技术一个接一个地合成核酸(美国专利US 5,445,934；US 5,774,305)。
此外，还披露了如下获得DNA微阵列的方法，其中将DNA固定在由玻璃或高分子构成的线性体上，使这些线性体和粘合剂一起形成卷起的片状，然后沿着这些纤维的横断面方面切片(日本专利申请JP11-108928)；另一种公开的获得DNA微阵列的方法是，将其上固定有如DNA等物质的多个纤维聚集成束，然后沿着与该纤维纵向相交叉的方向将纤维束切成DNA微阵列(日本专利公开(未审查的申请)JP2000-245461)；再一种公开的获得DNA微阵列的方法是，在一树脂块中制成多个通孔，然后使这些通孔都携带上如DNA等物质，然后将该树脂块切成片(日本专利公开文本(未审查的申请)JP2000-78998)。由于这些制备方法允许通过重复切片制成多个微阵列，因此这些方法对于大规模生产具有同样序列的芯片而言是尤其优选的方法。
例如，一般来说，上述DNA微阵列对分析物中特定DNA的检测是通过如下方式进行的用荧光对固定在芯片上的DNA探针或分析物DNA进行标记，探针或分析物通过诸如杂交等操作形成杂合物，然后用来自于外部光源的荧光激发光照射已经形成杂合物的探针或分析物，然而检测激发这些荧光分子所产生的荧光。
然而，当检测在分析物中以痕量存在的生物相关物质如DNA时，由探针或分析物之外的物质所发出的荧光，特别是如带有探针的基片等物质的自身荧光(self-fluorescence)，将作为噪声被检测出来。因此，就存在这样一个问题，即可能检测不到以痕量存在的生物相关物质。
另外，通过重复切片生产多个微阵列的方法在大规模生产具有同样排列的微阵列方面具有优势。但是，目前存在一个问题，即微阵列会发生弯曲。
发明详述本发明涉及提供一种微阵列，其能够减少探针或分析物之外的物质所发出的噪声荧光，由此使得可以检测出痕量成分。此外，本发明涉及提供通过重复切片制备多个微阵列的方法，该方法制备微阵列的效率高而且所制备的微阵列不存在如弯曲之类的缺陷。
本发明的发明人为了解决上述问题进行了周密的研究，结果发现，通过在构成微阵列的材料中加入能够减少自身荧光的物质即能够检测出痕量分析物。此外，本发明的发明人发现，在制备微阵列的方法中，通过在构成微阵列的材料中加入能够减少自身荧光的物质将能够有效地制备出不具有如弯曲之类缺陷的微阵列。
也就是说，本发明包括以下方面1.微阵列，其可通过将含有多个线性体或通孔的块沿着与上述线性体或通孔的纵向相交叉的方向切成片得到，其中上述线性体或通孔带有生物相关物质，而且上述线性体和/或块含有能够减少其自身荧光的物质。
2.制备微阵列的方法，包括在块中形成多个通孔，其中该块含有能够减少该块的自身荧光的物质，使上述通孔携带生物相关物质，沿着与上述通孔的纵向相交叉的方向将该块切成片。
3.制备微阵列的方法，包括用树脂固定带有生物相关物质的一束线性体以制备块，其中该树脂包含能够减少自身荧光的物质，然后，沿着与上述线性体纵向相交叉的方向将该块切成片。
4.制备微阵列的方法，包括用树脂固定一束线性体以制备块，其中该树脂包含能够减少自身荧光的物质，然后，在使所有的线性体都带上生物相关物质后，沿着与上述线性体纵向相交叉的方向将该块切成片。
5.上述3或4的方法，其中线性体包含能够减少自身荧光的物质。
在上述微阵列以及制备上述微阵列的方法中，线性体的例子包括纤维，如中空纤维，块的例子包括含有树脂的块。此外，减少自身荧光的物质包括吸收剂(如，无机颜料)和/或淬灭剂。
无机颜料优选为炭黑，其含量例如按质量计为0.5％至10％。
下面将对本发明作详细地阐述。申请号为2000-184393的日本专利申请的说明书和/或附图的内容构成本申请优先权的基础，将其并入本文。
在本发明中，生物相关物质的例子是选自下述(1)至(3)的物质(1)核酸，氨基酸，糖或脂；(2)包含至少一类上述(1)中的物质的聚合物；
(3)与上述(1)或(2)中的物质相互作用的物质。
例如，当核酸作为生物相关物质时，可以通过已知方法从细胞中制备DNA或RNA。例如，可以根据Blin等(Nucleic Acids Res.3，2303，1976)的方法提取DNA，可以根据Favaloro等(Methods.Enzymol.65，718，1980)的方法提取RNA。此外，还可以使用线性或环状质粒DNA或染色体DNA。对于DNA，可以使用通过化学方法或限制性酶裂解得到的DNA片段、体外通过如酶等方法合成的DNA或者化学合成的寡核苷酸等。
在本发明中，块由线性体或通孔和除这些线性体或通孔之外的块体构成。也就是说，块可以由块体和其中所携带的线性体构成，或者，块可以由块体和其中所形成的通孔构成。
对于用作块体的材料，可以使用已知的树脂组合物，如聚酰胺类，聚酯类，丙烯类，聚氨基甲酸酯类，酚类，氟类树脂组合物。
在本发明中，线性体或通孔为携带生物相关物质提供了空间。这些线性体或通孔的结构基本上呈线性，各线性体或通孔基本上按相互平行的方式排列。线性体或通孔的横断面可以是任何形状。横断面最优选的形状为圆形。通常，排列多个线性体或通孔。
对线性体或通孔的排列密度并没有特别的限制。如果要在一次分析中获得大量的数据，则线性体或通孔的优选排列密度为一个微阵列上100-1,000,000个/cm2。此外，线性体的优选排列方式为相邻线性体之间具有相同大小的间隔。
线性体可以由例如实心纤维，多孔纤维，金属丝，中空纤维，多孔中空纤维，或玻璃管等构成。此外，当将多个细的线性体聚集成束后，这些线性体可发生缠绕以致整个形成一个线性体。
每个独立的线性体或通孔可以携带有不同种类的生物相关物质。或者，多个线性体或通孔可以携带同一种类的生物相关物质。
在本发明中，线性体或块包含能够减少该线性体和/或块发出的自身荧光的物质。这种物质包括一种，例如，吸收自身荧光的物质(吸收剂)和使自身荧光去激发(de-excitation)的物质(淬灭剂)。
吸收剂包括，例如，有机和无机颜料。具体地，黑色颜料包括炭黑，乙炔黑，铁黑；黄色颜料包括铬黄，锌黄，赭石，汉撒黄，永固黄，苯并黄；橙色颜料包括橘红，钼橙以及苯并橙；红色颜料，包括氧化铁红，镉红，锑朱，永久红，立索红，色淀红，亮猩红以及硫靛红；蓝色颜料包括佛青，钴蓝，铜酞菁蓝和靛青；绿色颜料包括铬绿，萘酚绿，铜酞菁绿。
具体地，由吸收剂引起的自身荧光强度的减弱取决于荧光光波与位于线性体和/或块体中的吸收剂之间发生碰撞的次数和频率，还取决于荧光的波长。因此，为了使吸收剂的效果达到最大，优选使用颗粒尽可能小的吸收剂并且使这些吸收剂分布均匀。尤其优选的吸收剂为炭黑。
对于吸收剂，应选择那些可以减少自身荧光、同时在检测时不干扰待测荧光物质所发出的荧光的吸收剂。例如，当检测与异硫氰酸荧光素(FITC)结合的物质时，应选用黄色和绿色颜料之外的颜料。
当例如在双荧光检测方法中使用多种荧光标记时，优选选择吸收较宽范围的可见光的吸收剂。例如，黑色颜料。
淬灭剂的例子包括顺磁离子，如Fe(III)、Ni(II)、Cr(III)、Cu(II)以及Ti(I)。其它例子包括不带有电荷的分子，如丙烯酰胺等等。
对于上述的吸收剂和/或淬灭剂，通常要么使用吸收剂，要么使用淬灭剂。但是，也可以同时使用这两种物质。
另外，在本发明中，可以根据要求对一些或全部的线性体进行染色。通过对一些或全部的线性体进行染色，在检测分析物时，染色的线性体可以用作平行标准。
根据本发明，微阵列的厚度优选为5mm或更低(例如，50μm至5mm)，更优选为1mm或更低(如，100μm至1mm)。
使用上述材料制备微阵列的方法的例子描述如下通过物理或化学的方法将生物相关物质携带在线性体的外表面，或线性体中空部分的内壁上，或线性体的多孔部分中。另外，可以通过物理或化学的方法将生物相关物质携带在通孔的中空部分中或其内壁上。适当地选择携带生物相关物质的方法、需携带的生物相关物质的种类、以及线性体或通孔的材料和形状。例如，通过将线性体浸泡在含有生物相关物质的溶液中，然后对其进行烘烤或紫外线照射，从而可使该线性体携带该生物相关物质。此外，如果该线性体为中空纤维，可以通过如下方法使该纤维携带生物相关物质，该方法包括用适宜的包被剂(例如，聚L-赖氨酸)处理纤维中空部分的内壁，然后将生物相关物质引入该中空部分；或在中空部分填入含有生物相关物质的高分子聚合物，如丙烯酸类聚合物(acrylide polymer)或琼脂糖。
将线性体束固定于块体中的方法包括，例如，涉及如下步骤的方法将多个线性体平行排列并固定于一薄片上，如粘附片，然后将该薄片卷成螺旋形，并在其缝隙处倒入树脂等物；另一种固定线性体束的方法是，将2个打有多个孔的板重叠起来，将线性体穿过这些有孔板上的每个孔，然后使两个有孔板拉开一定的距离，将树脂等物倒入该间隔中。
在块体中形成多个通孔的方法包括涉及如下步骤的方法，即制备由树脂等构成的块体，然后使用钻孔机或激光等在该块体中形成通孔；另一种方法涉及，制备包含多个金属丝的块，然后将金属丝从该块中抽出，从而形成通孔。
将减少自身荧光的物质并入线性体的方法包括，例如，当将纤维用作线性体时，预先将吸收剂和/或淬灭剂混合在纤维的原材料中，然后抽制成纤维从而使吸收剂和/或淬灭剂分布并结合在纤维中。
此外，将减少自身荧光的物质并入块体中的方法包括，例如在形成块体的过程中掺入吸收剂和/或淬灭剂。
可以将上述获得的含有多个线性体或通孔的块沿与线性体或通孔纵向相交叉的方向切成片以制备微阵列，其中所述的线性体或通孔携带有生物相关物质。对切割的角度没有特别的限制，但是为了在检测分析物时充分利用厚的部分中携带的生物相关物质，优选垂直于线性体或通孔的纵向将块切成片。
根据本发明的制备方法，在线性体和/或块中加入能减少自身荧光的物质将在切片的时侯具有有益的效果，所述物质优选为无机颜料，更优选为炭黑。
例如，由于树脂中含有分布均匀的炭黑而炭黑可充当假交联点，故这种树脂要比在同等硬化条件下硬化的树脂更硬。因此，就有可能控制树脂的变形、包含在树脂中的线性体的变形、以及切片时微阵列的弯曲。由于微阵列厚度越薄，上述效果就越显著，因此，本发明方法适合于制备厚度为1mm或更低，优选500μm或更低(100至500μm)的微阵列。
此外，在使用炭黑时，可降低线性体和/或块的粘性并进一步可以减少静电。因此，当重复切割块时，可以防止微阵列之间发生粘附。此外，在制备微阵列以及进行检测时，可以防止吸附飘浮在空气中的灰尘、生物体或孢子。
当炭黑分散在线性体中时，该线性体呈黑色。因此，由于线性体聚集成束时可见度提高，线性体的排列会变得简单。
此外，当线性体的中空部分或通孔通过凝胶携带生物相关物质时，由于加入无机颜料使线性体的内壁表面或块体面朝通孔的表面粗糙化，故可以提高凝胶的粘附性。由此，在切片时，可以防止凝胶从微阵列上脱落。
为了获得诸如上述的效果，优选将无机颜料完全分散在整个线性体和/或块中。此外，为了彻底减少来自于线性体和/或块的自身荧光，优选加入大量的无机颜料，而为了在线性体和/或块中进行充分的分散，优选加入少量的无机颜料。如果颜料是炭黑，则相对于线性体和/或块，优选加入的炭黑的质量百分比为0.5％-10％。
实施例1将两条长度为10cm，直径为2mm的钢丝平行排列，然后制备树脂块以便将上述钢丝包含在里面。树脂使用聚氨基甲酸酯树脂粘合剂(Nippon聚氨基甲酸酯工业有限公司，nippolan4276，coronate4403)。首先，相对于nippolan4276/coronate4403的总重量(nippolan4276与coronate4403的配制比例为62/38)，在nippolan4276中分别加入质量百分比为0.5％，1.0％或2.5％的炭黑(MA-100，Mitsubishi化学公司生产)，用匀化器分散3小时；然后，加入coronate4403，使该混合物在室温下硬化约1周。制备成2cm×2cm×7cm分散有炭黑的、含有钢丝的聚氨基甲酸酯块；然后将钢丝抽出，则在该块中形成两个长度为7cm的通孔。
沿着与通孔纵向相垂直的方向用切片机将所获得的块切成片，得到10个厚度约为500μm的薄片。所有的薄片均没有发生弯曲，炭黑也完全分散在该块内。
从所获得的薄片中任意选出3个薄片，用Nikon荧光显微镜E600/Hamamatsu Photonicks冷却的C488-37 CCD照相机进行观察。使用Cy3滤光器(入射光侧535±25nm，检测光侧610±75nm)通过曝光30秒，检测薄片的荧光强度。测量后，计算3个薄片的荧光强度的平均值。结果见表1。
表1

实施例2(1)制备中空纤维阵列将两块分别具有49个孔的穿孔板(水平地和垂直地，7×7)重叠在一起，每个孔的直径为0.32mm，轴间距为0.42mm。将49个中空的聚乙烯中空纤维(外径0.3mm，内径0.2mm)穿过两块板上的每个洞。然后，使两块板间的间隔达到50mm，使纤维处于伸直状态并将它们的两端固定。如实施例1，加入相对于聚氨基甲酸酯树脂粘合剂总重而言质量百分比为2.5％的炭黑并混合。将该树脂原料倒入，使其围绕中空的纤维阵列，然后使树脂硬化。接着将这两块板移开，则形成了含有中空纤维的树脂块。
(2) 制备荧光标记的具有甲基丙烯酸酯基团的寡核苷酸使用PE生物系统自动DNA/RNA合成仪(型号394)合成寡核苷酸。合成序列为GCAT的寡核苷酸并在合成DNA的最后一步中将Cy3引入5’端，得到Cy3-GCAT。然后用常规方法对它们进行去保护及纯化。
为了制备具有甲基丙烯酸酯基团的荧光颜料，将50μl获得的Cy3-GCAT(500nmol/ml)，5μl甲基丙烯酸缩水甘油酯，以及5μl二甲基甲酰胺(DMF)混合，使其在70℃下反应2小时。加入190μl水后，就得到了具有甲基丙烯酸酯基团的100nmol/ml荧光颜料(GMA修饰的Cy3-GCAT)。
(3)制备纤维阵列以及带有其中固定有核酸的凝胶的薄片根据以下相对质量比例通过混合制备单体溶液以及引发剂溶液。
(a)单体溶液丙烯酰胺 0.76份亚甲基双丙烯酰胺 0.04份水 4.2份(b)引发剂溶液2，2’-氮杂二(2-脒基丙烷)二盐酸盐 0.01份水 4.99份根据上述(2)所制备的GMA修饰的Cy3-GCAT与单体溶液(a)和起始剂溶液(b)混合，得到如表2所示的浓度。(聚合物溶液1-5)使(1)中所得到的树脂块中的中空纤维的中空部分充满所得到的聚合物溶液。将该块转移至水蒸气饱和的密封玻璃容器中，在80℃下放置4小时进行聚合反应。
表2

聚合反应完成以后，沿着与中空纤维纵向相垂直的方向，重复用切片机将块切成片，得到30个厚度约为750μm的薄片。获得的所有薄片均没有发生弯曲。此外，炭黑完全分布在整个块中。
随机从所得到的薄片中选取3个薄片。用Nikon荧光显微镜E600/Hamamatsu Hotnicks冷却的C488-37 CCD照相机进行观察。用类似于实施例1中的滤光器测量微阵列的荧光强度。然后计算3个薄片的荧光强度的平均值。其结果为，可以检查到0.005nmol/l的Cy3。比较实施例1除了没有混合炭黑外，采用类似于实施例2的方法制备薄片。测定所得到的薄片的荧光强度。其结果是，当Cy3浓度为0.005nmol/L时，检测是不可能的，当Cy3浓度高达0.05nmol/L时，检测也是不可能的。表3

N.T.＝没有检测相对荧光强度是通过将实施例2中聚合物溶液5的荧光强度以及比较实施例中聚合物溶液3的荧光强度定义为1来计算的。实施例3如实施例2制备树脂块，但其中不使用中空的聚乙烯纤维，而使用中空的聚甲基丙烯酸甲酯纤维(PMMA)(外径0.3mm，内径0.2mm)，该纤维中含有1.6份质量的炭黑。10天后，根据JIS K 7215，在该树脂块上施加表面压力，5秒后测定该树脂块的硬度。测定结果是，硬度为95。将该块切成薄片，得到30个薄片。所有的薄片均没有弯曲。比较实施例2在如实施例3制备树脂块时，没有在中空纤维和树脂中加入炭黑。10天后，根据JIS K 7215，测定树脂的硬度，其为72。将该树脂块切成厚度为500μm的薄片，所得到的每个薄片均有有弯曲。(见

图1)本发明中所引用的所有公开专利以及专利申请都全部结合在本发明中作为参考。
工业实用性本发明提供微阵列以及制备这种微阵列的方法。通过在线性体和/或块中加入减少自身荧光的物质，可以显著地降低检测时的本底以及干扰，从而提高了检测的灵敏度。此外，通过在线性体和/或块中加入减少自身荧光的物质，可以在制备微阵列时，在切片过程中稳定地产生没有弯曲的微阵列。
权利要求
1.微阵列，其可以通过将包含多个线性体或通孔的块沿着与该线性体或通孔纵向相交叉的方向切成片而得到，其中所述线性体和/或通孔带有生物相关物质，并且线性体和/或块中含有能减少其自身荧光的物质。
2.如权利要求1所述的微阵列，其中线性体为纤维。
3.如权利要求2所述的微阵列，其中纤维为中空纤维。
4.如权利要求1-3中任一所述的微阵列，其中块由树脂组成。
5.如权利要求1-4中任一所述的微阵列，其中能减少自身荧光的物质为吸收剂和/或淬灭剂。
6.如权利要求5所述的微阵列，其中吸收剂为无机颜料。
7.如权利要求6所述的微阵列，其中无机颜料是炭黑。
8.如权利要求7所述的微阵列，其中炭黑含量为0.5-10％质量。
9.制备微阵列的方法，其包括，在块中形成多个通孔，其中所述块含有能够减少该块的自身荧光的物质，使上述通孔携带生物相关物质，然后沿着与所述通孔纵向相交叉的方向将所述块切成薄片。
10.制备微阵列的方法，其包括，用树脂将一束携带有生物相关物质的线性体固定从而制备成块，其中所述树脂含有能够减少自身荧光的物质，然后沿着与所述线性体纵向相交叉的方向将所述块切成薄片。
11.制备微阵列的方法，其包括，用树脂将一束线性体固定从而制备成块，其中所述树脂含有能够减少自身荧光的物质，使上述每个线性体携带生物相关物质，然后沿着与所述线性体纵向相交叉的方向将所述块切成薄片。
12.如权利要求10或11所述的方法，其中线性体中含有能减少自身荧光的物质。
13.如权利要求9-12中任一所述的制备方法，其中线性体为纤维。
14.如权利要求13所述的制备方法，其中纤维为中空纤维。
15.如权利要求9-14中任一所述的制备方法，其中能减少自身荧光的物质为吸收剂和/或淬灭剂。
16.如权利要求15所述的制备方法，其中吸收剂为无机颜料。
17.如权利要求16所述的制备方法，其中无机颜料是炭黑。
18.如权利要求17所述的制备方法，其中炭黑含量为0.5-10％质量。
全文摘要
本发明涉及微阵列，其可通过将包含多个线性体或通孔的块沿着与该线性体或通孔纵向相交叉的方向切成片而得到，其中所述线性体或通孔带有生物相关物质，并且线性体和/或块中含有能减少其自身荧光的物质。
文档编号C07B61/00GK1443308SQ01813041
公开日2003年9月17日 申请日期2001年6月20日 优先权日2000年6月20日
发明者高桥厚, 秋田隆, 伊藤千穗, 宫内阳子, 村瀬圭 申请人:三菱丽阳株式会社